BỘ GIÁO VÀ ĐÀO TẠO
TRƯỜNG ĐẠI HỌC NHA TRANG

HOÀNG THỊ KIM HẠNH NGHIÊN CỨU SẢN XUẤT
OLIGOCHITOSAN BẰNG PHƯƠNG
PHÁP CHIẾU XẠ GAMMA COBAN 60

ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC
CHUYÊN NGÀNH CÔNG NGHỆ THỰC PHẨM CÁN BỘ HƯƠNG DẪN: TS. Vũ Ngọc Bội
ThS. Lê Hải KHÁNH HÒA - 2013

LỜI CẢM ƠN
Để hoàn thành Đồ án này
Trước hết tôi xin gửi tới Ban Giám hiệu Trường Đại học Nha Trang, Ban Chủ
nhiệm khoa Công nghệ Thực phẩm, Phòng Đào tạo niềm kính trọng, sự tự hào được
học tập tại Trường trong những năm qua.
Sự biết ơn sâu sắc nhất tôi xin được giành cho thầy: ThS. Lê Hải - Trưởng phòng
Công nghệ Bức xạ - Viện Nghiên cứu Hạt nhân Đà Lạt và TS. Vũ Ngọc Bội - Trưởng
khoa Công nghệ Thực phẩm - Trường Đại học Nha Trang đã tài trợ kinh phí, tận tình
hướng dẫn và động viên tôi trong suốt quá trình thực hiện đồ án tốt nghiệp này.
Xin cám ơn: Viện trưởng Viện Nghiên cứu Hạt nhân Đà Lạt cùng toàn thể cán
bộ Phòng Công nghệ Bức xạ đã tạo điều kiện thuận lợi về trang thiết bị và tận tình
giúp đỡ tôi trong thời gian tôi thực hiện đề tài tại phòng Công nghệ Bức xạ - Viện
Nghiên cứu Hạt nhân Đà Lạt.
Đặc biệt, xin được ghi nhớ tình cảm, sự giúp đỡ của: các thầy cô giáo trong Bộ
môn Công nghệ Thực phẩm và tập thể cán bộ trong Các phòng thí nghiệm - Trung
tâm Thực hành Thí nghiệm - Trường Đại học Nha Trang đã giúp đỡ nhiệt tình và tạo
điều kiện thuận lợi cho tôi trong suốt thời gian qua.
Cuối cùng, tôi xin cảm ơn gia đình, người thân và các bạn bè đã tạo điều kiện,
động viên khích lệ để tôi vượt qua mọi khó khăn trong quá trình học tập vừa qua.

Nha trang, tháng 6, năm 2013
Sinh viên thực hiện
Hoàng Thị Kim Hạnh
MỤC LỤC
LỜI CẢM ƠN i
MỤC LỤC iv
DANH MỤC HÌNH vii

2.1. ĐỐI TƯỢNG 40
2.2. PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 41
2.3. BỐ TRÍ THÍ NGHIỆM 42
2.3.1. Xây dựng quy trình sản xuất oligochitosan dự kiến 42
2.3.2. Xác định các thông số cho quy trình sản xuất oligochitosan bằng
phương pháp chiếu xạ gamma Coban - 60 45
2.3.1.1. Xác định độ hòa tan của chitosan trong các dung môi acid 45
2.3.1.2. Bố trí thí nghiệm xác định liều xạ thích hợp cho việc cắt mạch
chitosan tạo oligochitosan 49
2.3.1.3. Hiệu ứng sinh hoc của chitosan và các oligochitosan lên vi khuẩn
Bacillus subtilis 51
2.4. PHƯƠNG PHÁP XỬ LÝ SỐ LIỆU 52
2.5. THIẾT BỊ, DỤNG CỤ VÀ HÓA CHẤT 53
CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 54
3.1. SẢN XUẤT CHITOSAN TỪ CHITIN 54
3.2. XÁC ĐỊNH CÁC THÔNG SỐ CHO QUY TRÌNH SẢN XUẤT
OLIGOCHITOSAN BẰNG PHƯƠNG PHÁP CHIẾU XẠ 54
3.2.1. Xác định độ hòa tan của chitosan trong dung môi acid 54
3.2.1.1. Xác định loại acid và nồng độ acid thích hợp để hòa tan chitosan
54
3.2.1.2. Xác định mức độ hòa tan của chitosan trong acid acetic 55
3.2.2. Xác định liều xạ thích hợp cho việc cắt mạch chitosan tạo
oligochitosan 56
3.2.3. Tách phân đoạn chitosan sau khi chiếu xạ 60
3.2.3.1. Hiệu suất tách phân đoạn chitosan sau khi chiếu xạ 60
3.2.3.2. Trọng lượng phân tử chitosan sau khi phân đoạn 63
3.2.4. Biến đổi cấu trúc của chitosan chiếu xạ và oligochitosan của hai phân đoạn

