1 TIỂU LUẬN

CÁC KỸ THUẬT ELISA

Tiền thân của ELISA là kỹ thuật miễn dịch học phóng xạ (radioimmunoassay – RIA), được phát
triển bởi Rosalyn Sussman Yalow và Solomon Aaron Berson (xuất bản lần đầu tiên năm 1960;
Nobel y học cho Rosalyn S. Yalow năm 1977). Mặc dù phương pháp này có độ nhạy và độ đặc hiệu
rất cao, tuy nhiên việc đánh đấu bằng phóng xạ yêu cầu kỹ thuật cao, phức tạp, tốn kém, cũng như
việc sử dụng phải vô cùng cẩn thận vì khả năng gây nguy hiểm của phóng xạ đã đưa đến nhu cầu tìm
kiếm các phương pháp cải tiến thay thế.
Để thay cho việc sử dụng chất đánh dấu phóng xạ, người ta đã sử dụng kỹ thuật liên kết kháng
nguyên hoặc kháng thể với một enzyme (enzyme-linked) có khả năng thực hiện một phản ứng nhận
biết (ví dụ như gây đổi màu một chất). Quy trình liên kết enzyme được phát triển độc lập bởi Stratis
Avrameas và G.B. Pierce. Bên cạnh đó, việc cần phải loại bỏ các kháng nguyên/kháng thể thứ cấp
không gắn dẫn tới kỹ thuật cố định các kháng nguyên/kháng thể sơ cấp (immunosorbent) được công
bố bởi Wide và Jerker Porath năm 1966. Năm 1971, hai nhóm nghiên cứu Peter Perlmann và Eva
Engvall cùng với Anton Schuurs và Bauke van Weemen đã độc lập công bố các bài báo tổng hợp
các kỹ thuật trên thành ELISA.

3. ELISA – nguyên lý cơ bản và các biến thể:
3.1. Nguyên lý cơ bản:
Theo nguyên lý cơ bản của miễn dịch học, mỗi một kháng nguyên (antigen) có nhiều yếu tố
kháng nguyên (epitope), mỗi một epitope có khả năng kết hợp với một kháng thể (antibody) tương
ứng với nó. Hầu hết các kháng nguyên đều có một hoặc vài epitope đặc trưng cho nó, dựa trên đó mà
người ta có thể xác định được kháng nguyên. Bên cạnh đó, sự xuất hiện của kháng nguyên trong cơ
thể trong một số trường hợp có khả năng kích thích cơ thể tạo ra kháng thể đơn dòng đặc hiệu để
chống lại kháng nguyên đó. Thông qua việc xác định kháng thể này người ta cũng có thể gián tiếp
xác định kháng nguyên trong cơ thể.

3
Dựa trên cơ sở đó, kỹ thuật ELISA được thiết lập nhằm chẩn đoán sự hiện diện của một kháng
nguyên hay kháng thể. Để xác định một yếu tố cần chẩn đoán (kháng nguyên/kháng thể) người ta sử
dụng một hoặc nhiều yếu tố phát hiện (kháng thể/kháng nguyên/bổ thể) có phản ứng miễn dịch đặc
hiệu với yếu tố cần chẩn đoán. Các yếu tố phát hiện này được đánh dấu bằng enzyme sao cho phản

c
Kháng nguyên cạnh tranh
Ab Kháng thể
E Enzyme
AAb Kháng kháng thể
. Liên kết giữa chất cần đánh dấu và chất đánh dấu
= Liên kết với bề mặt rắn
– Liên kết miễn dịch

3.2.1. ELISA dị pha:
Trong ELISA dị pha, các yếu tố cần chẩn đoán được tách ra khỏi hỗn hợp dung dịch mẫu bằng
cách cố định lên một bề mặt rắn (có thể là nhựa, thủy tinh, giấy, màng nitrocellulose, agarose,
polyacrylamide gel hay th
ậm chí vi khuẩn được cố định) tạo thành hai pha cố định và tự do, theo sau
là môt bước loại bỏ pha tự do. Yếu tố phát hiện được thêm vào sau đó để phát hiện sự hiện diện của
yếu tố cần chẩn đoán còn lại trên pha cố định thông qua hoạt tính của enzyme. Các phương pháp cố
định các yếu tố lên bề mặt rắn và loại bỏ pha tự do sẽ được đề cập đến trong phần 4.1.

