2

BỘ KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ BỘ QUỐC PHÒNG

DANH MỤC CÁC BẢNG 11
MỞ ĐẦU 12
Luận cứ, cách tiếp cận để đạt được mục tiêu 20
NỘI DUNG KHOA HỌC ĐÃ THỰC HIỆN 22
PHẦN I: 22CƠ SỞ LÝ THUYẾT
1. Đặc điểm sinh học của màng ối người Việt Nam liên quan đến việc lựa
chọn và phân lập tế bào gốc.
22
2. Phân lập, nuôi cấy và bảo quản các tế bào gốc màng ối 27
3. Biệt hóa tế bào gốc màng ối người thành tế bào biểu bì và tế bào be ta tụy
đảo.
36
4. Xây dựng qui trình sản xuất tấm tế bào gốc màng ối 40
5. Đánh giá hiệu quả sử dụng tấm tế bào gốc màng ối trong điều trị vết
thương, vết bỏng trên động vật thực nghiệm
45
6. Xây dựng tiêu chuẩn cơ sở đánh giá sản phẩm sinh học tấm tế bào gốc
màng ối:
49
PHẦN II : 51ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
1. Đặc điểm sinh học của màng ối người Việt Nam liên quan đến việc lựa
chọn và phân lập tế bào gốc.
51
2. Phân lập, nuôi cấy và bảo quản các tế bào gốc màng ối 51
3. Biệt hóa tế bào gốc màng ối người thành tế bào biểu bì và tế bào be ta tụy
đảo.
56
4. Xây dựng qui trình sản xuất tấm tế bào gốc màng ối 57
4.1. Chuẩn bị các tấm màng ối đông khô 58
4.2. Sản xuất tấm tế bào gốc màng ối 59

3.1.3. Kết quả western blot 87
3.2. Kết quả biệt hóa tế bào gốc màng ối thành tế bào beta 88
3.2.1. Biểu hiện của OCT-4 - dấu ấn của tế bào gốc. 90
3.2.2. Biểu hiện của Insulin - Dấu ấn tế bào gốc biệt hóa thành tế bào beta.92
5

4. Xây dựng qui trình sản xuất tấm tế bào gốc màng ối 95
4.1. Kết quả thu nhận màng ối tươi 95
4.2. Kết quả xử lý đông khô tấm màng ối 96
4.3. Kết quả thu được tấm màng ối đông khô sau xử lý bằng tia phóng xạ .97
4.4. Kết quả kiểm tra cấu trúc của màng ối đông khô 98
4.5. Lựa chọn giá đỡ phù hợp để nuôi cấy tế bào gốc màng ối. 100
4.6. Đánh giá khả năng tồn tại và phát triển của tế bào gốc trên giá đỡ bằng
hình thái, số lượng tế bào.
101
5. Đánh giá hiệu quả sử dụng tấm tế bào gốc màng ối trong điều trị vết
thương, vết bỏng trên động vật thực nghiệm
102
5.1. Diễn biến lâm sàng thỏ thực nghiệm và vết thương được ghép tấm tế bào
gốc màng ối.
102
5.1.1. Diễn biến toàn thân 103
5.1.2. Thay đổi một số chỉ số máu ngoại vi của thỏ bị bỏng trong quá trình
điều trị.
104
5.2. Diễn biến tấm tế bào gốc màng ối trên vết thương, đánh giá khả năng
tồn tại của tấm tế bào gốc màng ối.
107
5.2.1. Tình trạng vết bỏng những ngày đầu sau bỏng 107
5.2.2. Tổn thương tại chỗ vết bỏng ngày thứ 3 đến ngày thứ 7 109