Hình 2.2. Sơ đồ quy trình dự kiến sản xuất oligochitosan bằng phương pháp
chiếu xạ gamma Coban - 60 42
Hình 2.3. Sơ đồ bố trí thí nghiệm xác định độ tan của chitosan trong acid acetic 46
Hình 2.4. Sơ đồ bố trí thí nghiệm xác định độ tan của chitosan trong acid
citric 47
Hình 2.5. Sơ đồ bố trí thí nghiệm xác định mức độ hòa tan của chitosan trong acid 48
Hình 2.6. Sơ đồ bố trí thí nghiệm xác định khả năng cắt mạch chitosan tại các
liều xạ khi chiếu xạ dạng vẩy. 49
Hình 2.7. Sơ đồ bố trí thí nghiệm xác định khả năng cắt mạch chitosan tại các
liều xạ khi chiếu xạ dạng dung dịch. 50
Hình 2.8. Sơ đồ bố trí thí nghiệm đánh giá hiệu ứng sinh học của chitosan và
oligochitosan đối với sự sinh trưởng và phát triển của vi khuẩn Bacillus subtilis 52
Hình 3.1. Ảnh hưởng của loại acid và nồng độ acid đến mức độ hòa tan của
chitosan 54
Hình 3.2. Ảnh hưởng của tỷ lệ chitosan đến khả năng hòa tan của chitosan trong
1% CH
3
COOH 56
Hình 3.3. Đồ thị phương trình hồi quy tuyến tính giữa nồng độ và độ nhớt của
chitosan theo liều chiếu, chitosan dạng vẩy 57
Hình 3.4. Đồ thị phương trình hồi quy tuyến tính giữa nồng độ và độ nhớt của
chitosan theo liều chiếu đối với chitosan dạng dung dịch 57
Hình 3.5. Đồ thị trọng lượng phân tử chitosan theo liều chiếu 58
Chitosan dạng vẩy, suất liều 3,6 kGy 58
Hình 3.6. Đồ thị thể hiện sự biến đổi của trọng lượng phân tử trung bình chitosan
theo các liều xạ khi chiếu xạ dạng dung dịch 58
Hình 3.7. Đồ thị thể hiện hàm lượng chitosan các phân đoạn theo liều xạ 61

Bảng 1.1. Các dung môi thường sử dụng để hòa tan chitosan 9
Bảng 1.2. Ảnh hưởng của hệ dung môi sử dụng đến ứng suất kéo, độ giãn dài
giới hạn, độ trương nở của màng chitosan với độ deacetyl hóa khác nhau 10
Bảng 1.3. Ứng dụng của chitin, chitosan và dẫn xuất trong nông nghiệp 22
Bảng 1.4. Hiệu quả của việc bổ sung chitosan vào thức ăn tôm trong nuôi tôm
thâm canh (Wanichpongpan và Chandrkrachang, 2002) 24
Bảng 1.5. Một số ứng dụng chính của chitin và chitosan trong y học 25
Bảng 1.6. Hoạt độ chống đông máu của dẫn xuất chitin và chitosan 26
Bảng 1.7. Một số ứng dụng chính của chitin, chitosan và dẫn xuất trong xử lý
môi trường 28
Bảng 1.8. Phân loại bức xạ theo năng lượng và bước sóng 31
Bảng 1.9. Giới thiệu một số sản phẩm chiếu xạ của polyme ở nhiệt độ phòng
khi chiếu gamma 37
Bảng 3.1. Đặc trưng nhóm chức của các mẫu chitin, chitosan và chitosan phân
đoạn 67
Bảng 3.2. Kết quả đánh giá hiệu ứng sinh học của chitosan phân đoạn 3 lên vi
khuẩn Bacillus subtilic 70 DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT
TLPT