4

3.2.1.1. ELISA trực tiếp:
Phương pháp này ít được sử dụng trong ELISA định lượng mà thường được sử dụng cho ELISA
định tính. Yếu tố cần chẩn đoán (ví dụ như kháng nguyên) được cố định trực tiếp lên một bề mặt rắn
và sau đó được xác định sự hiện diện bằng yếu tố phát hiện. Phương pháp có thể được mô tả tổng
quát qua sơ đồ sau:

] = Ag + Ab . E → ] = Ag – Ab . E

Phương pháp này có ưu điểm là chỉ cần một lần ủ do đó tiết kiệm thời gian và tối thiểu được việc
kiểm soát các điều kiện trong quá trình thực hiện (thay đổi nhiệt độ và buffer cho mỗi lần ủ, tính thời

ếu tố phát hiện, tín hiệu lại được
khuếch đại lên vài lần. Tuy nhiên cần lưu ý là càng nhiều lớp yếu tố phát hiện, số bước thực hiện
càng nhiều và sẽ kéo dài thời gian, tăng thêm việc kiểm soát điều kiện cho từng quá trình, cũng như
tăng khả năng liên kết chéo giữa các yếu tố phát hiện với nhau. Các kỹ thuật brigde sẽ được liệt kê
trong phần 4.2.
3.2.1.3. ELISA sandwich:
Tương tự như ELISA trực tiếp và gián tiếp, trong phương pháp này yếu tố cần chẩn đoán cũng
được cố định lên bề mặt rắn. Tuy nhiên việc cố định này không được thực hiện trực tiếp mà thông

5
qua liên kết miễn dịch với một yếu tố phát hiện (thường là kháng thể) đã được gắn cố định sẵn trên
bề mặt rắn. Sơ đồ tổng quát như sau:

] = Ab
1
+ Ag + Ab
2
. E → ] = Ab
1
– Ag – Ab
2
. E

Sau khi bắt giữ yếu tố cần chẩn đoán, lúc này phương pháp quay lại tương tự như ELISA trực
tiếp và gián tiếp sau khi đã cố định yếu tố cần chẩn đoán. Người ta có thể sử dụng một kháng thể liên
kết enzyme để xác định trực tiếp yếu tố trên (như ELISA trực tiếp), hoặc cũng có thể dùng một trong
số các phương pháp brigde của ELISA gián tiếp. Bên cạ
nh kháng thể người ta cũng có thể cố định
một số yếu tố khác lên mặt rắn như Clq, receptor, lectin…
Phương pháp này có khá nhiều ưu điểm vượt trội, thứ nhất là giảm được nhuộm màu nền và

phản ứng cùng lúc với một kháng thể được cố định. Hai loại kháng nguyên sẽ phản ứng miễn dịch
với Ab theo một tỉ lệ tương ứng với tỉ lệ nồng độ giữa hai loại kháng nguyên, từ đó có thể xác định
được nồng độ Ag khi đo tỉ lệ Ag
c
còn lại sau phản ứng với lượng Ag
c
sử dụng ban đầu. Cần lưu ý là
lượng kháng nguyên cạnh tranh phải được biết trước và phải dư để có thể bão hòa hết lượng kháng
thể. - Phương pháp bão hòa thứ tự (sequential saturation): ] = Ab – Ag ] = Ab – Ag
] = Ab + Ag
→ + Ag
c
. E →
] = Ab ] = Ab – Ag
c
. E

] = Ab – Ag
] = Ab + Ag + Ag
c
. E →
] = Ab – Ag
c
. E


- Phương pháp ức chế kháng thể (antibodies inhibition):
Thay vì cố định kháng thể lên mặt rắn, người ta cũng có thể cố định kháng nguyên cạnh tranh.
Đầu tiên, người ta sẽ cho kháng nguyên mẫu phản ứng với một lượng kháng thể biết trước. Sau đó,
lượng kháng thể còn lại chưa phản ứng sẽ được phản ứng với kháng nguyên cạnh tranh, và được cố
định lại. Sau bước rửa ta có thể đo lượng kháng thể còn cố định lại và suy ra lượng kháng thể đã
phản ứng với kháng nguyên mẫu.
Bên cạnh việc định lượng kháng nguyên, phương pháp này còn có thể sử dụng để so sánh các
kháng nguyên với nhau, như Altschuh và van Regenmortel (1982) đã dùng để nghiên cứu các
epitope khác nhau trên protein vỏ virus khảm thuốc lá.