KIẾN NGHỊ 137
TÀI LIỆU THAM KHẢO TIẾNG ANH… ……………………….135
TÀI LIỆU THAM KHẢO TIẾNG VIỆT 149
7

BẢNG CHỮ VIẾT TẮT AFP Alpha Feto Proteine
BMP Bone Morphogenetic Protein
CK Cytokeratin
DMEM Dulbecco’s Modified Eagle’s medium
DMSO Dimethyl sulfoxide
FBS Fetal Bovine Serum: Huyết thanh bào thai bê
GAPDH Glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase
HAE Human Amniotic Epithelial Cells
HAM Human Amniotic Mesenchymal Stem Cells
HLA Human Leukocyte Antigen
HNF-4 Hepatocyte Nuclear Factor -4
ICAM Intercellular Adhesion Molecule-1, CD54
MO Màng ối

Hình 2.2. Quy trình phân lập tế bào gốc từ màng ối 56
Hình 2.3. Hệ thống máy làm đông khô các màng sinh học 58
Hình 2.4. Sơ đồ hệ thống xử lý màng ối đông khô bằng phóng xạ 59
Hình 3.1: Cấu trúc màng ối trên tiêu bản nhuộm HE. 70
Hình 3.2: Nhuộm hóa mô miễn dịch màng ối 73
Hình 3.3. Hình ảnh tế bào chụp trực tiếp trên đĩa nuôi cấy qua kính hiển
vi đối pha
76
Hình 3.4. Khả năng tăng sinh của tế bào gốc màng ối 77
Hình 3.5. Xác định đặc tính của tế bào gốc màng ối bằng kỹ thuật hóa
miễn dịch huỳnh quang.
80
Hình 3.6. Nhuộm Trypan blue xác định tỷ lệ tế bào sống 82
Hình 3.7. Hình ảnh tế bào gốc sau 24 giờ nuôi cấy 84
Hình 3.8. Hình ảnh nhuộm hóa miễn dịch OCT-4, vimentin, CK-14,
CK-19.
85
Hình 3.9: Biểu hiện ARNtt của CK-14 và CK-19. 86
Hình 3.10. Kết quả Western blot OCT-4 và CK-14. 87
Hình 3.11. Hình ảnh tế bào gốc màng ối người sau 7 ngày nuôi cấy 92
Hình 3.12: Biểu hiện ARNtt và protein của Insulin. 93
Hình 3.13. Màng ối tươi được tách từ bánh rau 96
9

Hình 3.14. Các tấm màng ối thu được sau khi xử lý qua hệ thống làm
đông khô.
97
Hình 3.15. Cấu trúc mô học của tấm màng ối 99
Hình 3.16. Hình ảnh tế bào gốc nuôi cấy trên tấm màng ối đông khô
được “làm ướt”.

117
Hình 3.29. Vết bỏng được rửa bằng NMSL quan sát ở ngày thứ 28 sau
bỏng.
118
10

Hình 3.30. Tốc độ thu hẹp diện tích vết bỏng ngày thứ 28 sau bỏng. 119
Hình 3.31. Tổn thương vi thể vết bỏng ở vùng rìa tổn thương, ngày thứ
3 sau bỏng
122
Hình 3.32. Tổn thương vi thể vết bỏng ở vùng rìa tổn thương, ngày thứ
7 sau bỏng
124
Hình 3.33. Hình ảnh mô học tại chỗ tổn thương bỏng ngày thứ 14 sau
bỏng
127
Hình 3.34. Hình ảnh mô học mô gan và mô thận 130


trị
128
Bảng 3.10. Tỷ lệ nhiễm các loại vi khuẩn tại vết bỏng thỏ ngày thứ 14 sau
điều trị
128
12

MỞ ĐẦU

Tế bào gốc là tế bào nền móng của tất cả các tế bào, mô và cơ quan
trong cơ thể, đây là những tế bào chưa biệt hoá nhưng có khả năng trở thành
các tế bào chuyên biệt và có chức năng mới tương ứng [1]. Dựa vào nguồn
gốc, các tế bào gốc được phân chia thành 4 loại đó là: Tế bào gốc phôi
(Embryonic stem cells) và tế bào mầm phôi (Embryonic germ cells), tế bào
gốc thai (Foetal stem cells), tế bào gốc trưở
ng thành (Adult stem
cells/Somatic stem cells) [2]. Dựa vào đặc tính hay mức độ biệt hoá, tế
bào gốc được chia thành : Tế bào gốc toàn năng hay tế bào gốc thủy tổ
(totipotent stem cells), tế bào gốc vạn năng (pluripotent stem cells), tế bào
gốc đa năng (multipotent stem cells), tế bào gốc đơn năng
(mono/unipotential progenitor cells) [3].
Do tế bào gốc có khả năng biệt hóa thành các tế bào chức năng khác
nhau nên đã mở ra triển vọng dùng tế bào gốc để tái tạo lại các mô, nghiên
cứu phát triển thu

