ĐỀ CƯƠNG BÀI GIẢNG
CÔNG NGHỆ SINH HỌC
(TÀI LIỆU DÙNG CHO SINH VIÊN NGÀNH CHĂN NUÔI THÚ Y)
Mã số môn học: CN2210
Số tín chỉ: 02
Lý thuyết: 28 tiết
Thảo luận: 2 tiết
1
CHƯƠNG 1
Tổng quan về công nghệ sinh học
Số tiết: 02 tiết (Lý thuyết: 02 tiết; bài tập, thảo luận: 0 tiết)
*) Mục tiêu
- Về kiến thức
+ Khái niệm, lịch sử phát triển của công nghệ sinh học.
+ Phân loại của công nghệ sinh học, thành tựu của công nghệ sinh học.
+ Triển vọng ứng dụng công nghệ sinh học lâm nghiệp.
- Về kĩ năng
+ Khái quát hóa, triển khai vấn đề.
+ Phân tích hình ảnh, bảng biểu, sơ đồ minh họa.
+ Liên hệ, vận dụng thực tiễn trong đời sống.
- Về thái độ
+ Sinh viên có thái độ nghiêm túc, tích cực chủ động, sáng tạo trong quá trình học tập và nghiên cứu,
tư duy khoa học biện chứng.
+ Có hứng thú và say mê nghiên cứu khoa học.
1.1. Khái niệm công nghệ sinh học
- Công nghệ sinh học có thể hiểu theo hai nghĩa rộng và hẹp.
+ Theo nghĩa rộng thì Công nghệ sinh học bao gồm cả những thành tựu, những ứng dụng
sinh học trong thực tiễn đời sống con người xuất hiện từ hàng trăm thế kỷ nay.
+ Công nghệ sinh học hiểu theo nghĩa hẹp liên quan đến các kĩ thuật hiện đại mang tính
công nghệ như Công nghệ di truyền và các kĩ thuật hiện đại
- Khái niệm biotechnology - công nghệ sinh học (CNSH) đã được đề xuất năm 1917 bởi một

Ngoài những lĩnh vực này, nhiều hướng nghiên cứu chuyên sâu về nhiều vấn đề đã hình
thành như CNSH hương liệu, CNSH khoáng chất,
1.3. Lịch sử phát triển của công nghệ sinh học
Sự phát triển của công nghệ sinh học có thể chia làm 3 giai đoạn:
* Giai đoạn 1: Giai đoạn trước năm 1900
Con người đã sử dụng các tác nhân sinh học đặc biệt là các vi sinh vật vào việc bảo quản
và chế biến thực phẩm. Các sản phẩm nhờ áp dụng sinh học chỉ được áp dụng qua thực nghiệm,
kinh nghiệm, sản xuất thủ công với quy mô nhỏ
* Giai đoạn 2: Giai đoạn từ 1900 đến 1970
- Sử dụng vi sinh vật trong sản xuất sinh khối, các hoạt chất thứ cấp.
- Vào đầu những năm 1900, người ta đã sử dụng các qui trình lên men vào công nghiệp
hoá học ở qui mô lớn để sản xuất axeton, butanol, ethanol.
- Trong Đại chiến thế giới lần thứ II: sản xuất được một khối lượng lớn penicillin,
steptomycin và các chất kháng sinh khác.
- Sau chiến tranh, với sự phát triển mạnh mẽ của công nghệ vi sinh vật
3
* Giai đoạn 3: Giai đoạn từ những năm 1970 trở lại đây (Giai đoạn phát triển công nghệ
sinh học hiện đại)
- Đặc điểm của giai đoạn này là sự phát triển mạnh của CNSH (các kĩ thuật, phương pháp
như: sinh học phân tử, kĩ thuật gene, công nghệ nuôi cấy mô tế bào thực vật, động vật, công nghệ
enzym, công nghệ lên men ) và khả năng ứng dụng rộng rãi trên nhiều ngành của CNSH ở quy
mô lớn.
- Vào những năm đầu thập kỷ 1980 kĩ thuật ADN tái tổ hợp ra đời
- Khác với các CNSH kinh điển, CNSH hiện đại được tiến hành chủ yếu nhờ kĩ thuật di truyền.
1.4. Thành tựu và xu thế phát triển của công nghệ sinh học
+ Hoàn thành giải mã bộ gen người và nhiều sinh vật khác (lúa, chuột, Arabidopsis ).