3.2.2. ELISA đồng pha:
Phương pháp này thường
được sử dụng để định lượng các phân tử nhỏ. Khác với RIA và ELISA
dị pha, phương pháp này không cần bước tách biệt các yếu tố gắn kết và tự do, vì nó dựa trên sự thay
đổi hoạt tính của enzyme thông qua phản ứng liên kết miễn dịch.
Ưu điểm lớn của phương pháp này là giảm được mức độ phức tạp của phản ứng trong việc cố
định các yếu tố lên bề
mặt rắn, thời gian thực hiện rất nhanh cũng như giảm được lượng kháng thể
cần dùng vì không phải tráng một bề mặt rắn lớn. Tuy nhiên nó có nhược điểm là hầu hết các
Ab – Ag Ab – Ag
Ab + Ag → + Ag
c
. E → + ] = AAb

cạnh tranh. Ở đây kháng nguyên cạnh tranh có thể được đánh dấu với enzyme, cơ chất của enzyme,
cofactor, inhibitor, v.v… Còn về mặt biến đổi hoạt tính enzyme có nhiều phương pháp khác nhau
được sử dụng, sẽ được điểm qua trong phần 4.3. 4. Các biến thể trong các kỹ thuật bổ trợ khác cho ELISA:
Trong phần này sẽ đề cập đến một số kỹ thuật bổ trợ khác trong các phương pháp kể trên của
ELISA. Các kỹ thuật này không nhất thiết cố định cho từng loại ELISA mà có thể kết hợp tự do tùy
theo nhu cầu và thiết kế của thí nghiệm chẩn đoán.
4.1. Các kỹ thuật cố định các yếu tố miễn dịch lên bề mặt rắn trong ELISA dị pha:
Chọn lựa bề mặt rắn thích hợp là nhân tố quan trọng trong việc cố định các yếu tố miễn dịch.
Một bề mặt rắn cần thõa mãn các yêu cầu sau: Khả năng gắn kết số lượng lớn các yếu tố miễn dịch
(tỉ lệ bề mặt/thể tích cao), khả năng cố định được nhiều loại yếu tố khác nhau, tối thiểu sự phân tách
ngược lại các yếu tố đã cố định, mức độ phân hủy các phân tử cố định không đáng kể, định hướng
kháng thể cố định với hai đầu gắn kết quay lên trên và phần thân gắn xuống mặt rắn.
Có nhiều bề mặt rắn đã được thử nghiệm sử dụng trong ELISA dị pha: nhựa, thủy tinh, màng
nitrocellulose và giấy, agarose, cellulose, vi khuẩn cố định… Trong phần này sẽ sơ lược qua từng
loại bề mặt rắn và các phương pháp chung để cố định các yếu tố lên các bề mặt rắn này.

4.1.1. Nhựa:
Cho đến nay nhựa là bề mặt rắn được sử dụng phổ biến nhất, nhờ vào quy trình cố định rất đơn
giản. Tuy nhiên, nhựa có một số nhược điểm quan trọng: tốn lượng lớn các yếu tố cố định, làm giảm
ái lực của kháng thể cố định với các kháng nguyên lớn, tốc độ phản ứng miễn dịch chậm (hàng giờ
thay vì vài phút so với các yếu tố trong dung dịch), lượng yếu tố gắn kết trên một đơn vị diện tích
thấp. Có nhiều dạng bề mặt rắn làm từ nhựa: dạng hạt, đĩa, ống, que, dạng đầu diêm… Trong số đó,
dạng phổ biến nhất là dạng tấm chứa 12 x 8 giếng 0,3 ml làm từ polystyrene hoặc polyvinylchloride
(PVC).