cải thiện khả năng hòa tan và đặc tính sinh học, hóa học và vật lý nhiều phương pháp
đã được tiến hành để sản xuất ra loại chitosan có trọng lượng phân tử thấp, có nhiều
đặc tính ưu việt và khả năng ứng dụng cao hơn. Chitosan trọng lượng phân tử thấp
(oligochitosan) đang mở ra nhiều hướng phát triển cho ngành công nghệ chế biến
thủy sản cũng như nghiều ngành khác.
Hiện nay, đã có một số nghiên cứu về sản xuất oligochitosan bằng phương pháp
sinh học và hóa học đã được công bố như nghiên cứu thủy phân chitosan thành
oligochitosan của Trần Thị Luyến, nghiên cứu cắt mạch chitosan bằng hydroperoxit
và thử nghiệm khả năng kháng khuẩn của chúng của Đỗ Thị Liền, Trần Thị Luyến.
Tuy nhiên, các phương pháp này quy trình thực hiện khá phức tạp, tốn kém nhiều chi
2
phí về hóa chất và enzyme, khả năng cắt mạch còn phụ thuộc nhiều vào yếu tố, hiệu
quả chưa cao, sử dụng nhiều hóa chất gây ô nhiễm môi trường sinh thái.
Với những lý do trên, tôi đã chọn đề tài: “Nghiên cứu sản xuất oligochitosan
bằng phương pháp chiếu xạ gamma coban 60”.
Mục tiêu của đề tài là: xác định các thông số thích hợp của quá trình cắt
chitosan tạo oligochitosan bằng phương pháp chiếu xạ gamma Coban-60 và đánh giá
hiệu ứng sinh học của chúng.
Nội dung nghiên cứu của đề tài:
1) Xác định các thông số thích hợp cho quá trình phân cắt chitosan thành
oligochitosan bằng phương pháp chiếu xạ sử dụng coban 60.
2) Sơ bộ đánh giá khả năng kháng khuẩn của oligochitosan sản xuất được.
Ý nghĩa thực tiễn: thành công của đề tài sẽ góp phần mở rộng ứng dụng của
chitosan trong công nghệ chế biến thực phẩm góp phần nâng cao giá trị kinh tế của
nguồn phế liệu có ý nghĩa rất lớn. Đặc biệt hơn, sản phẩm tạo thành có độ sạch cao
và quá trình sản xuất ít gây ô nhiễm môi trường.

Hình 1.2. Cấu trúc phân tử chitin trong không gian
Công thức phân tử là: [C
8
H
13
O
5
N]n.
Trong đó: n thay đổi tùy thuộc vào loại nguyên liệu
- Ở tôm Thẻ: n= 400-500
- Ở tôm Hùm: n=700-800
- Ở cua: n = 500-600
Phân tử lượng của chitin là: M
chitin
= (203,09)n
Xuất phát từ nguồn chiết rút chitin mà người ta chia chitin thành ba dạng: α-
chitin; β-chitin; γ- chitin. Chitin từ vỏ tôm và cua có dạng α- chitin, chitin từ mực có
dạng β-chitin. Cả ba dạng chitin đều có sự khác nhau về tính hydrat hóa, kích thước
của mỗi đơn vị cấu trúc và số mạch chitin trong mỗi đơn vị cấu trúc.
α- chitin có độ rắn phân tử cao nhất, ở dạng rắn chắc và các mạch chitin sắp xếp
song song nhưng ngược chiều nhau. β-chitin bao gồm các mạch chitin song song cùng
chiều nhau, có độ rắn thấp, tính hydrat hóa cao. γ- chitin sắp xếp cứ hai mạch song
song cùng chiều thì có một mạch ngược chiều. Trong tự nhiên, α- chitin có mặt nhiều
nhất và thường rất cứng trong khi β-chitin và γ- chitin thì tạo nên tính dai, dẻo.