+ Sự phát triển mạnh mẽ của cây trồng chuyển gen
+ Động vật nhân bản : Năm 1997, J. Wilmus và cộng sự Viện Roslin đã tạo ra chú cừu
Dolly, động vật nhân bản đầu tiên từ nhân tế bào tuyến vú của một con cừu trưởng thành.
+ Nuôi cấy tế bào gốc (stem cell-tế bào mầm): Tế bào gốc là các tế bào có khả năng phân

galactosidaza, gluco-isomeraza, pectinaza), các chất phụ gia thực phẩm.
- Các loại thức ăn bổ sung cho chăn nuôi (kháng sinh mới ).
- Các loại thuốc trừ sâu, diệt cỏ với tính đặc hiệu tăng lên (các sản phẩm Bt, các
Baculovirut, tuyến trùng ký sinh ).
- Các hoocmon sinh trưởng thực vật (các cytokinin, auxin, ).
- Các hóa chất chẩn đoán bệnh cho động- thực vật.
* Công nghệ sinh học trong lâm nghiệp:
- Công nghệ gen: Trong lâm nghiệp đã nghiên cứu sử dụng isozyme và chỉ thị phân tử
trong chọn giống keo, bạch đàn và lát hoa.
- Nuôi cấy mô – tế bào: Hiện tại chúng ta đã làm chủ và tạo công nghệ nhân in vitro cho
nhiều loại cây lâm nghiệp.
- Công nghệ vi sinh , sử dụng vi sinh vật để làm phân bón.
- Chế phẩm diệt sâu hại trên một số loài cây.
- Trong lĩnh vực xử lý môi trường: bioga .
- Công nghệ enzym.
*) Tài liệu học tập
1. Nguyễn Quang Thạch, Nguyễn Thị Lý Anh (2005), Công nghệ sinh học trong nông nghiệp, NXB Nông
nghiệp.
2. Nguyễn Như Hiền (2006), Công nghệ sinh học, tập 1, NXB Giáo dục Hà Nội.
3. Nguyễn Mộng Hùng (2004), Công nghệ phôi và tế bào động vật , NXB Đại học Quốc gia.
4. Nguyễn Mộng Hùng (2002), Tế bào gốc, Tạp chí những vấn đề sinh học ngày nay.
5. Nguyễn Hoàng Lộc (2007), Giáo trình nhập môn Công nghệ sinh học, NXB Đại học Huế.
6. Lê Trần Bình, Hồ Hữu Nhị, Lê Thị Muội (1997), Công nghệ sinh học trong cải thiện giống, NXB Nông
nghiệp.
5
7. Nguyễn Văn Uyển, Nguyễn Tiến Thắng (1996), Những kiến thức cơ bản về Công nghệ sinh học, NXB
Giáo dục.
8. http://www .Congnghesinhhocvietnam
9. http://www . Nhasinh họctre
*) Câu hỏi ôn tập chương 1:

+ Các enzym nối
+ Các polymerase
+ Các nuclease
+ Các enzym sửa đổi
2.1.2.1. Các enzym giới hạn (Restriction enzym - RE)
- Khái niệm enzym giới hạn.
- Enzym giới hạn không mang tính đặc hiệu loài.
- Có 3 loại enzym giới hạn, trong đó enzym giới hạn loại II là được sử dụng chủ yếu.
- Các kiểu cắt của RE: + Cắt tạo đầu bằng
+ Cắt tạo đầu sole: tạo đầu sole 5’, tạo đầu sole 3’.
7
2.1.2.2. Các ligase
Các ligase có vai trò xúc tác sự hình thành liên kết phosphodieste giữa hai chuỗi ADN.
Enzym nối được sử dụng phổ biến nhất là các T4 ADN ligase.
2.1.2.3. Các polymerase.
Nhóm enzym polymerase bao gồm các enzym xúc tác quá trình tái bản ADN, tổng hợp
ARN trong quá trình phiên mã.
- ADN polymerase I: Xúc tác sự tổng hợp một mạch đơn ADN mới, đồng thời enzym
này còn có chức năng như một exonuclease.
- Taq polymerase: Là enzym của vi khuẩn chịu nhiệt sử dụng trong nhân bản ADN bằng
kĩ thuật PCR.
- ARN polymerase: Xúc tác quá trình phiên mã trên khuôn mẫu ADN.
2.1.2.4. Các nuclease
Là các enzym thủy phân những liên kết giữa các nucleotide của một acid nucleic. Thường
có 2 nhóm:
- Exonuclease (Enzym cắt ngoài): Cắt ADN từ các đầu của phân tử
- Endonuclease (Enzym cắt trong): Cắt ADN ở các vị trí bên trong.