2. Mục tiêu cụ thể
2.1. Xây dựng qui trình phân lập, nuôi cấy và bảo quản tế bào gốc từ
màng ối người.
2.2. Nghiên cứu biệt hóa tế bào gốc màng ối người thành tế bào biểu bì
và tế bào beta tụy đảo.
2.3. Xây dựng quy trình k
ỹ thuật chế tạo một số chế phẩm sinh học từ
màng ối người: tế bào gốc màng ối và tấm tế bào gốc màng ối.
2.4. Nghiên cứu điều trị trên động vật thực nghiệm và đánh giá hiệu quả
của chế phẩm sinh học từ tế bào gốc màng ối trong điều trị bỏng da.
Tình hình nghiên cứu và ứng dụng tế bào gốc màng ối hiệ
n nay trên
thế giới:
Gần đây, bổ sung các phương thức trị liệu hiện nay như điều trị nội
khoa, phẫu thuật, ghép tạng và các phương tiện hỗ trợ cơ học thì y học tái tạo
14

đang được tập trung vào những thay thế tiềm năng đối với ghép các mô/tạng
phức tạp. Y học tái tạo là một lĩnh vực mới dựa trên sử dụng các tế bào gốc
để thay thế các mô và cơ quan bị tổn thương.
Các tế bào gốc màng ối đã được ứng dụng để điều trị hàng loạt bệnh lý
ở các cơ quan khác nhau như nhồi máu cơ tim, Parkinson [12-14]… Các
nghiên cứu m
ới đây trên mô hình động vật và một số thử nghiệm lâm sàng
cho thấy có thể dùng tế bào gốc màng ối để tái tạo lại mô cơ bị tổn thương
[12-14] . Các nghiên cứu theo hướng này dựa vào tính “uyển chuyển”
(plasticity) của tế bào gốc màng ối và mở ra triển vọng mới ứng dụng tế bào
gốc màng ối trong điều trị.
Cấy ghép mô cần cung cấp một số lượng lớn mô ng
ười trưởng thành.

như một tấm liên tục với màng protein và bám dính nguyên vẹn protein khi
nhiệt độ giảm xuống. Kỹ thuật mới về tạo tấm tế bào sẽ hữu ích trong kỹ
thuật mô cũng như trong cấy ghép tế bào.
Biệt hóa tế bào gốc màng ối thành tế bào tuyến tụy (Pancreatic β-
cells)
Đối với việc điều trị bệnh tiểu đường typ I hay cấy ghép tụ
y có thể kiểm
soát đường máu và tiến tới ngăn chặn biến chứng. Tuy nhiên, luôn bị giới
hạn bởi không đủ nguyên liệu dùng cho cấy ghép. Theo hướng khác, các tế
bào tuyến tụy được tạo ra bằng biệt hóa các tế bào gốc phôi thai. Các tế bào
ES chuột có thể biệt hóa thành tế bào sản xuất insulin, nhưng không thành tế
bào tuyến tụy trưởng thành. Kết quả của quá trình biệt hóa từ tế bào ES
thành tế bào sản xuất insulin là vi
ệc tăng biểu hiện của các dấu ấn TGF β2,
PDX-1 hoặc insulin [22, 23].
Để biệt hóa tế bào HAE thành tế bào sản xuất insulin môi trường nuôi
cấy được bổ sung nicotinamide 10 mM trong vòng 4 tuần. Khi kích thích với
nicotinamide, tế bào HAE biểu hiện ARNtt insulin in vitro, và ở mức độ in
vivo, nồng độ đường trong máu giảm về mức bình thường trên chuột gây
tiểu đường thực nghiệm bằng streptozotocin [24].
Biệt hóa tế bào gốc màng ối thành tế bào biểu bì da (keratinocytes)
16

