BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO
TRƯỜNG ĐẠI HỌC NHA TRANG
VIỆN CÔNG NGHỆ SINH HỌC VÀ MÔI TRƯỜNG
oOo

PHẠM TÀI MINH

PHÂN LẬP VÀ NGHIÊN CỨU ẢNH HƯỞNG
CỦA MỘT SỐ YẾU TỐ MÔI TRƯỜNG ĐẾN
QUÁ TRÌNH TỔNG HP

β
ββ
β-caroten CỦA
TẢO Dunaliella sp. TRÊN RUỘNG MUỐI
TỈNH KHÁNH HÒA

ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC


lãnh đạo Viện CHSH & MT, các thầy giáo, cô giáo bộ môn đã chỉ dẫn,
giảng dạy em trong suốt 4 năm học qua và đã tạo những điều kiện thuận lợi
để em hoàn thành luận văn này.
Cuối cùng, em xin cảm ơn gia đình, người thân và bạn bè, những
người luôn bên cạnh động viên, giúp đỡ em trong suốt quá trình em thực
hiện đề tài.

Nha Trang, tháng 6 năm 2013 PHẠM TÀI MINH

ii

MỤC LỤC
LỜI CẢM ƠN i
MỤC LỤC ii
DANH MỤC BẢNG iv
DANH MỤC HÌNH v
DANH MỤC HÌNH v
DANH MỤC CÁC TỪ VIẾT TẮT vii
MỞ ĐẦU 1
CHƯƠNG 1. TỔNG QUAN 2
1.1. Tổng quan về β-caroten 2
1.1.1. Cấu trúc 3
1.1.2 Tính chất vật lý và quang phổ 4
1.1.3 Tính chất hóa học 5
1.1.4. Hoạt tính sinh học và khả năng hấp thụ 6
1.2 Tổng quan về tảo Dunaliella 10
1.2.1. Nguồn gốc 10

54
KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 59
1. Kết luận 59
2. Kiến nghị 59
TÀI LIỆU THAM KHẢO 61
DANH MỤC BẢNG PHỤ LỤC KẾT QUẢ
iv

DANH MỤC BẢNG
Bảng 1.1 Quang phổ hấp thụ của một số carotens điển hình 4
Bảng 1.2 So sánh thành phần dinh dưỡng của tảo Dunaliella salina với
tảo Spirulina và thực vật (cà rốt) 18
Bảng 1.3 So sánh khoáng chất trong các loại thực phẩm xanh 18
Bảng 2.1 Thành phần môi trường 25
Bảng 3.1 Phân bố tảo Dunaliella trên các địa điểm thu mẫu vào các mùa
khác nhau. 36
Bảng 3.2 Hàm lượng β-caroten của 4 chủng vi tảo biển Dunaliella sau 10
ngày nuôi trong môi trường J/l 8.8%, 7500lux, mật độ ban đầu
5x10
3
tb/ml 41
Bảng 3.3 Giá trị hàm lương β-caroten (mg/lít) của chủng NT6 trong
nghiệm thức ánh sáng 43
Bảng 3.4 Giá trị hàm lương β-caroten (pg/tb) của chủng NT6 trong
nghiệm thức nhiệt độ. 45
Bảng 3.5 Giá trị hàm lương β-caroten (mg\lít) của chủng NT6 trong
nghiệm thức ánh sáng. 47

Hình 1.8 Tế bào Dunaliella salina 15
Hình 1.9 Tế bào Dunaliella primolecta 16
Hình 1.10 Tế bào Dunaliella tertiolecta 16
Hình 1.11 Bốn loài D. parva, D. salina, D. viridis and D. pseudosalina
sinh trưởng trong NaCl 4.0 M (A), Bể muối ở Gave-Khooni
Salt Marsh, Iran có mặt D. salina màu đỏ cam (B), hình dạng
của D. salina sinh trưởng trong NaCl 4 M (C) và hình dạng của
D. salina sinh trưởng trong NaCl 2M(D) 22
Hình 2.1 Sơ đồ tiếp cận các vấn đề nghiên cứu 27
Hình 2.2 Phân lập tảo Dunaliella bằng phương pháp pha loãng mẫu 30
Hình 2.3 Thí nghiệm xác định sự ảnh hưởng của nhiệt độ đến đến sự tăng
tích lũy β- caroten của tảo Dunaliella sp 32
Hình 2.4 Thí nghiệm xác định sự ảnh hưởng của ánh sáng đến đến sự
tăng tích lũy β- caroten của tảo Dunaliella sp. 33
Hình 2.5 Thí nghiệm xác định sự ảnh hưởng của độ mặn đến đến sự tăng
tích lũy β- caroten của tảo Dunaliella sp 34
Hình 2.6 Thí nghiệm xác định sự ảnh hưởng của hàm lượng KNO
3
đến
đến sự tăng tích lũy β- caroten của tảo Dunaliella sp. 35
Hình 3.1 Quá trình phân lập tảo Dunaliella 38