2.1.2.5. Các enzym sửa đổi ADN.
2.1.3. Các vectơ nhân dòng sử dụng trong công nghệ ADN tái tổ hợp
2.1.3.1. Các vectơ plasmid

dòng, mục đích tạo dòng,…
- Trước hết, vectơ được cắt ở một vị trí xác định bằng một enzym giới hạn. Sau đó, hai
đầu chỗ mối cắt được xử lí để chúng không nối trở lại, vectơ chỉ có thể trở lại dạng vòng ban đầu
khi hai đầu chỗ mối cắt được nối với một trình tự ADN lạ.
2.1.4.2. Xử lí ADN c\n nhân dòng
- Trước hết cần chọn lọc sơ khởi các đoạn ADN có kích thước gần nhau và tương ứng với
loại vectơ đã chọn.
- Sau đó, hai đầu của các ADN này cần được xử lí cho phù hợp với hai đầu chỗ mối cắt
của vectơ.
2.1.4.3. Tạo vectơ tái tổ hợp
Vectơ và ADN cần tạo dòng đã được xử lí sẽ được trộn chung theo một tỷ lệ nhất định
với sự hiện diện của ligase để tạo thành vectơ ADN tái tổ hợp. Vectơ tái tổ hợp sau đó sẽ được
tinh sạch qua tách chiết và tủa.
2.1.4.4. Chuyển vectơ tái tổ hợp vào tế bào chủ
- Công đoạn này nhằm mục đích sử dụng bộ máy của tế bào chủ để sao chép vectơ tái tổ
hợp thành một số lượng lớn của bản sao.
- Tùy thuộc loại tế bào chủ, người ta sử dụng một kĩ thuật chuyển thích hợp.
2.1.4.5. Chọn lọc, tập hợp các đoạn gắn thành từng dòng riêng hình thành thư viện mẫu đã nhân
dòng. Từ đây có thể chọn lọc các trình tự c\n quan tâm
2.2. Các kĩ thuật chính sử dụng trong phân tích ADN
9
2.2.1. Phương pháp tách chiết ADN
2.2.1.1. Tách chiết ADN genom
Nguyên lí
Trong tế bào sinh vật có những loại acid nucleic sau đây: ADN genom, ARN tổng số,
ADN plasmid. Do vậy muốn tách được một trong các loại nucleotide đó, bước đầu tiên ta cần
phải có tế bào sinh vật, tiếp theo tiến hành phá vỡ tế bào nhưng không được làm hư hại mẫu acid
nucleic cần tách chiết. Sau đó, tiến hành loại bỏ các thành phần không mong muốn ra khỏi dịch
tế bào để thu được ADN genom, tiếp theo là tinh sạch và đánh giá kết quả.
Các bước tiến hành.

- Bước 4: Loại bỏ ARN thu ADN genom:
+ Hòa tan cặn tủa chứa acid nucleic và xử lí loại bỏ ARN bằng enzym RNase. Sau đó kết
tủa trở lại thu ADN genom.
2.2.1.2. Tách chiết ADN plasmid
10
Plasmid là nhân tố di truyền ngoài nhân và sao chép độc lập với nhiễm sắc thể. Plasmid
được tìm thấy hầu hết ở các vi khuẩn và một số ít các vi sinh vật nhân thực bậc thấp như nấm
men.
Nguyên lí.
Tế bào vi khuẩn có chứa ADN genom, ADN plasmid và các thành phần khác. Do vậy, muốn
thu được ADN plamid trước hết cần thu một lượng lớn tế bào vi khuẩn sau đó tiến hành phá vỡ tế
bào vi khuẩn và loại bỏ các thành phần không mong muốn. Kết quả thu được phân tử ADN palsmid.
Kiểm tra độ tinh sạch.
Các bước tiến hành.
- Bước 1: Thu sinh khối tế bào vi khuẩn
Chuẩn bị dịch nuôi cấy vi khuẩn thích hợp. Li tâm thu sinh khối.
- Bước 2: Phá vỡ tế bào vi khuẩn
Tế bào vi khuẩn được phá vỡ bằng hóa chất hoặc siêu âm.
Sử dụng enzym Lysozyme để phá vỡ thành tế bào vi khuẩn.
- Bước 3: Loại bỏ các thành phần không mong muốn, chủ yếu là protein và ADN genom.
