BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO
TRƯỜNG ĐẠI HỌC NHA TRANG
KHOA CÔNG NGHỆ THỰC PHẨM
**************

NGUYỄN THỊ THÚY MỸ

ĐÁNH GIÁ KHẢ NĂNG ÁP DỤNG PHẢN ỨNG
FENTON ĐỂ PHÂN TÍCH HOẠT TÍNH
CHỐNG OXY HÓA CỦA BHT ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC

CHUYÊN NGÀNH: CÔNG NGHỆ CHẾ BIẾN THỦY SẢN Nha Trang, tháng 07 năm 2013
BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO


LỜI CẢM ƠN
Sau hơn 3 tháng nghiên cứu làm đề tài “Đánh giá khả năng áp dụng
phản ứng Fenton để phân tích hoạt tính chống oxy hóa của BHT” đến nay
đã được hoàn thành. Để hoàn thành đợt thực tập này ngoài nổ lực của bản
thân em còn nhận được rất nhiều sự giúp đỡ từ phía quý thầy cô, gia đình và
bạn bè.
Trước hết em xin gửi tới Ban Giám hiệu Trường Đại học Nha Trang,
Ban Chủ nhiệm Khoa Công nghệ Thực phẩm niềm kính trọng, sự tự hào được
học tập tại Trường trong những năm qua.
Em xin chân thành cảm ơn quý thầy cô trong Khoa Công nghệ Thực
phẩm đã truyền đạt kiến thức quý báu và tận tình giải đáp thắc mắc của em
trong quá trình học tập và làm đề tài.
Đặc biệt em xin chân thành gửi lời cảm ơn sâu sắc nhất đến TS. Huỳnh
Nguyễn Duy Bảo là người đã tận tình hướng dẫn, chỉ bảo tạo điều kiện cho
em hoàn thành đề tài này.
Xin cảm ơn các cán bộ các phòng thí nghiệm: Công nghệ Thực phẩm,
Công nghệ Chế biến, phòng Hóa sinh-Vi sinh, Viện Công nghệ Sinh học và
Môi trường đã tạo điều kiện thuận lợi cho em hoàn thành đề tài.
Cuối cùng em xin chân thành cảm ơn gia đình, bạn bè và các anh chị
khóa trước đã động viên góp ý giúp em hoàn thành đề tài này.
Nha Trang, ngày tháng năm 2013
Sinh viên thực hiện
Nguyễn Thị Thúy Mỹ ii

MỤC LỤC
Trang

gốc tự do DPPH 21
1.4.2. Phương pháp đánh giá hoạt tính chống oxy hóa dựa vào tổng năng lực
khử 22
1.4.3. Phương pháp đánh giá hoạt tính chống oxy hóa lipid bằng mô hình
Fenton trong hệ lipid/FeCl
2
/H
2
O
2
23
1.4.4. Phương pháp đánh giá hoạt tính chống oxy hóa dựa vào khả năng khử
hydroperoxide 24
1.4.5. Phương pháp đánh giá hoạt tính chống oxy hóa lipid bằng mô hình
Fenton trong hệ lipid/myoglobin/H
2
O
2
25
1.4.6. Phương pháp ORAC 25
1.4.7. Phương pháp TRAP 26
1.4.8. Phương pháp FRAP 27
1.4.9. Phương pháp FTC 27
1.4.10. Phương pháp TEAC 28
1.4.11. Phương pháp tổng năng lực khử 28
1.4.12. Phương pháp TAC (Determination of Total Antioxidant Capacity) .28
1.4.13. Phương pháp DMPD (N, N-dimethyl-p-phenylene diamindihydrochloride) 29
1.4.14. Phương pháp Phospho molybdenum 29
1.4.15. Khảo nghiệm Conjugated diene 29
CHƯƠNG 2: ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 31