vi

Hình 3.2 Hình thái chủng NT6 (A) và kích thước tế bào chủng NT6 (B)
trên kính hiển vi quang học (100X); mũi tên màu vàng chỉ điểm
mắt (eyespot) 40
Hình 3.3 Hình thái chủng ND25 (A) và kích thước tế bào chủng ND25
(B) trên kính hiển vi quang học (100X); mũi tên màu cam chỉ
thể lạp xếp vòng 41

57 vii
DANH MỤC CÁC TỪ VIẾT TẮT
ER
Endoplasmic Reticulum(lưới nội chất)
EDTA
Ethylene diamine tetraacetic acid
OD
Optical Density(mật độ quang)
EFAs
Essential fatty acids(acid béo thiết yếu)
KLUX
1klux = 1000 lux
CĐAS
Cường độ ánh sáng

1

MỞ ĐẦU
Vi tảo là những vi sinh vật xuất hiện sớm trên trái đất, trải qua hàng
trăm tỷ năm tiến hóa, chúng được xem là sinh vật có cấu trúc hình thái đa
dạng nhất. sự phân bố và nơi sống của vi tảo rất đa dạng, chúng có thể sống
trong các và phát triển ở các vùng ẩm ướt, thủy vực cho tới các vùng băng
tuyết hay sa mạc nóng bức [7].
Chúng có kích thước rất nhỏ mà mắt thường không nhìn thấy được,

là chất kích thích sinh trưởng ngăn ngừa ung thư và làm sáng mắt. Theo
thống kê năm 1997 giống tảo Dunaliella được nuôi trồng nhiều nhất tại Úc
với sản lượng khoảng 40 tấn/ năm và chúng được ứng dụng chủ yếu để sản
xuất thuốc, thức ăn, mỹ phẩm cho con người và động vật [9]
Chủng tảo Dunaliella ở Việt Nam rất đa dạng, nhiều loài đặc hữu,
hứa hẹn sẽ là nguồn tiềm năng sản xuất β-caroten trong thời gian tới. Tuy
nhiên hiện nay công nghệ nuôi Dunaliella để thu nguồn β-caroten vẫn đang
là thách thức đối với các nhà khoa học của Việt Nam.
Xuất phát từ lý do trên mà chúng tôi tiến hành hiện đề tài “Phân lập
và nghiên cứu ảnh hưởng của một số yếu tố môi trường đến quá trình
tổng hợp β-caroten của tảo Dunaliella sp. trên ruộng muối tỉnh Khánh
Hòa ”
Mục tiêu của đề tài :
1: Phân lập tảo Dunaliella sp.
2: Nghiên cứu ảnh hưởng của một số yếu tố môi trường bao gồm:
nhiệt độ, cường độ ánh sáng, độ mặn, hàm lượng KNO
3
đến quá trình tổng
hợp β-caroten của tảo Dunaliella sp.
CHƯƠNG 1. TỔNG QUAN
1.1. Tổng quan về β-caroten

3

1.1.1. Cấu trúc
β-caroten là hợp chất thuộc nhóm carotenoid. Carotenoid là dạng sắc
tố hữu cơ có tự nhiên trong thực vật và các loài sinh vật quang hợp khác
như là tảo, một vài loài nấm và một vài loài vi khuẩn. Hiện nay người ta đã
tìm được 600 loại caroten, sắp xếp theo hai nhóm, xanthophylls và caroten
[8]. Caroten thuộc nhóm tetraterpen (phân tử chứa 40 nguyên tử C) được