Da động vật có vú là một tổ chức đặc biệt bao gồm những quần thể tế
bào gốc biểu bì. Chúng có khả năng tăng sinh mạnh trước khi biệt hóa thành
nhiều loại tế bào khác của biểu bì đồng thời luôn tồn tại một nhóm tế bào có
khả năng tăng sinh trên màng đáy.
Rất nhiều các sản phẩm da nhân tạo được ứng dụng trong điều trị vết
thương, vết bỏng nhưng nó vẫn không được đưa vào sử dụng thường quy vì
giá thành cao, hiệu quả điều trị thấp và đặc biệt không chứa các thành phần

chuột, cũng nh
ư các tế bào gốc phôi chuột [34, 35]. Ở người, tế bào gốc phôi
thai, các tế bào nguồn gốc tủy xương, và các tế bào máu dây rốn đã được thể
hiện là nguồn cho có thể cấy ghép [12]. Tuy nhiên, khả năng biệt hóa của các
tế bào gốc tủy xương thành tế bào gan thấp nên việc ứng dụng có nhiều hạn
chế.
Các tế bào HAE biểu hiện albumin, α1-antitrypsin (α1-AT), cytokeratin
18, phosphoenolpyruvate cacboxykinaza và đặc biệt là cytochrome P450.
Sau khi nuôi cấy HAE, tế
bào bắt đầu xuất hiện α-fetoprotein (α-FP),
transthyretin, tyrosine aminotransferase (TAT) và CYP-450 [12]. Ngoài ra,
albumin và glycogen được phát hiện bằng hóa miễn dịch ở hầu hết các tế bào
HAE nuôi cấy cũng phù hợp với các nghiên trước cho rằng sản xuất
albumin cũng đã được quan sát thấy trong một nửa các tế bào màng ối chuột.
Điều đó chứng tỏ rằng có thể dùng tế bào gốc màng ối để tái sinh gan.
Biệt hóa tế bào gốc màng ố
i thành tế bào sụn (Chondrocytes)
Cũng đã có nhiều công trình mô tả, phân tích tế bào gốc màng ối
HAM và tiềm năng cho việc sửa chữa sụn [36-43]. Tế bào HAM liên quan
đến gen, bao gồm Sox-9, Sox-5, Sox-6, protein bone morphogenetic (BMP) -
2 và -4, cũng như thụ thể BMP. Trong thí nghiệm in vitro, collagen loại II và
aggrecan được biểu hiện sau khi cho chất cảm ứng của chondrogenesis với
BMP-2. ở invitro, các tế bào HAM được cấy vào sụn mô của chuột với
BMP-2 hoặc cấy ghép với giá đỡ collagen vào vị trí bị khuyế
t tật, tạo ra
xương của chuột dựa vào thay đổi hình thái với sự lắng đọng của collagen
18

loại II. Những kết quả này cho thấy, tế bào HAM có tiềm năng biệt hóa
thành tế bào sụn trong in vitro và in vivo, có tiềm năng điều trị cho bệnh về