37
2.2.3.5. Phương pháp phân tích hoạt tính chống oxy hóa của BHT bằng mô
hình phản ứng Fenton trong hệ lipid/FeCl
2
/H
2
O
2
38
2.3. Phương pháp xử lý số liệu 39
CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN 40
3.1. Hoạt tính chống oxy hóa của BHT phân tích dựa vào mô hình phản ứng
Fenton trong hệ lipid/myoglobin/H
2
O
2
40
3.2. Hoạt tính chống oxy hóa của BHT phân tích dựa vào mô hình phản ứng
Fenton trong hệ lipid/FeCl
2
/H
2
O
2
41
3.3. Hoạt tính chống oxy hóa của BHT được phân tích dựa vào khả năng khử
gốc tự do DPPH 42
3.4. Hoạt tính chống oxy hóa của BHT được phân tích dựa vào tổng năng lực
khử 44
3.5. Hoạt tính chống oxy hóa của BHT được phân tích dựa vào khả năng khử

BHT phân tích theo mô hình Fenton trong hệ lipid/myoglobin/H
2
O
2
49
3.10. Tương quan giữa tổng năng lực khử và hoạt tính chống oxy hóa của BHT
phân tích theo mô hình Fenton trong hệ lipid/myoglobin/H
2
O
2
50
v

3.11. Tương quan giữa khả năng khử hydroperoxide và hoạt tính chống oxy hóa
của BHT phân tích theo mô hình Fenton trong hệ lipid/myoglobin/H
2
O
2
51
3.12. Tương quan giữa hoạt tính chống oxy hóa của BHT phân tích theo mô hình
phản ứng Fenton trong hệ lipid/myoglobin/H
2
O
2
và trong hệ lipid/FeCl
2
/H
2
O
2

Hình 2.1. Sơ đồ minh họa phương pháp đánh giá hoạt tính chống oxy bằng mô hình
phản ứng Fenton trong hệ lipid/myoglobin/H
2
O
2
32
Hình 2.2. Sơ đồ bố trí thí nghiệm đánh giá khả năng áp dụng mô hình phản ứng
Fenton để phân tích hoạt tính chống oxy hóa của BHT 34
Hình 2.3. Đường chuẩn DPPH 35
Hình 3.1. Hoạt tính chống oxy hóa của BHT phân tích dựa vào mô hình phản ứng
Fenton trong hệ lipid/myoglobin/H
2
O
2
40
Hình 3.2. Hoạt tính chống oxy hóa lipid của BHT phân tích dựa vào mô hình phản
ứng Fenton trong hệ lipid/FeCl
2
/H
2
O
2
41
Hình 3.3. Khả năng khử gốc tự do DPPH của BHT 43
Hình 3.4. Tổng năng lực khử của BHT 44
Hình 3.5. Khả năng khử H
2
O
2
của BHT 45

2
49
Hình 3.10. Tương quan giữa tổng năng lực khử và hoạt tính chống oxy hóa của
BHT phân tích theo mô hình Fenton trong hệ lipid/myoglobin/H
2
O
2
50
Hình 3.11. Tương quan giữa khả năng khử hydroperoxide và hoạt tính chống oxy hóa của
BHT phân tích theo mô hình Fenton trong hệ lipid/myoglobin/H
2
O
2
51
Hình 3.12. Tương quan giữa hoạt tính chống oxy hóa của BHT phân tích theo mô hình phản
ứng Fenton trong hệ lipid/myoglobin/H
2
O
2
và trong hệ lipid/FeCl
2
/H
2
O
2
53


ixDANH MỤC CÁC KÝ HIỆU VÀ TỪ VIẾT TẮT

BHA : Butylate hydroxyanisole.
BHT : Butylated hydroxytoluen.
TBHQ : Tertbutyl hydroquinone.
DPPH : 1,1-diphenyl1-2pycrylhydrazy.
TBARS : Thiobarbituric acid.
UV-VIS: Ultraviolet visible.
TCVN : Tiêu chuẩn Việt Nam.
FAO : Tổ chức lương thực và nông nghiệp.
VTM : Vitamin.
MDA : Malonyl dialdehyde.