8


đôi. Khác với DNA mạch đơn, DNA mạch đôi hấp thụ rất kém lên polystyrene. Klotz (1982) đã
dùng dung dịch protamine sulfate 1% xử lý bề mặt polystyrene. Một số hợp chất tích điện dương
khác cũng được sử dụng như MBSA (Ferrua và cộng sự, 1983) hay poly-L-lysiyne (Leipoid và cộng
sự, 1983)

9
4.1.2. Màng nitrocellulose và giấy:
Dạng màng nitrocellulose rất phổ biến trong nghiên cứu về acid nucleic, tuy nhiên cũng đang trở
nên thông dụng trong protein blotting. Ưu điểm lớn nhất của loại màng này là cần rất ít các yếu tố
miễn dịch để cố định, ít hơn 1 μl dung dịch có thể được sử dụng và làm khô trên bề mặt màng, giới
hạn khu vực bám của các yếu tố trong vòng đường kính nhỏ hơn 1 mm. Những khu vực khác có thể
được khóa bằng protein trơ hay các hóa chất che phủ khác. Một ưu điểm khác là kháng nguyên có
thể bám được trên loại màng này dù kém hơn khi có mặt các hóa chất không phân cực như Tripton
X-100 hay Tween.

Hình 2: Màng nitrocellulose dùng trong ELISA

4.1.2.1. Dot protein lên màng:
Phương pháp vô cùng đơn giản là sử dụng micropipete nhỏ dung dịch thành giọt trên màng, đợi
cho khô rồi tiếp tục nhỏ liên tiếp nhiều lần, sau đó là một bước hấp nóng giúp ổn định liên kết
protein lên màng. Thay vì sử dụng các chất che phủ các vị trí trống như BSA hay gelatin, người ta
cũng có thể thêm Tween 20 0,5% trong dung dịch chứa các yếu tố miễn dịch để ngăn cản các liên
kết không đặc hiệu.

4.1.2.2. Gắn các kháng nguyên tan trong chất tẩy rửa lên đĩa nitrocellulose:
Những đĩa nhỏ đường kính khoảng 4 mm được dập trên màng nitrocellulose được thả nổi trên
nước cất để làm ướt. Màng ướt được đặt trên giấy thấm và cho 10 – 20 μl mẫu. Đĩa sau đó được làm
khô và ủ với các chất che phủ để khóa các vị trí trống. Nếu sử dụng Triton X-100, cần cố định đĩa
với GA nhằm tránh sự phân tách ngược lại của protein.


. Nhỏ một lượng kháng nguyên lên bề mặt phiến kính và cố định theo các
phương pháp sau:
- Với virus: làm khô bằng bốc hơi
- Vi khuẩn và Archaebacteria: hơ nhanh mặt dưới phiến kính bằng đèn cồn ba lần
- Tế bào động vật có vú: Sấy khô rồi nhỏ một giọt acetone lạnh
- Kháng nguyên không cụ thể: để khô bằng bốc hơi rồi ủ 30 phút với phosphat buffer saline.
Để liên kết yếu t
ố miễn dịch với que thủy tinh aminoalkylsilyn, có thể sử dụng quy trình của
Robinson và cộng sự (1971), Hamaguchi và cộng sự (1976). Đun nóng que thủy tinh đường kính 3
mm, dài 5 mm ở 500
o
C trong 5 giờ. Sau đó ngâm 24 giờ trong dung dịch 3-
aminopropyltriethoxysilan 2% ở 45
o
C. Rửa lại với acetone và làm khô. Ngâm 1 giờ trong
glutaraldehyde 1%, rửa lại với 250 mM sodium phosphat buffer, pH 7,5. Sau cùng ngâm trong dung
dịch yếu tố miễn dịch cần cố định trong 30 phút rồi rửa lại với dung môi dùng cho ELISA.