19

trị liệu tế bào trong điều trị vết thương, vết bỏng, các tấm da nuôi cấy đã
được chế tạp và sự dụng trong điều trị đạt kết quả tốt. Viện bỏng quốc gia
hiện nay đã nuôi cấy thành công nguyên bào sợi và tế bào biểu bì để điều trị
vết thương, vết bỏng.
Bên cạnh các nghiên cứu ứng dụng tế bào gố
c tạo máu được triển khai
ở các cơ sở nêu trên, các nghiên cứu tế bào gốc phôi chuột nhắt và tế bào gốc
phôi gà cũng đã được tiến hành tại hai trường Đại học khoa học tự nhiên
thuộc Đại học Quốc gia Hà nội và Thành phố Hồ Chí Minh. Một dự án
nghiên cứu tế bào gốc phôi người và tế bào gốc từ người trưởng thành cũng
đã được thông qua và bắt đầu triển khai tại Trườ
ng Đại học y Hà Nội và các
đơn vị phối hợp. Tuy nhiên các dự án và nghiên cứu kể trên chưa đề cập đến
việc lập ngân hàng bảo quản lâu dài và sử dụng tế bào gốc màng ối.
Ở nước ta, ước tính hàng năm riêng nhu cầu điều trị bệnh máu bằng
ghép tế bào gốc cũng đã khoảng 300 - 500 trường hợp. Nhu cầu điều trị các
khuyết hổng mô và suy chức năng tế
bào/cơ quan rất lớn mà triển vọng có
thể áp dụng trị liệu tế bào gốc càng là con số lớn hơn. Tuy nhiên, lĩnh vực
này vẫn còn biểu hiện nhiều hạn chế. Đó là nguồn tế bào gốc còn hạn chế
(mới chỉ dừng lại từ dây rốn, tủy xương) đặc biệt là các nghiên cứu áp dụng
tế bào gốc biệt hóa thành các dòng tế bào áp dụng điều trị còn ch
ưa đạt hiệu
quả cao. Thêm nữa, các hướng nghiên cứu về tế bào gốc ở trong nước còn
chưa đa dạng, chưa quan tâm nhiều đến những hướng tạo sinh tế bào gốc từ
nguồn các tế bào khác.
Ngày 4 tháng 6 năm 2009, Học viện quân y và đại học Toyama – Nhật
bản đã ký kết văn bản thỏa thuận hợp tác nghiên cứu ứng dụng tế bào gốc

từ phía Nhật trong lĩnh vực phân lập, bảo quản, nuôi cấy tăng sinh cũng như
hiệu quả điều trị của tấm tế bào gốc màng ối. Vấn đề then chốt quyết định sự
thành công của đề tài là chúng tôi đã hoàn toàn làm chủ được từng giai đoạn
của quy trình công nghệ đặc biệt giai đoạn nghiên cứu cơ bản thuộc các
chuyên ngành y học cơ
sở. Dựa trên điều kiện về cơ sở vật chất và con
người, chúng tôi thiết kế, triển khai đề tài theo các bước sau:
Kết hợp với phía bạn, tổ chức tập huấn về kỹ thuật trước khi triển khai
21

đề tài đồng thời cử ngay cán bộ sang Nhật để nắm bắt lấy toàn bộ các quy
trình công nghệ sẵn có từ phía bạn.
Từ nguồn màng ối, tiến hành phân lập tế bào gốc theo phương pháp đã
được các nhà nghiên cứu của Nhật áp dụng thành công.
Duy trì và tăng sinh tế bào trong môi trường nuôi cấy (DMEM) có bổ
sung các yếu tố sinh trưởng.
Nghiên cứu môi trường gây biệt hóa tế bào gốc màng ối thành tế bào
biểu bì da và tế bào tụ
y đảo in vitro.
Chế tạo một số sản phẩm sinh học ứng dụng trong điều trị bao gồm tế
bào gốc màng ối đông lạnh và tấm tế bào gốc màng ối. Xây dựng tiêu chuẩn
đánh giá các sản phẩm này.
Đánh giá tác dụng điều trị của tấm tế bào gốc màng ối trên động vật
thực nghiệm.
Để thực hiện được toàn bộ quy trình công nghệ đề
ra, nhóm nghiên
cứu đã làm chủ được hoàn toàn các kỹ thuật cần thiết. Thêm vào đó là sự
giúp đỡ tạo điều kiện tối đa của các cơ quan chức năng bộ Khoa học - Công
nghệ, bộ Quốc phòng, Học viện quân y. Đồng thời nhóm nghiên cứu cũng có
được sự tư vấn, trợ giúp nhiệt tình vô tư của các nhà khoa học, các chuyên