trình oxy hóa gây ra ảnh hưởng đến thực phẩm. Hiện nay có rất nhiều chất
chống oxy hóa có nguồn gốc từ tự nhiên và tổng hợp. Mỗi phụ gia có khả
năng chống oxy hóa khác nhau, có ưu và nhược khác nhau nên việc đánh giá
khả năng chống oxy hóa và sử dụng chúng hợp lý là vấn đề quan trọng. Hiện
nay có rất nhiều phương pháp đánh giá hoạt tính chống oxy hóa đang được sử
2

dụng phổ biến như phân tích khả năng khử gốc tự do DPPH, tổng năng lực
khử, khả năng khử hydroperoxide… Tuy nhiên, phương pháp này chỉ phản
ánh hoạt tính chống oxy hóa gián tiếp. Một số nghiên cứu cũng đã áp dụng
mô hình Fenton để đánh giá hoạt tính chống oxy hóa của một số chất, tuy
nhiên phương pháp này vẫn chưa được áp dụng rộng rãi do chưa đủ thông tin
để đánh giá độ tin cậy của phương pháp. Do vậy, nghiên cứu này đã thực hiện
đánh giá khả năng áp dụng mô hình Fenton để phân tích hoạt tính chống oxy
hóa của BHT nhằm góp phần đánh giá độ tin cậy của phương pháp để từng
bước chuẩn hóa và đưa vào áp dụng rộng rãi. Và việc nghiên cứu này được
thực hiện đối với chất chống oxy hóa BHT vì nó cớ ưu điểm nổi bật như sau:
khả năng khử gốc tự do mạnh, độ tinh khiết cao, hoạt tính cao, bền, giá thấp
nhưng hiệu quả cao.
2. Nội dung thực hiện đề tài
- Phân tích hoạt tính chống oxy hóa của BHT áp dụng mô hình phản ứng
Fenton trong hệ lipid/myoglobin/H
2
O
2
và trong hệ lipid/FeCl
2
/ H
2
O

2
(OH)(CH
3
)[C(CH
3
)
3
]
2 Hình 1.1. Cấu tạo của BHT.
- Tên hóa học: BHT còn được gọi là 2,6-bis (1,1- dimethylethyl)-4-
methylphenol; 2,6-di-tert-butyl-p-cresol; 2,6-di-tert-butyl-4-methylphenol.
BHT được tạo thành phản ứng của para-cresol (4-methylphenol) với
isobutylene (2-methylpropene) xúc tác bởi acid sulfuric, có công thức phân tử
là C
15
H
24
O.
CH
3
(C
6
H
4
)OH + 2CH
2
=C(CH

C
6
H
2
OHCH
3
(C
6
H
4
)OH +
2CH
2
=C(CH
3
)
2
→ H
3
)
3
C)
2
CH
3
C
6
H
2
OH

RO
2
+ ArOH → ROOH +ARO
RO
2
+ ArO → sản phẩm không phải là gốc tự do
R là ankyl hoặc aryl, và nơi ArOH là phenolic của BHT hoặc có liên
quan đến chất chống oxy hóa. Người ta thấy rằng BHT liên kết với hai gốc tự
5