một số loài tảo quang hợp. Chúng là tiền chất của vitamin A, thường tồn tại
ở dạng tinh thể có màu đỏ đậm. β-caroten có thể tan trong các dung môi
hữu cơ không phân cực như benzen, chlorofom, hexan, petroleum ether…,
ít tan trong các dung môi phân cực như methanol, ethanol và không tan
trong nước.
β-caroten khi để ngoài không khí dễ hấp thụ oxi (đến 40% so với
trọng lượng) để trở thành dạng oxi hóa. β-caroten nguyên chất là các tinh thể đen
có màu đỏ sáng của đồng và có ánh kim loại, dung dịch caroten có màu đỏ cam
[8].
β-caroten rất dễ bị oxy hoá dưới tác dụng của oxy không khí, ánh
sáng, nhiệt độ và enzyme, nhạy cảm với axit và chất oxy hoá, bền với kiềm
hấp thu bước sóng cực đại vào khoảng 450nm [8]
Quang phổ hấp thụ của caroten trong các dung môi ở các vùng cực
tím có cực đại hấp thụ như sau (bảng 1.1).
Bảng 1.1 Quang phổ hấp thụ của một số carotens điển hình [23]
caroten

Dung môi
α-caroten β-caroten γ-caroten Lycopene
Acetone 424

448

476

429

452

478


458

484

518

Ethanol 423

444

473

425

450

478

440

460

489

446

472

503


Hình 1.3. Phổ hấp thụ của lycopene (—), γ-caroten (- - -), β-caroten
( ) và α-caroten ( ) trong ete dầu hỏa

Hình 1.4. Phổ hấp thụ của hai dạng đồng phân trans- và cis-β-caroten
trong ete dầu hỏa
1.1.3 Tính chất hóa học
β-caroten là một dẫn xuất isopen chưa bão hòa, bền trong môi trường
kiềm và không bền môi trường. Nhờ có hệ thống nối đôi liên hợp β-caroten
có ái lực mạnh với oxy đơn bội nên dễ bị oxy hóa, đồng phân hóa khi tiếp
xúc với không khí, ánh sáng hay nhiệt độ.
β-caroten nhạy cảm với oxy, sự đồng phân hóa xảy ra dưới sự ảnh
hưởng bởi ánh sáng, nhiệt độ, và oxy. Vì vậy phải giữ ở điều kiện tránh ánh

6

sáng, bảo quản trong bao bì kín với nitro hoặc argon trong thời gian sử
dụng dài [23].
1.1.4. Hoạt tính sinh học và khả năng hấp thụ
a. Hoạt tính provitamin A.
Trong số các đồng phân của β-caroten, all- trans β-caroten chứa
100% hoạt tính, trong khi các đồng phân cis chỉ chiếm khoảng 50% hoạt
tính hoặc nhỏ hơn. Việc cắt tại trung tâm hoặc phá vỡ cấu trúc tại 1 đầu của
phân tử có thể chuyển đổi beta-caroten thành provitamin A. Việc chuyển
đổi của β- caroten diễn ra trong niêm mạc ruột bởi enzyme β- caroten
dioxygenase, sản xuất ra 2 phân tử của võng mạc, sau đó trở thành vitamin
A [20].
Hoạt tính sinh học của β-caroten phụ thuộc vào tính chất vật lý của
nó trong thực phẩm. Chế độ ăn uống cùng với thực vật và chất béo sẽ làm
tăng khả năng hấp thụ. Trong dạ dày, β-caroten có xu hướng tổng hợp cùng

caroten có thể hấp thụ năng lượng của oxy nguyên tử rồi giải phóng năng
lượng ấy dưới dạng nhiệt vô hại [20].
O
2
+ β-caroten→ β-caroten* + β-caroten* → β-caroten + Q(vô hại)
Lợi ích sức khỏe
β-caroten là một nguồn provitamin A phong phú trong thức ăn để
giúp phòng ngừa thiếu vitamin A. Vitamin A đóng vai trò quan trọng trong
nhiều bộ phận của cơ thể, như hệ thống miễn dịch, thị giác, cơ quan sinh
sản, … β- caroten đã được công nhận là hợp chất chống ung thư [20].
Dựa trên các nghiên cứu, người ta đã kết luận rằng cùng với vitamin
C, E, đồng, mangan, β-caroten có vai trò quyết định đến sự ngăn ngừa,
chống lại các gốc tự do (các chất tự do kém bền và hoạt động mạnh, có khả
năng kết hợp với các phân tử khác, đặc biệt là lipid và gây nên phản ứng