5
ở mối nối Glucozid, sau đó loại bỏ nhóm acetyl (-CO-CH
3
) tạo thành 88,5 D -
Glucosamin và 21,5 acid acetic
Chitin có khả năng hấp phụ hồng ngoại ở bước sóng: λ= 884 - 890μm.
6

1.1.1.2 . Chitosan
 Nguồn gốc và công thức cấu tạo của chitosan [5], [18]
Chitosan là một dẫn xuất của chitin được hình thành khi tách nhóm acetyl (quá
trình deacetyl hóa chitin) khỏi chitin nên chitosan chứa rất nhiều nhóm amino.
Chitosan được phát hiện đầu tiên bởi Rouget vào năm 1859. Chitosan thường ở dạng
vẩy hoặc dạng bột có màu trắng ngà.
Công thức cấu tạo của chitozan gần giống như chitin và cellulose, chỉ khác là
chitozan chứa nhóm amin ở cacbon thứ 2.

Hình 1.4. Cấu tạo của chitosan
Cấu trúc không gian của chitosan [19]:

7
Hình 1.5. Cấu trúc phân tử chitosan trong không gian
Công thức phân tử là : (C
6
H

8
 Trọng lượng phân tử
Trọng lượng phân tử chitosan là một thông số cấu trúc quan trọng, nó quyết
định tính chất của chitosan như khả năng kết dính, tạo màng, tạo gel, khả năng hấp
phụ chất màu, đặc biệt là khả năng ức chế vi sinh vật.
Chitosan là polymer sinh học có khối lượng phân tử cao. Khối lượng chitin
thường lớn hơn 1000 kilô Dalton trong khi các sản phẩm chitosan thương phẩm có
khối lượng khoảng 100 - 1200 kilo Dalton, phụ thuộc vào nguồn chitin, điều kiện
deacetyl và thường rất khó kiểm soát. Chitosan có trọng lượng phân tử thấp thì thường
có hoạt tính sinh học cao hơn, thường có nhiều ứng dụng trong nông nghiệp, y học
và công nghệ sinh học. Chitosan có trọng lượng phân tử lớn có khả năng tạo màng
tốt và màng chitosan tạo thành có sức căng tốt.Thông thường ở nhiệt độ cao và có
mặt của oxy có thể dẫn đến phân hủy chitosan. Giới hạn nhiệt độ là 280°C, sự phân
hủy do nhiệt có thể xảy ra và mạch polymer nhanh chóng bị phá vỡ, do đó khối lượng
phân tử giảm. Ở điều kiện nhiệt độ cao và trong môi trường các acid HCl, H
2
SO
4
đặc
chitosan dễ dàng bị cắt mạch và làm suy giảm khối lượng phân tử của chúng. Khối
lượng phân tử chitosan có thể xác định bằng phương pháp sắc kí gel, sắc ký lỏng cao
áp hoặc đo độ nhớt.
 Độ nhớt
Độ nhớt là một thông số quan trọng để xác định khối lượng phân tử của chitosan.
Chitosan phân tử lượng càng cao càng làm cho dung dịch có độ nhớt cao. Độ nhớt
của chitosan trong dung dịch acid acetic tăng khi pH của dung dịch này giảm, tuy
nhiên nó lại giảm khi pH của dung dịch HCl giảm. Độ nhớt của chitosan bị ảnh hưởng