do peroxyl. Ngoài ra, nó còn là chất thuộc nhóm chất chống oxy hóa có hiệu
quả và được sử dụng rộng rãi trong sản phẩm có nhiều chất béo. Do đó có tác
dụng bảo quản thực phẩm, ngăn ngừa sự hư hỏng và ôi khét của hương liệu.
Ngoài ra nó còn có tác dụng ổn định và nhũ hóa cho shortening. Sử dụng đơn
lẻ một mình hoặc kết hợp với BHA, acid citric, sử dụng trong shortening, dầu
thực vật, thực vật.
1.1.4. Chức năng và lợi ích
 Thuộc nhóm chất chống oxy hóa có hiệu quả, và được sử dụng rộng rãi
trong các sản phẩm có nhiều chất béo.
 Có tác dụng bảo quản thực phẩm ngăn ngừa sự hư hỏng và ôi khét của
hương liệu.
 Ngoài ra còn có tác dụng ổn định và nhũ hóa cho shortening, được sử
dụng một mình hay kết hợp với BHA và acid citric.
1.1.5. Ứng dụng
Nó được sử dụng phổ biến trong quá trình sản xuất nhựa, cao su tự nhiên
và tổng hợp, ở đây nó hoạt động tốt như một chất ổn định. Nó được dùng trong
dầu bôi trơn, xăng, dầu thực phẩm và các sản phẩm thức ăn chăn nuôi.
 Sản xuất nhựa polymer: Nhựa yêu cầu chất chống oxy hóa này cố
định polymer trong quá trình xử lý và bảo vệ nó trong suốt tuổi thọ của sản
phẩm. Bản thân nó đã được chứng minh có hiệu quả với sự đa dạng của

 Nồng độ của chất chống oxy hóa.
 Thành phần của chất chống oxy hóa.
 Thời điểm sử dụng BHT.
1.1.7. Ưu điểm của BHT
 Độ tinh khiết cao.
 Có khả năng phân tán tốt trong các nguyên liệu thô.
 Dễ dàng xử lý với các chất ức chế kết dính.
 Hoạt tính cao.
7

 Lâu bền.
 Giá thấp nhưng hiệu quả cao.
 Không có hại cho sức khỏe.
1.2. Tổng quan về phụ gia chống oxy hóa
Chất chống oxy hóa là một phụ gia giúp ngăn chặn hoặc làm chậm quá
trình oxy hóa chất khác. Chất chống oxy hóa ngăn quá trình phá hủy này bằng
cách cho điện tử để khử đi các gốc tự do, kìm hãm sự oxy hóa bằng cách oxy
hóa chính chúng. Chúng cũng làm giảm tác dụng của các quá trình oxy hóa
nguy hiểm bằng các liên kết với các phân tử có hại, giảm sức mạnh hủy diệt
của chúng. Bất kỳ chất nào ngăn ngừa hay làm chậm sự oxy hóa đều được gọi
là chất chống oxy hóa.
1.2.1. Vai trò của chất chống oxy hóa
Trong quá trình chế biến cũng như bảo quản thực phẩm thường xảy ra
hàng loạt các phản ứng oxy hóa, làm biến đổi phẩm chất và giá trị của thực
phẩm. Cụ thể làm giảm giá trị cảm quan của thực phẩm do quá trình oxy hóa
làm biến đổi màu sắc theo chiều hướng xấu, đồng thời tạo ra các sản phẩm
thứ cấp gây mùi khó chịu cho thực phẩm. Sản phẩm oxy hóa thường làm vô
hoạt enzyme đặc biệt đặc biệt là enzyme tiêu hóa. Sản phẩm oxy hóa lipid có
khả năng phản ứng cao với protein tạo hợp chất bền vững, không tan trong
nước cũng như trong dung môi hữu cơ và cũng không bị thủy phân.

thực phẩm đã bị oxy hóa.
9

1.2.3. Phân loại chất chống oxy hóa

Hình 1.3. Phân loại chất chống oxy hóa
Ngoài ra còn có một số chất hỗ trợ chống oxy hóa như:
+ Leucithin + Photphoric
+ Acid amin + Citraconic
+ Acid citric + Fumaric
Chất hỗ trợ chống oxy hóa chất béo được thêm vào để tăng cường
hiệu quả chống oxy hóa cụ thể như sau:
 Tạo môi trường acide ổn định để chống oxy hóa chất béo.
 Loại bỏ hoạt tính các ion kim loại (tạo phức vô hại).
 Loại bỏ oxy (oxy hóa ascorbic).
 Phục hồi chống oxy hóa.
a. Chất chống oxy hóa tự nhiên
 Acid ascorbic (Vitamin C)
Công thức: C
6
H
8
O
6 10

dịch tễ học cho thấy polyphenol thực vật có thể làm chậm sự lan triển của ung
thư, giảm nguy cơ bệnh tim mạch, bệnh thoái hóa thần kinh, tiểu đường, hoặc
loãng xương.