Xử lí natri acetat và li tâm. Sau li tâm, ADN bộ gen và protein kết tủa ở đáy ống, lớp dịch nổi phía
trên chứa ADN plasmid. Thu lớp dịch nổi chứa plasmid chuyển sang ống khác.
- Bước 4: Tủa ADN plasmid
+ Lớp dịch chứa plasmid được bổ sung thêm ethanol 100% (hoặc isopropanol) lạnh để
kết tủa ADN plasmid.
+ Li tâm thu tủa ADN plasmid.
+ Hòa tủa trong nước khử ion hoặc dung dịch TE. Sau đó kiểm tra độ tinh sạch bằng điện
di hoặc quang phổ kế.
2.2.2. Các kĩ thuật lai axit nucleic
Các phương pháp lai phân tử rất đa dạng, tạm thời có thể chia chúng làm 3 nhóm lớn: Lai

enzym giới hạn, các đoạn này được phân tách dựa vào kich thước khi điện di trên gel agarose.
+ ADN được làm biến tính ngay trên gel rồi được chuyển lên một màng lai.
+ ADN cố định trên màng được đem lai với mẫu dò có đánh dấu phóng xạ. Sau quá trình
lai, người ta rửa màng lai để loại bỏ các mẫu dò không bắt cặp chuyên biệt.
+ Cuối cùng, người ta dùng kĩ thuật phóng xạ tự ghi để định vị các phân tử lai.
* Các ứng dụng quan trọng của Southern blot
+ Lập bản đồ giới hạn của một gen
+ Phát hiện các đa dạng trình tự của cùng một gen.
+ Phát hiện các đột biến mất đoạn, đột biến điểm hay tái tổ hợp trên một gen
b. Northern blot
Là phương pháp lai ARN của tế bào với mẫu dò ADN.
Phương pháp này được sử dụng để xác định kích thước và hàm lượng của một mARN
đặc trưng trong một hỗn hợp ARN.
Phương pháp này bao gồm một số bước sau:
12
+ ARN đã được làm biến tính sẽ được phân tách theo kích thước nhờ điện di trên gel
agarose có chứa chất làm biến tính.
+ Sau đó ARN được chuyển lên màng lai
+ ARN cố định trên màng lai được đem lai với mẫu dò có đánh dấu phóng xạ.
+ Các phân tử lai được phát hiện nhờ kĩ thuật phóng xạ tự ghi.
c. Western blot:
Lai Western blot được thực hiện giữa các protein với nhau dựa trên nguyên tắc phản ứng
miễn dịch giữa kháng nguyên và kháng thể.
d. Dot và slot blot
+ Phương pháp này cho phép định lượng tương đối một ARN đặc trưng trong một hỗn hợp
ARN mà không cần phải phân tách chúng ra. Phương pháp này có thể sử dụng cho ADN.
+ Trong phương pháp này người ta đặt trực tiếp một lượng mẫu nhỏ lên màng lai. Quá trình
lai và phát hiện phân tử lai giống như đề cập ở phần trên. Bản phóng xạ tự ghi sau đó được phân tích
bằng kĩ thuật mật độ kế cho phép ước lượng số lượng các phân tử lai có trong mẫu.
2.2.2.3. Lai tại chỗ (in situ hybridization):

chất – các fluochrome. Mỗi loại dideoxynucleotide được đánh dấu bằng một flouchrome có màu
khác nhau. Như vậy, tất cả các oligonucleotie cùng chấm dứt tại một loại dideoxynucleotide sẽ
có cùng một màu. Sau khi điện di trên gel polyacrylamide, kết quả sẽ được đọc qua một hệ thống
vi tính.
Phương pháp PCR dùng trong xác định trình tự axit nucleotide
Nguyên tắc của phương pháp này dựa trên sự phối hợp giữa phương pháp PCR và
phương pháp sử dụng các dideoxynucleotide.
Phương pháp chỉ sử dụng được khi vùng cần xác định trình tự đã biết trước, và ứng dụng
chủ yếu là nhằm phát hiện nhanh một đột biến điểm.
2.2.4. Kĩ thuật PCR
2.2.4.1. Khái niệm về phản ứng PCR (phản ứng chuỗi trùng hợp)
Vào năm 1985, K. Mullis đã phát minh ra phương pháp đơn giản để khuếch đại nhanh
nhiều bản sao (amplification) của các đoạn ADN mà không cần sự có mặt của tế bào. Kĩ thuật
này được gọi là Polymerase Chain Reaction, viết tắt là PCR.