Dung môi
Nồng độ (%)
Dung môi
Nồng độ (%)
Acid acetic
1-2
Acid clohydric
0,25 - 0,5
Acid formic
1-2
Acid citric
5 - 10
Acid lactic
1-2
Acid glutamic
1 - 3
Acid propionic
1-2
 Khả năng tạo màng của chitosan
Chitosan có khả năng tạo màng rất tốt, tính chất cơ lý của màng chitosan như
độ chịu kéo, độ rắn, độ ngậm nước, phụ thuộc nhiều vào phân tử lượng và độ deacetyl
hóa của chitosan. Chitosan có độ deacetyl cao có ứng suất kéo và độ giãn dài giới hạn
cao hơn màng chitosan có độ deacetyl thấp, tuy nhiên chúng có độ trương nở thấp
hơn.
Ngoài ra, tính chất màng của chitosan còn phụ thuộc rất nhiều vào dung môi sử
dụng hòa tan chitosan để tạo màng (Bảng1.2.). Độ rắn của màng chitosan cũng phụ
thuộc vào dung môi sử dụng (hình 1.5.)

deacetyl
thấp
Chitosan
có độ
deacetyl
cao
Chitosan
có độ
deacetyl
thấp
Chitosan
có độ
deacetyl
cao
Acid
focmic
18.64
35,35
0,95
1,95
403,9
69,81
Acid
acetic
27,91
40,53
0,84
1,7
359
65,69

của chitosan phụ thuộc vào loại chitosan, loài vi sinh vật, điều kiện áp dụng và thường
sử dụng trong khoảng 0,0075% đến 1,5%. Ngoài ra, các dẫn xuất của chitosan cũng
có khả năng kháng khuẩn và kháng nấm tốt. N-carboxymethyl chitosan ở nồng độ
0,1- 5 mg/ml trong môi trường pH 5,4 làm giảm khả năng sinh độc tố aflatoxin của
Aspergillus flavus và Aspergillus parasiticus.
 Cơ chế kháng khuẩn của chitosan [2], [5]
Khả năng kháng khuẩn của chitosan và dẫn xuất của nó đã được một số tác giả
nghiên cứu kỹ về cơ chế kháng khuẩn của chúng. Mặc dù chưa có một giải thích đầy
đủ về khả năng kháng khuẩn đối với tất cả các đối tượng vi sinh vật, nhưng hầu hết
đều cho rằng khả năng kháng khuẩn liên quan đến mức độ hấp phụ chitosan trên bề
mặt tế bào. Trong đó, chitosan hấp phụ lên bề mặt vi khuẩn Gram (-) tốt hơn vi khuẩn
Gram (+). Một số cơ chế đã được giải thích như sau:
- Nhờ tác dụng của của nhóm
3
NH

trong chitosan lên các vị trí mang điện âm
ở trên màng tế bào vi sinh vật, dẫn tới sự thay đổi tính thấm của màng tế bào. Quá
trình trao đổi chất qua màng tế bào bị ảnh hưởng. Lúc này, vi sinh vật không thể nhận
các chất dinh dưỡng cơ bản như glucose cho sự phát triển bình thường dẫn đến mất
cân bằng giữa bên trong và bên ngoài màng tế bào. Cuối cùng dẫn đến sự chết của tế
12
bào. Theo giải thích của một số tác giả thì chính sự tác động giữa polycation chitosan
sẽ liên kết với polyme mang tính axit (polyanion) trên bề mặt tế bào vi sinh vật tạo
nên polyelectrolic đã gây khó khăn trong quá trình trao đổi chất.
- Chitosan có thể cản trở và làm mất cân bằng sự phát triển của vi sinh vật do
có khả năng lấy đi các ion kim loại đóng vai trò quan trọng trong thành phần enzyme

và sự tổng hợp protein tế bào.
- Chitosan có khả năng phá hủy màng tế bào thông qua tương tác của nhóm
3
NH