8

dây chuyền nguy hiểm đối với tế bào và là nguồn gốc của các căn bệnh như
tim mạch, quá trình lão hóa, giảm trí nhớ, ung thư…).
Đối với động vật có vú, β-caroten giữ chức năng sinh học quan
trọng trong quá trình phát triển các thể như: phát triển thị giác, vị giác, tăng
đáp ứng miễn dịch, tăng sự sinh sản và tạo tinh trùng. Tác động chủ yếu
của β-caroten không chỉ là chống oxy hóa mà còn trao đổi thông tin từ tế
bào này đến tế bào khác, tác động tới cấu trúc và chức năng của màng tế
bào, tăng cường sự đáp ứng miễn dịch của cơ thể. Chính vì vậy β-caroten
được xác định là chất điều hòa dinh dưỡng.
Đặc biệt, β-caroten không độc đối với cơ thể khi sử dụng ở liều
lượng cao và kéo dài, trong khi nếu ta sử dụng vitamin A kéo dài và với
liều cao thì sẽ gây rối loạn thị giác, rối loạn chức năng gan. Nguyên nhân
chính là do cơ thể chuyển hóa β-caroten thành vitamin A khi có nhu cầu.

Về thành phần dược phẩm : β-caroten tinh khiết được sử rộng rãi
trong các sản phẩm dược phẩm như các vitamin dạng viên. Nó còn là thành
phần kết hợp trong các loại thuốc chống chống ung thư và hỗ trợ điều trị ung thư
[8].

10

1.2 Tổng quan về tảo Dunaliella :
1.2.1. Nguồn gốc
Lĩnh giới (Domain) Eukaryota Woese, 1980 – Sinh vật nhân thật
Giới (Kingdom) Phantae Haecket, 1866 – Thực vật
Giới phụ (Subkingdom) Viridaeplantae Cavalier – Smith, 1981-
Thực vật lục
Ngành (Phylum hay Division) Chlorophyta A. Pascher, 1914
-
Tảo lục
Lớp (Class) Chlorophyceae Wille, 1884 – Tảo lục
Bộ (Order)Volcocales Oltmanns, 1904
Họ (Family) Dunaliellaceae T.Christensen, 1967
Chi (Genus) Dunaliella E.C. Teodoresco, 1904
Loài (Species) Dunaliella sp. Teodoresco, 1905
1.2.2 Đặc điểm hình thái, cấu trúc tế bào.
a. Đặc điểm hình thái.
Đầu thế kỷ 18, các nhà khoa học cho rằng Dunaliella giống với
Haematococcus, nhưng nửa sau thế kỷ 19, họ tìm ra rằng chi này khác biệt
với Haematococcus và đặt tên mới là Dunaliella [12]. Cho đến nay, 28 loài
Dunaliella đã được công nhận (Hình 1.5). Chúng bao gồm năm loài (từ
mẫu 1-5 ở Hình 1.5) sống trong nước ngọt và hiếm khi xuất hiện, trong khi
đó 23 loài trong số này (từ mẫu 6-28 ở Hình 1.5) có mặt trong môi trường
mặn [12].

Có kích thước 5,0-29,0µm chiều dài x 2,5 – 21,0 µm chiều rộng. Các tế bào
của một loài nhất định có thể thay đổi hình dạng khi điều kiện môi trường
thay đổi, thường trở thành hình cầu trong các điều kiện bất lợi. Kích thước