Thực chất của kĩ thuật PCR là phương pháp tạo dòng (nhân bản) ADN trong phòng thí
nghiệm.
2.2.4.2. Nguyên tắc của phản ứng PCR
- Tính chất biến tính;
- Hồi tính của ADN;
- Tổng hợp ADN.
2.2.4.3. Thành ph\n của phản ứng PCR
- ADN mẫu (ADN cần khuếch đại): không cần độ tinh sạch cao.
- Các mồi (primer): Gồm mồi xuôi và mồi ngược.
- Enzym Taq ADN Polymerase chịu nhiệt.
- dNTP: các loại nucleotit triphosphate như: dATP, dTTP, dCTP, dGTP.
14
- Dung dịch đệm (buffer) thích hợp và MgCl
2
.
- Nước cất hai lần.

PCR đảo ngược (inverse PCR)
Được dùng để khuếch đại các đoạn phân tử kế cận với đoạn có trình tự DNA đã biết
trước, phân tử DNA này được cắt hạn chế và nối lại nhờ enzyme DNA ligase để tạo thành một
vòng tròn có tính chất monomer, sau đó đoạn ADN được khuếch đại nhờ hai primer tương đồng
với đầu của trình tự đã biết trước
Kĩ thuật RT-PCR
Phản ứng RT-PCR là phản ứng khuếch đại một đoạn khuôn mẫu ARN theo nguyên lý
của PCR, bao gồm hai giai đoạn: Giai đoạn thứ nhất (phiên mã ngược khuôn mẫu ARN thành sợi
ADN thứ nhất, sau đó dùng sợi này làm khuôn mẫu để tổng hợp sợi ADN thứ hai) và giai đoạn
thứ hai (dùng ADN sợi đôi làm khuôn mẫu để thực hiện phản ứng PCR).
2.2.4.6. Các yếu tố ảnh hưởng đến PCR
ADN mẫu
15
- Phản ứng PCR tối ưu khi ADN thật tinh sạch. Tuy nhiên nhiều kĩ thuật chẩn đoán bằng
PCR vẫn đạt kết quả đối với ADN thu nhận trực tiếp từ dịch chiết tế bào hoặc ngay cả mẫu ADN
không được bảo quản tốt.
- Phản ứng PCR tối ưu cũng lệ thuộc vào lượng bản mẫu.
Enzym
- Enzym được sử dụng đầu tiên là đoạn Klenow của ADN polymerase I.
- Enzym Taq - polymerase chịu nhiệt được phát hiện và sử dụng.
- Ngày nay nhiều polymerase chịu nhiệt khác đã được đưa ra thị trường với nhiều chức
năng chuyên biệt hay hoàn thiện hơn.
Mồi (primer) và nhiệt độ lai
- Mồi là chỉ tiêu quan trọng nhất để đạt được sự khuếch đại đặc trưng và có hiệu quả cao.
+ Không thể có sự bắt cặp bổ sung giữa mồi xuôi (sense) và mồi ngược (antisense) và
cũng không có những cấu trúc “kẹp tóc”.
+ Tm của mồi xuôi và mồi ngược không quá cách biệt nhau.
+ Thành phần nucleotide của các mồi phải cân bằng, tránh lặp lại nhiều lần các cặp GC.
+ Các mồi được chọn phải đặc trưng cho trình tự ADN cần khuếch đại, không trùng với
các trình tự lặp lại trên gene.

Ưu điểm của phản ứng PCR
- Tính đặc hiệu của phản ứng PCR cao: Việc nhân bản ADN bằng PCR có tính đặc hiệu
rất cao, vì việc nhân ADN chỉ được tiến hành sau khi hai mồi bắt cặp với ADN khuôn.
- Thời gian thực hiện cực nhanh, chỉ cần mất vài phút.
- Đơn giản và ít tốn kém: Nó được thực hiện trong ống nghiệm plastic nhỏ gồm các thành
phần tối thiểu và được sử dụng đồng thời.
- Độ tinh sạch của mẫu không cần cao:
PCR có thể thực hiện với các mẫu nucleic acid thô, ngay cả khi mẫu này đã bị phân hủy một
phần.
Nhược điểm
- Trong thực nghiệm, kích thước của trình tự cần khuếch đại là giới hạn đầu tiên: Trừ vài
trường hợp rất cá biệt, phương pháp PCR không hoạt động được với những đoạn ADN lớn hơn 3kb.
Việc sử dụng PCR đối với các độ dài dưới 1,5kb cho kết quả tốt.