với những nhóm phosphoryl của thành phần phospholipid của màng tế bào vi
khuẩn. Quan sát dưới kính hiển vi sự phá hủy tế bào S.aureus, sự phân chia của tế
bào bị rối loạn, sự tạo thành tế bào không theo quy luật: Tế bào tạo thành không có
màng hoặc màng tế bào tạo thành rất mỏng gây nên sự rò rỉ các hợp chất nội bào.
 Các yếu tố ảnh hưởng đến khả năng kháng khuẩn của chitosan [2], [5]
Khả năng kháng khuẩn của chitosan phụ thuộc vào một vài yếu tố như loại
chitosan sử dụng (độ deacetyl, khối lượng phân tử), pH môi trường, nhiệt độ, sự có
mặt của một số thành phần thực phẩm.
- Ảnh hưởng của pH môi trường: pH có ảnh hưởng đến sự ion hóa của nhóm -
NH
2
trên mạch phân tử chitosan. pH càng cao mức độ ion hóa của nhóm -NH
2
càng
13
thấp làm giảm khả năng kháng khuẩn của chitosan. Nghiên cứu của Byung và cộng
sự trên hai loại chitosan và dẫn xuất cho thấy Cadida albicans càng ít bị ức chế khi
môi trường pH trở nên kiềm tính, hiệu quả ức khuẩn cao nhất khoảng pH 5 ÷ 5,57.
- Ảnh hưởng bởi trọng lượng phân tử hay độ nhớt của chitosan: Thí nghiệm
kiểm tra khả năng kháng khuẩn của 6 loại chitosan và 6 loại chitosan oligme với M
w


càng cao nhưng với E.coli và S.aureus thì ngược lại.
14
- Ảnh hưởng bởi độ deacetyl của chitosan: DD của chitosan thể hiện hàm lượng
-NH
2
trong phân tử chitosan. Các thí nghiệm đều chứng tỏ chitosan với độ deacetyl
cao thể hiện tính kháng khuẩn và khả năng làm sạch nước càng hiệu quả. Điều này có
thể giải thích là do sự tăng lên về khả năng ion hóa tạo phức của chitosan.
- Ảnh hưởng bởi nồng độ chitosan: Nồng độ chitosan càng cao thì khả năng ức
chế sự phát triển của vi khuẩn càng tăng. Tuy nhiên, cần phải sử dụng nồng độ
chitosan hợp lý để nâng cao hiệu quả sử dụng của chitosan.
- Ảnh hưởng bởi các tác nhân khác: Dung môi hòa tan chitosan và các hợp chất
bổ sung có thể tăng cường khả năng ức chế sự phát triển vi khuẩn của chitosan. Thí
nghiệm của Uchida (1989) cho thấy heptose tăng cường khả năng kháng khuẩn của
chitosan, triose có liên quan đến sự mất hoạt tính kháng khuẩn của chitosan. Một số
nghiên cứu khác cũng cho thấy làm tăng khả năng kháng khuẩn của dung dịch
chitosan nếu dùng các dung môi là acid citric, lactic và acetic. Nghiên cứu của
Matsuhashi và Kume cho thấy chitosan chiếu xạ có khả năng ức chế cao nhất đối với
sự phát triển của E.coli.
Một số nghiên cứu khác đã chứng tỏ khả năng kháng vi sinh vật tăng lên khi sử
dụng thêm phụ liệu tạo dẻo cho màng chitosan. Sử dụng sorbitol trong bao gói thịt
bò, tỷ lệ vi sinh vật tổng số giảm so với mẫu đối chứng là 73,86%, mẫu ban đầu là
77% trong khi sử dụng glycerin làm phụ liệu tạo dẻo lại có khả năng làm giảm vi sinh
vật tổng số trong thực phẩm. Ngoài ra hiệu quả kháng khuẩn của chitosan còn phụ
thuộc vào số lượng vi sinh vật trong thực phẩm và thời kì sinh trưởng và phát triển
của vi sinh vật.
Ngoài các tính chất trên, chitosan còn có khả năng chống oxy hóa, khả năng oxy