13

tế bào cũng có thể khác nhau tùy theo điều kiện sinh trưởng và cường độ
ánh sáng [10]. Tế bào có 2 roi đều nhau, và thường chuyển động đồng thời.
Hai lông roi được gắn trên đầu. Cấu trúc của lông roi rất phức tạp. Lông roi
có thể gốc. Hai thể gốc gần nhau ở hướng 1/7 giờ và mang vi ống gốc lông
roi. Các góc được hình thành giữa hai sợ lông roi thường từ 90-130
o
và
dường như không đổi chiều. Chúng được kết nối với nhau bởi một ngoại
biên và 2 sợi tơ ở gần tâm. Cũng có thể có thêm 2 thể gốc không kết nối
với lông roi. Hệ thống vi ống gốc lông roi chéo chữ thập và ở dạng X-2-X-
2. Lục lạp đơn chiếm hầu hết thể bào. Nó có dạng chén, đĩa, hoặc dạng
chuông và có vùng đậm đặc có chứa nhân tinh bột hay nhân protein
(pyrenoid). Trong lục lạp có các thể đặc biệt gọi là hạt tạo bột (pyrenoid),
là những thể protein hình cầu hay có góc, xung quanh tập trung các hạt tinh
bột hay hydrat cacbon là chất dự trữ chính của Dunaliella. Lục lạp đôi khi
được rạch thành nhiều thùy. Các cụm thylacoid được cho là có liên quan
đến sự sinh trưởng của tế bào trong điều kiện ánh sáng mạnh và nồng độ
muối cao. Hạt tinh bột thường bao quanh pyrenoid, nhưng cũng có thể
được tìm thấy tại các nơi khác của lục lạp. Ở một số loài (D. salina, D.
parva) thể lạp cũng có thể tích lũy một số lượng lớn β-caroten trong các
giọt dầu ở khoảng trong màng thylacoid, vì vậy tế bào thường có màu cam
đỏ hơn là màu xanh. Hạt β-caroten của D. salina chỉ có các giọt mỡ trung
tính, hơn một nửa trong số đó là β-caroten. Phần lớn các dạng màu đỏ sẽ
mất màu trong điều kiện ánh sáng yếu [35].

vỡ. Giảm phân xảy ra trong suốt quá trình nảy mầm của hợp tử.
Hình dạng tế bào có thể bị ảnh hưởng bởi mức độ thay đổi của điều
kiện sinh trưởng. Những thay đổi rõ rệt có thể xảy ra giữa pha logarit và
pha cân bằng. Nồng độ muối, cường độ ánh sáng và nhiệt độ sẽ có ảnh
hưởng lên cấu trúc của thylacoid, pyrenoid và mạng lưới nội chất. Trước
đây, Dunaliella và một số loài có roi không có thành tế bào được phân loại
vào họ Polyblepharidaceae trong bộ Volvocales. Tuy nhiên sau này những

15

nghiên cứu chi tiết hơn trên nhiều loài có roi màu xanh đã dẫn đến việc
phân loại lại các chi này vào taxon khác. Dunaliella được phân thành một
chi riêng của họ Chlorophyceae. Mặc dù thiếu thành cứng, Dunaliella cũng
mang nhiều đặc điểm chung với họ Chlamydomonadales [12]. Hình 1.7 : Tế bào Dunaliella maritime
Hình 1.8 : Tế bào Dunaliella salina
Tên loài : Dunaliella maritime
Masjuk 1973[41].
Chiều dài : 7 - 12µm
Roi : 2 roi, dài từ 1,5 - 2 lần chiều dài
tế bào
Lục lạp : vàng xanh
Tên loài : Dunaliella salina
Teodoresco 1905[41].
Chiều dài : 16 – 24 µm

Lục lạp : vàng xanh
Tên loài : Dunaliella tertiolecta
Butcher 1959[41].
Chiều dài : 9 – 11µm
Roi : 2 roi, dài từ 1,5 - 2 lần chiều dài
tế bào
Lục lạp : vàng xanh

17

Vitamin
Dunaliella chứa một loạt các chất dinh dưỡng bao gồm cả vitamin
E, cobalamin (vitamin B12) và provitamin A.Vitamin A đóng vai trò thiết
yếu cho thị lực, sự tăng trưởng, sinh sản và sự điều khiển hệ thống miễn
dịch. Nó cũng giúp duy trì sức khỏe của da và niêm mạc. Cobalamin là cần
thiết cho sự chuyển hóa năng lượng, chức năng miễn dịch và chức năng
thần kinh.[40]
Các axit béo thiết yếu (EFAs)
Dunaliella chứa EFAs với hàm lượng cao giúp làm giảm mức
cholesterol và chất béo trong máu, ngăn ngừa bệnh tim, giảm viêm trong
viêm khớp, cải thiện chức năng miễn dịch và não, hỗ trợ sức khỏe sinh sản
và kinh nguyệt. Những chất béo, bao gồm cả Omega 3, Omega 6, axit
linoleic và alpha linoleic axit là rất cần thiết cho việc hấp thu các caroten,
vitamin E và chất béo, chất dinh dưỡng hòa tan khác [40].
Amino axit
Dunaliella có chứa hàm lượng axit amin cao. Axit amin là những vật
liệu xây dựng cơ bản của chất sống, cần thiết cho sự tổng hợp của cơ bắp,
da và mô liên kết, hormon, các enzyme và chất dẫn truyền thần kinh
(neurotransmitter) [40].