11

 Nhóm carotene
Carotenoid giúp chống lại các tác nhân oxy hóa từ bên ngoài. Thiên
nhiên có đến khoảng 600 loại carotenoid khác nhau, trong đó có 50 loại
carotenoid hiện diện trong thực phẩm. Carotenoid khá quen thuộc với chúng
ta là β-caroten hay còn gọi là tiền chất của vitamin A. Βeta-caroten là một
tenpin. Nó là một trong hơn 600 loại carotenoid tồn tại nhiều trong tự nhiên.
Carotenoid là những chất có màu vàng cam, cam và hơi pha đỏ. Nhưng ngoài
những tác dụng như vitamin A nó không hề gây độc tính quá nhiều như
vitamin A và điều đặc biệt là beta-caroten khử các gốc tự do tốt hơn vitamin
A, giảm nguy cơ của nhiều căn bệnh ung thư, giúp làm trẻ hóa làn da, giảm tử
vong do bệnh tim mạch
 Peptide
Chúng cũng kích thích sản xuất collagen và làm tăng tác dụng của
chất chống oxy hóa. Trong cơ thể động vật và thực vật peptide làm nhiệm vụ
bảo vệ cho cơ thể. Loại peptide đầu tiên phải kể đến ở động vật có xương
sống là các peptide kháng thể trong máu, chúng là những yếu tố nhận biết đắc
lực các tác nhân vi khuẩn, virus và các vật thể lạ xâm nhập vào cơ thể và để
loại trừ chúng ra khỏi cơ thể.
 Selen
Trước đây, trong dinh dưỡng người ta ít quan tâm tới selen. Nó chỉ
mới được biết tường tận vào những năm gần cuối thế kỷ 20. Có nhiều công
trình nghiên cứu về selen mà đặc biệt nhất là vai trò khử các gốc tự do. Selen
ngoài tác dụng hoạt hóa vitamin E (giúp vitamin E “bẫy” các gốc tự do một
cách rất hiệu quả), còn có mặt trong một số enzyme dọn sạch lipo-peroxide

15
H
24
O
Bột màu trắng
BHT ngăn ngừa oxy hóa chất béo. Nó được sử dụng để bảo quản thực
phẩm có mùi, màu sắc và hương vị.

13

 BHA (butylate hydroxyanisole)
BHA là một hỗn hợp của các đồng phân 3-tert-butyl-4-
hydroxyanisole và 2-tert-butyl-4-hydroxyanisole.
Công thức phân tử: C
11
H
16
O
2

Màu trắng hoặc hơi vàng
Mùi thơm đặc trưng
Cơ chế: Nó hoạt động như một chất ngăn chặn quá trình oxy hóa, một
quá trình không bão hòa trong đó các hợp chất hữu cơ bị tấn công bởi oxy
trong khí quyển. BHA chống oxy hóa xúc tác phản ứng bằng cách chuyển đổi
các gốc tự do peroxy trong liên kết hydroperoxides. Điều này tác động đến
chức năng chống oxy hóa bằng cách nó sẽ quyên góp một nguyên tử hydro. Hình 1.6. Cấu tạo BHA

2
dưới sự xúc tác của ion sắt là một ví dụ điển hình của phản ứng
oxy hóa khử một điện tử.
Fe
2+
+ H
2
O
2
Fe
3+
+ HO
*
+ HO
-

Fe
3+
+ H
2
O
2
H
+
+ HOO
*
+ Fe
2+

Về bản chất, gốc tự do là một electron độc thân. Các gốc tự do rất