ngày càng giãn rộng ra tiến sát tới màng đệm. Phần lá thành trung bì ngoài
phôi phủ ngoại bì màng ối tới sát nhập vào màng đệm. Vì vậy, khoang ngoài
phôi ngày càng hẹp lại và cuối cùng biến mất.
Màng ối được cấu tạo bởi 3 màng chính: màng bi
ểu mô đơn (single
epithelial layer), màng nền dày (basement membrane) và màng vô mạch
(avascular mesenchyme) [44]. Không có thần kinh, mạch máu hay bạch
huyết trong màng ối (Hình 1.2.) . Nó nằm ngay sát khoang ối (amniotic
cavity) và các tế bào lá phôi (trophoblast cell). Nó có thể dễ dàng phân tách
khỏi màng đệm (chorion) nằm ngay dưới đó. Màng ối được nuôi dưỡng bởi
dinh dưỡng và oxy từ dịch ối bao xung quanh và mạch máu của thai.

Hình 1.2. Sơ đồ cấu trúc màng ối [49].
23

24

Màng ối đóng vai trò quan trọng trong quá trình phát triển thai nhi và
chuyển dạ. Trong khởi điểm và duy trì co thắt tử cung, prostaglandin đóng
vai trò cốt yếu. Biểu mô màng ối không chỉ là một trong những nguồn cung
cấp prostaglandin, đặc biệt là prostaglandin E2 [49], mà nó còn tạo ra các
enzym sinh tổng hợp prostaglandin (prostaglandin-biosynthesis enzyme) ví
dụ như phospholipase, prostaglandin synthase, và cyclooxygenase. Hơn nữa,
các enzyme này được điều hòa bởi human chorionic gonadotropin (hCG),
các thụ cảm thể của chúng cũng tìm thấy trong màng biểu mô màng ối. Biểu
mô màng ố
i có mức độ hoạt động chuyển hóa cao trong quá trình thai nghén
và nó có chức năng điều hòa pH của dịch màng ối, giữ nó ở trạng thái hằng
định là khoảng 7,1.
Laminin là thành phần chính của màng nền tế bào gốc màng ối tham gia

từ môi trường bên ngoài; cho phép thai được cử động tự do và làm cho thai
không dính vào màng ối.
Chức năng giữ cân bằng lượng nước trong phôi thai: nước ối có quan
hệ trực tiếp với sự giữ cân b
ằng lượng nước trong phôi thai. Khi thai chứa
quá nhiều nước, lượng nước thừa được đào thải vào khoang ối, khi phôi thai
mất nước nó sẽ hấp thụ nước ối. Nước ối sẽ có tác dụng chống khô ráo cho
thai: phôi thai tắm mình trong nước ối nên không bị khô.
Cung cấp các chất dinh dưỡng: Các chất dinh dưỡng và oxy được cung
cấp bằng cách khuếch tán từ các lớp sâu của thành tử cung hoặc thông qua
dịch ối từ thai nhi. Một s
ố nghiên cứu đã chứng tỏ sự hiện diện của protein
vận chuyển glucose 1 và 3 chủ yếu ở bề mặt đỉnh của các tế bào biểu mô
màng ối [51].
Tổng hợp lipid nội ối: Các nghiên cứu về vi cấu trúc gần đây cho thấy
có quá trình sinh tổng hợp lipid nội ối, chứ không phải có nguồn gốc từ
những giọt lipid thoái hóa được tìm thấy trong màng ối. Các chất béo có
nguồn g
ốc từ tuần hoàn mẹ và đi vào nước ối sau khi thay đổi cấu trúc hóa
học.
26

Dự trữ glycogen: Sự hiện diện glycogen trong biểu mô màng ối ở giai
đoạn sớm thai kỳ có thể cung cấp một nguồn năng lượng là cần thiết bổ sung
cho các bào quan như ty thể và lưới nội chất và hoạt động ẩm bào
(pinocytotic) hạn chế của các tế bào HAE.
Sinh tổng hợp prostaglandin: Màng ối là một nguồn cung cấp
prostaglandin E2 (PGE2) duy nhất [52, 53], đóng vai trò quan trọng trong
việc khởi xướng và duy trì các cơ
n co thắt tử cung. Màng ối đóng một vai trò