4.1.4. Các bề mặt rắn khác:
4.1.4.1. Các cấu trúc ma trận:
Các cấu trúc ma trận có đồng phân không gian như agarose, dextran, allyl dextrose hay cellulose
có thể được kích hoạt bởi các chất oxy hóa như CNBr hay NaIO
4
, tạo gốc aldehyde có thể tạo liên
kết Schiff base với nhóm animo tự do của protein.
Agarose dưới dạng hạt (Sepharose) có những ưu điểm là yếu tố miễn dịch có thể được giữ dưới
dạng treo, cấu trúc xốp giúp hấp thu kháng nguyên nhiều hơn (10 μl sepharose có thể hấp thu lượng
kháng nguyên gấp 5 – 40 lần so với một đĩa giấy đường kính 6 mm và gấp 100 lần so với một giếng
nhựa), mức độ hấp thu không đặc hiệu cũng ít hơn.
Các loại bề mặt rắn khác như dextran, allyl dextrose hay cellulose còn có mức độ hấp thu yếu tố


4.2.1. Brigde enzyme liên kết miễn dịch (immunologically linked enzyme), hay còn gọi là ELISA
khuếch đại (amplified ELISA):

] = Ag + Ab
1
+ AAb + Ab
2
. E → ] = Ag – Ab
1
– AAb – Ab
2
. E

Phương pháp này có ưu điểm là đơn giản và dễ sản xuất các thành phần, thậm chí có thể sử dụng
enzyme thô. Độ nhạy được tăng cao, tuy nhiên có nhược điểm là AAb cần phải dư nếu không cả hai
tâm phản ứng của nó sẽ gắn kết với Ab
1
và không thể phản ứng với Ab
2
.

4.2.2. Brigde phức hợp biotin – avidin:
Avidin là một protein bốn nhân có trong lòng trắng trứng các loài chim, bò sát và lưỡng cư. Mỗi
nhân của avidin có khả năng liên kết khá đặc hiệu với biotin (vitamin H/vitamin B
7
). Người ta có thể
sử dụng đặc điểm này để thực hiện phương pháp brigde:

] = Ag + Ab + AAb . biotin + avidin + biotin . E

m do enzyme
này tạo ra sẽ là cơ chất của enzyme kia (ví dụ glucose oxidase như GOase và peroxidase như
POase). Phản ứng liên kết miễn dịch sẽ mang hai enzyme lại gần nhau, từ đó tăng hoạt tính tương
đối của enzyme. Phương pháp này được sử dụng cho ELISA đồng pha không cạnh tranh, tuy nhiên
vẫn còn cần nhiều cải tiến để tín hiệu thể hiện rõ hơn.

Hình 3: Phương pháp của Ngo và Lenhoff (1981)

Một phương pháp khác của Wei và Reibe (1977) gắn trực tiế
p enzyme với kháng thể. Khi kháng
nguyên liên kết miễn dịch với kháng thể sẽ che lấp tâm hoạt động của enzyme, khiến enzyme không
thể tiếp xúc cơ chất và làm giảm hoạt tính enzyme. Về mặt lý thuyết, phương pháp này có lợi điểm
là có thể sử dụng cho các kháng nguyên có kích thước lớn, tuy nhiên cần thiết phải có một thiết kế
chính xác về mặt cấu trúc không gian của kháng nguyên, kháng thể, enzyme và cơ chất. Thiết kế
không thích hợp có thể làm cho kháng nguyên không che lấp hết tâm hoạt động của enzyme, hoạt
tính của enzyme sẽ không giảm rõ rệt, trong khi đó nếu enzyme quá lớn có thể che lấp ngược lại
kháng thể và ngăn cản kháng nguyên liên kết với kháng thể.



Hình 5: Phương pháp của Rubenstein và cộng sự (1972)

Phương pháp của Burd và cộng sự (1977) sử dụng kháng nguyên cạnh tranh gắn với cơ chất của
enzyme. Việc liên kết miễn dịch với kháng thể sẽ ngăn cản không cho cơ chất gắn vào enzyme.
Kháng nguyên mẫu sẽ cạnh tranh kháng thể và giải phóng các cơ chất này.


Hình 7: Phương pháp của Carrico và cộng sự (1976)

Một biến thể tương tự phương pháp của Carrico là phương pháp được đề xuất bởi Bacquet và
Twumasi (1984), gắn kháng nguyên cạnh tranh với advidin. Lúc này advidin sẽ đóng vai trò tương
tự như inhibitor trong phương pháp trên đối với các enzyme chứa biotin.