- Sự ngoại nhiễm là vấn đề lớn nhất đặt ra đối với PCR, gắn liền với khả năng khuếch đại
bản sao của phương pháp này. Nguồn ngoại nhiễm lớn nhất thường là các sản phẩm khuếch đại
của những lần thao tác trước.
Có thể khắc phục một vấn đề này bằng một số biện pháp sau:
+ Các công đoạn thao tác khác nhau như thiết lập phản ứng PCR và phân tách các sản
phẩm khuếch đại phải được tiến hành ở những địa điểm cách xa nhau.
+ Dụng cụ dùng để thiết lập phản ứng không sử dụng vào các thao tác khác.
+ Dùng tia tử ngoại để loại bỏ các phân tử còn lại từ các lần khuếch đại trước.
+ Tất cả mọi thành phần của phản ứng đều được chia thành những lượng nhỏ, tính toán
sao cho đủ với 1, 2 lần thao tác.
- Các sai sót gây ra do Taq polymerase: Sự sao chép bởi Taq polymerase cho tỷ lệ sai sót
khá cao 10
-4
.
2.2.4.8. Ứng dụng của phản ứng PCR
- Sử dụng PCR trong tách dòng gen, xây dựng các ngân hàng gen, lập các loại bản đồ gen
và giải trình tự gen, bộ gen.

Kĩ thuật điện di được sử dụng nhiều trong nghiên cứu độ tinh sạch ADN, kích thước các
đoạn ADN bị cắt bởi enzyme giới hạn hoặc kiểm tra kết quả tách dòng gen
2.2.5.2. Các kĩ thuật điện di chủ yếu
Các kĩ thuật điện di được sử dụng chủ yếu gồm:
- Điện di trên gel agarrose : Là kĩ thuật điện đi để kiểm tra ADN sử dụng agarose từ 0,3
% - 2,0 % làm bản gel. Thường dùng để phân tách những đoạn ADN có kích thước trong khoảng
0,5 - 20,0 kb. Nếu kích thước đoạn ADN nhỏ dưới 1kb, hàm lượng agarose sử dụng khoảng 1 - 2
%, trong các phòng thí nghiệm thường sử dụng hàm lượng agarose khoảng 0,7 - 0,8%.
- Điện di trên gel polyacrylamid : Là kĩ thuật điện đi để kiểm tra ADN hoặc protein, sử
dụng bản polyacrylamid với nồng độ khoảng 3,5% - 20% làm bản gel, tùy theo kích thước đoạn
ADN hoặc trọng lượng phân tử protein. Đối với ADN, thường áp dụng cho các đoạn có kích
thước nhỏ tức là dưới 1000 cặp base. Đoạn gel có kích thước càng nhỏ, protein có khối lượng
phân tử càng nhỏ thì hàm lượng polyacrylamid sử dụng càng lớn, và ngược lại.
18
Thao tác với gel polyacrylamide phức tạp hơn với gel agarose. Do đó, gel này chỉ được
sử dụng cho những mục đích đặc hiệu:
+ Tinh sạch các oligonucleotide tổng hợp.
+ Xác định trình tự ADN.
+ Phân tách các đoạn có kích thước nhỏ, dưới 1000 cặp bazơ
- Điện di trên giấy : Là kĩ thuật điện di sử dụng giấy thấm Whatman 3 MM làm cầu nối
giữa hai điện cực của buồng điện di, các đại phân tử tích điện dịch chuyển trên giấy với tốc độ
khác nhau tùy theo kích thước và trọng lượng phân tử. Trước đây, phương pháp điện di trên giấy
thường được sử dụng trong nghiên cứu đa hình di truyền protein, izoenzyme
- Điện di trên gel tinh bột:
Tinh bột biến tính được sử dụng làm bản gel dùng trong điện di trong các nghiên cứu
protein, enzyme, izoenzyme
Ngoài ra, tùy thuộc thiết kế vị trí các cực của buồng điện di, có thể chia làm hai nhóm
phương pháp là diện di nằm ngang và điện di đứng. Phương pháp điện di nằm ngang có buồng
điện di với các cực trên cùng một mặt phẳng, còn phương pháp điện di đứng với buồng điện di
có cực âm (-) thường ở phía trên, cực dương (+) thường ở phía dưới.

Phổ điện di là băng gọn, rõ, chứng tỏ ADN không bị đứt gãy và không lẫn tạp.
2.2.6. Các kỹ thuật xác định tính đa hình ADN dựa trên PCR
2.2.6.1. Phương pháp phân tích RAPD (Randomly amplified Polymorphism ADN - đa hình các
đoạn ADN được khuếch đại ngẫu nhiên)
Phương pháp RAPD được William phát minh vào năm 1990, Welsh và cộng sự hoàn
thiện 1991.
Nguyên lý
Kỹ thuật RAPD (còn gọi là RAPD - PCR) sử dụng cùng một số cặp mồi ngẫu nhiên nhất
định (thường sử dụng 10 - 40 cặp mồi) để thực hiện phản ứng PCR, nhằm nhân các đoạn ADN
đặc trưng của mẫu nghiên cứu.
Nếu các mẫu nghiên cứu có bộ gen giống nhau, sản phẩm PCR ở điều kiện như nhau là
như nhau.
Các bước tiến hành
Các bước tiến hành kỹ thuật RAPD gồm các bước cơ bản như phản ứng PCR bao gồm
các bước chính sau.
- Bước 1: Tách chiết, tinh sạch ADN hệ gen.
- Bước 2: Thực hiện phản ứng PCR với mồi ngẫu nhiên.
Có thể sử dụng các loại mồi ngẫu nhiên khác nhau để nghiên cứu một loại mẫu, hoặc
dùng 1 loại mồi nhưng với các loại mẫu khác nhau để so sánh.
- Bước 3: Điện di sản phẩm PCR.
Sản phẩm PCR được tiến hành điện di trên agarose, hoặc gel polyacrylamid, sau đó được
nhuộm bằng ethidium bromid. Soi gel dưới ánh sáng tử ngoại, phát hiện băng ADN. Chụp ảnh
băng ADN.
20
- Bước 4: Phân tích và đánh giá kết quả.
Dựa vào kết quả băng ADN trên gel để xác định tính đồng dạng di truyền bằng các phần
mềm thông dụng hoặc tính theo các biểu thức khác nhau để lập sơ đồ hình cây biểu hiện mối
quan hệ tương đồng di truyền giữa các mẫu nghiên cứu.
Có thể tính hệ số tương đồng di truyền được tính theo công thức của Nei M. và Li.W.H. (1979).
Trong đó: S là hệ số tương đồng di truyền .

21
AFLP thực chất là sự khuếch đại các đoạn ADN được cắt bằng enzym hạn chế. Bởi vậy
có thể coi AFLP là sự cải tiến phương pháp RFLP nhờ phản ứng PCR hay phương pháp RAPD cải
tiến với sự tham gia của các enzym hạn chế và cặp mồi đặc hiệu.
Nguyên tắc của AFLP
Kỹ thuật AFLP dựa trên nguyên tắc là sử dụng kỹ thuật PCR với các cặp mồi đặc hiệu để
nhân bản các đoạn ADN đã bị cắt bởi enzym giới hạn.
Mồi đặc hiệu gồm có hai phần: Phần bổ sung với adaptor và phần bổ sung với những
nucleotide tùy ý (thường 1 - 3 nucleotide).
Quy trình của AFLP
- Bước 1: Tách chiết, tinh sạch ADN
- Bước 2: Cắt các phân tử ADN bằng các enzym giới hạn.
- Bước 3: Nối các đoạn ADN đã cắt với các adaptor.
- Bước 4: Sử dụng kỹ thuật PCR nhân các đoạn ADN với các cặp mồi đặc hiệu. Các hỗn
hợp ADN (đã được gắn adapter ) và primer được đưa vào phản ứng PCR.
- Bước 5: Phân tích kết quả sản phẩm PCR bằng điện di và xử lý kết quả bằng phần mềm
thông dụng để đánh giá sự khác biệt di truyền và đa dạng sinh học của các mẫu nghiên cứu.
Những ưu, nhược điểm của kỹ thuật AFLP
- Ưu điểm:
Kỹ thuật AFLP có tiềm năng to lớn trong kỹ thuật phân tích đa dạng di truyền:
+ Kỹ thuật AFLP có thể phân tích với bất kỳ hệ gen nào từ đơn giản đến phức tạp.
+ Phân tích sự đa dạng di truyền, đánh dấu các gen và ứng dụng để lập bản đồ gen.
+ Có thể nhân bản chọn lọc nhiều đoạn giới hạn trong một phản ứng AFLP.
- Nhược điểm:
+ Đối với hệ genom lớn, phức tạp thì số phân đoạn ADN là quá lớn, khó phân tích, do vậy cần
tìm biện pháp hạn chế số phân đoạn chỉ đủ để phân tích.