15
5. Lựa chọn phương pháp ELISA thích hợp:
Việc lựa chọn ELISA trong số rất nhiều kỹ thuật chẩn đoán cũng như việc lựa chọn phương pháp
thích hợp nhất của ELISA để dùng vào một xét nghiệm phụ thuộc vào nhiều yếu tố, quan trọng nhất
là khả năng tìm được kháng thể đặc hiệu, thời gian thực hiện xét nghiệm, giới hạn phát hiện và yêu
cầu về độ nhạy và độ đặc hiệu.
Nền tảng của kỹ thuật ELISA dựa trên liên kết miễn dịch đặc hiệu, do đó việc có được kháng thể
đặc hiệu với một yếu tố là điều tiên quyết trong ELISA. Đây là nguyên nhân chính yếu và quan trọng
nhất khiến ELISA hay một số phương pháp trong ELISA không thể sử dụng được trong một số
trường hợp, ví dụ như phân biệt các subtype c
ủa một số vi khuẩn và virus.
Thời gian thực hiện xét nghiệm cũng là yếu tố rất quan trọng trong thực tiễn. Mặc dù ELISA là
kỹ thuật có thời gian thực hiện khá nhanh, tùy theo xét nghiệm có thể từ khoảng một tiếng cho đến
vài ngày nếu sử dụng các bộ KIT ELISA chuẩn bị sẵn, tuy nhiên do yêu cầu thực tế, đôi khi thời
gian xét nghiệm này vẫn chưa thích hợp, buộc người ta phải lựa chọ
n các kỹ thuật khác nhanh hơn
dù tốn kém hơn.
Giới hạn phát hiện của một phương pháp cho biết lượng yếu tố tối thiểu mà phương pháp có thể
phát hiện được. Mặc dù đã có nhiều phương pháp giúp làm giảm giới hạn phát hiện, tuy nhiên về
phương diện này ELISA vẫn còn kém khá xa so với các phương pháp dựa trên phân tử như sắc ký
khối phổ, lai protein, lai nucleic acid, PCR…
Độ nhạy và độ đặc hiệu của một phương pháp cũng phải được tính đến. Độ nhạy (sensitivity) cho
biết tỉ lệ các mẫu thực sự dương trong số các mẫu được chẩn đoán là dương và ngược lại, độ đặc
hiệu (specificity) cho biết tỉ lệ các mẫu thực sự âm trong số các mẫu được chẩn đoán là âm. Trên lý
thuyết thống kê xác suất, việc tăng độ nhạy sẽ làm giảm độ đặc hiệu và ngược lại. Do đó tùy theo
yêu cầu thực tế của xét nghiệm, cần xác định độ nhạy và độ đặc hiệu thích hợp nhất. Ví dụ như đối
với xét nghiệm những vi sinh vật nguy hiểm, cần thiết phải tăng độ nhạy để không bỏ sót trường hợp
dương tính nào. Cũng nên tính đến tỉ lệ dương tính trong số các mẫu. Ví dụ như đối với hai loại bệnh
có mức độ nguy hiểm như nhau, tuy nhiên một loại bệnh có tỉ lệ mắc trong dân cư thấp, thì yêu cầu

một công cụ rất mạnh cả trong nghiên cứu lẫn trong thực tiễn.
Tài liệu tham khảo:
R.H. Burdon, P.H. van Knippenberg, 1985, Laboratory Techniques In Biochemistry And Biology,
volume 15, P. Tijssen, Practice And Theory Of Enzyme Immunoassays, Elsevier, Amsterdam,
Netherlands
John M Walker, 2008, Methods In Molecular Biology, volume 516, John A. Crowther, The ELISA
Guide Book, 2
nd
edition, Humana Press, Springer, New York, USA
John M Walker, 1995, Methods In Molecular Biology, volume 42, John A. Crowther, ELISA:
Theory And Practice, Humana Press, Springer, New York, USA
IDEXX Laboratories, Inc., 2007, ELISA Technical Guide
http://en.wikipedia.org
http://www.docjax.com
http://www.ncbi.nlm.ni.gov