+ Kỹ thuật tiến hành qua nhiều bước, phức tạp.
Ứng dụng của AFLP
- Phát hiện tính đa hình (phân lập giống).
- Xây dựng bản đồ các bản đồ ADN marker có hiệu quả so với các ADN marker khác.

- Bên cạnh đó, mARN được tách chiết từ tế bào và được chuyển thành cADN nhờ enzym
phiên mã ngược. Vectơ tái tổ hợp được hình thành do sự kết hợp giữa plasmid và cADN.
- Sau đó, vectơ tái tổ hợp được đưa vào trong tế bào vi khuẩn bằng phương pháp biến nạp. Sau
khi tế bào vi khuẩn đã nhận các vectơ tái tổ hợp, nuôi chúng trong môi trường lỏng một thời gian ngắn
trước khi đem trải chúng trên môi trường đặc. Các dòng vi khuẩn sẽ hình thành nên các khuẩn lạc trên
mặt thạch.
2.2.8. Chọn lọc các gen có ý nghĩa
2.2.8.1. Phương pháp lai ADN (lai Southern): đã học trong lai trên pha rắn.
2.2.8.2. Phương pháp nhận biết qua protein
23
Theo lí thuyết, một gen trong đoạn ADN cần tìm mã hóa cho một protein đặc hiệu, hoạt
động của gen trong tế bào đó sẽ sản sinh ra một protein đặc trưng.
Người ta sử dụng mẫu dò là các protein kháng thể đã đánh dấu phóng xạ để phát hiện ra
protein cần tìm. Từ đó suy ra dòng nào đã sản sinh ra protein có phản ứng với mẫu dò.
2.2.9. Kỹ thuật Microarray
Microarray là một kỹ thuật mới rất hiện đai, cho phép cùng một lúc xác định được sự
hiện diện và biểu hiện của các gen ở những mô, tế bào đặc trưng.
- Tiến hành phản ứng lai hỗn hợp mARN với gen (sợi đơn) trên đĩa microarray. Dựa vào kết
quả phản ứng lai ta biết được mARN của gen nào đã được xuất hiện trong các điều kiện thí nghiệm.
=> Kết quả sẽ phát hiện được gen nào hoạt động, gen nào không hoạt động.
- Phương pháp tiến hành:
+ Gắn gen trên đĩa microarray, có lớp phủ polylysine để gắn chặt gen.
+ Tách ARN thông tin ở các mẫu nghiên cứu khác nhau. Đánh dấu chất phát màu riêng
cho ARN thông tin ở từng loại mẫu (cùng mẫu cùng một loại màu).
+ Trộn chung mARN của hai loại mẫu và cho tiến hành lai trên đĩa.
Phát hiện phản ứng phát quang màu trong tối được ghi lại qua hình ảnh. Sử dụng chương trình
máy tính chuyên dụng để xác định tình trạng biểu hiện gen ở các máy phân tích.
- Khả năng ứng dụng: Microarray là một công cụ cực kì hữu hiệu phục vụ lĩnh vực genom
học, nghiên cứu và xác định chức năng của các gen trong hệ gen, biết tính trạng quan tâm do những
gen nào kiểm soát, chức năng của các gen đó.

2. Các enzym chủ yếu sử dụng trong kỹ thuật ADN tái tổ hợp?
3. Các vectơ nhân dòng sử dụng trong công nghệ ADN tái tổ hợp?
4. Nhân dòng gen? Các bước cơ bản của phương pháp nhân dòng?
5. Phương pháp chiết tách ADN genome và ADN plasmid?
6. Các kỹ thuật lai axit nucleic? Nguyên tắc? Ứng dụng?
7. Các phương pháp giải trình tự gen?
8. Kỹ thuật PCR: Khái niệm, nguyên tắc, thành phần, chu kì, các yếu tố ảnh hưởng, ưu - nhược điểm?
9. Cho biết nguyên lí và các bước thực hiện kỹ thuật điện di?
10. Các kỹ thuật xác định tính đa hình ADN dựa trên PCR: Phương pháp phân tích RAPD ? Phương pháp phân
tích AFLP? Kỹ thuật SSR?
11. cADN- ngân hàng cADN ?
12. Chọn lọc các gen có ý nghĩa?
13. Kỹ thuật Microarray? Phương pháp tiến hành? Khả năng ứng dụng?
14. Trình bày các phương pháp chuyển gen ở động vật?
25