BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO
TRƯỜNG ĐẠI HỌC NHA TRANG
KHOA CÔNG NGHỆ THỰC PHẨM
TRẦN THỊ DIÊN PHÂN LẬP VI KHUẨN GÂY BỆNH THỐI ƯỚT
(ERWINIA SPP.) TRÊN CÀ CHUA
NGUYÊN LIỆU SAU THU HOẠCH

ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC
NGÀNH CÔNG NGHỆ THỰC PHẨM
Nha Trang - 2013

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO
TRƯỜNG ĐẠI HỌC NHA TRANG

sự ủng hộ, giúp đỡ từ gia đình, thầy cô và bạn bè. Tôi xin chân thành cảm ơn:
Gia đình đã động viên và tạo mọi điều kiện tốt nhất cho con trong suốt
những năm con đi học.
Ban Giám hiệu Trường Đại học Nha Trang, Khoa Công nghệ Thực
phẩm và các thầy cô giáo đã tận tình dạy dỗ, dìu dắt và truyền đạt cho chúng
em nhiều kiến thức bổ ích.
Cô Phạm Thị Đan Phượng, thầy Trang Sĩ Trung đã tận tình hướng dẫn,
giúp đỡ em trong suốt thời gian thực tập tốt nghiệp.
Thầy Nguyễn Công Minh, thầy Hoàng Ngọc Cương đã hướng dẫn,
giúp đỡ, hỗ trợ kinh phí cho em trong suốt thời gian làm đề tài.
Cô Nguyễn Minh Nhật (Viện Công nghệ Sinh học và Môi trường) và
cô Trần Thị Hiền Mai (Khoa Chế biến) đã nhiệt tình giúp đỡ, tạo điều kiện tốt
nhất cho em.
Các bạn lớp 51CBTP2 cùng các bạn làm tại phòng Chế biến 3, phòng
Công nghệ Sinh học đã động viên, hỗ trợ tôi trong thời gian làm đề tài.
Tôi xin chân thành cảm ơn!

Khánh Hòa, tháng 6 năm 2013 Trần Thị Diên
ii
MỤC LỤC
Trang
LỜI CẢM ƠN i
MỤC LỤC ii
DANH MỤC BẢNG iv

3.1. Kết quả khảo sát bệnh thối ướt trên cà chua tại các chợ đầu mối ở thành
phố Nha Trang 22
3.2. Kết quả phân lập vi khuẩn Erwinia spp. gây bệnh thối ướt trên cà chua sau
thu hoạch và kết quả quan sát hình thái khuẩn lạc, tế bào vi khuẩn 24
3.3. Kết quả xác định khả năng gây hư hỏng của vi khuẩn Erwinia spp.
bằng phương pháp gây bệnh nhân tạo 28
KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 37
TÀI LIỆU THAM KHẢO 39 iv
DANH MỤC BẢNG
Trang
Bảng 2.1. Bảng khảo sát bệnh thối ướt trên cà chua sau thu hoạch tại các
chợ đầu mối ở thành phố Nha Trang 14
Bảng 3.1. Bảng kết quả khảo sát bệnh thối ướt trên cà chua sau thu
hoạch tại các chợ đầu mối ở thành phố Nha Trang 22
Bảng 3.2. Bảng quan sát đặc điểm khuẩn lạc, tế bào của các chủng vi khuẩn 24
Bảng 3.3. Bảng theo dõi khả năng gây hư hỏng của vi khuẩn Erwinia spp 29
27
Hình 3.4. Hình thái tế bào của chủng Er
13
27
Hình 3.5. Hình thái tế bào của chủng Er
14
27
Hình 3.6. Hình thái tế bào của vi khuẩn Erwinia chrysanthemi 28
Hình 3.7. Cà chua bị bệnh thối ướt do chủng Er
12
gây ra 34
Hình 3.8. Cà chua của chủng Er
12
cắt đôi sau 2 ngày gây bệnh 34
Hình 3.9. Cà chua bị bệnh thối ướt do chủng Er
14
gây ra 34
Hình 3.10. Cà chua của chủng Er
14
cắt đôi sau 4 ngày gây bệnh 35
Hình 3.11. Cà chua đối chứng có tạo vết thương 36
Hình 3.12. Cà chua của chủng ĐC
c
cắt đôi sau 4 ngày gây bệnh 37
Hình 3.13. Cà chua đối chứng không tạo vết thương 37
Hình 3.14. Cà chua của chủng Đc
k
cắt đôi sau 4 ngày gây bệnh 37

vi

Er
8
: ký hiệu chủng vi khuẩn thứ 8
Er
9
: ký hiệu chủng vi khuẩn thứ 9
Er
10
: ký hiệu chủng vi khuẩn thứ 10
Er
11
: ký hiệu chủng vi khuẩn thứ 11
Er
12
: ký hiệu chủng vi khuẩn thứ 12
Er
13
: ký hiệu chủng vi khuẩn thứ 13
Er
14
: ký hiệu chủng vi khuẩn thứ 14

ĐC
c
: ký hiệu mẫu đối chứng có vết rạch
ĐC
k
: ký hiệu mẫu đối chứng không có vết rạch
cây trồng, đó chính là cà chua.
Đề tài gồm một số nội dung sau:
- Tìm hiểu về bệnh thối ướt trên cà chua sau thu hoạch, về vi khuẩn Erwinia spp.
- Khảo sát bệnh thối ướt trên cà chua tại các chợ đầu mối ở thành phố
Nha Trang.
- Phân lập vi khuẩn gây bệnh thối ướt (Erwinia spp.) trên cà chua sau
thu hoạch.
- Xác định hình thái và đặc điểm tế bào của một số chủng vi khuẩn gây bệnh.
- Xác định khả năng gây hư hỏng của vi khuẩn bằng phương pháp gây bệnh
nhân tạo.
Tuy đã cố gắng rất nhiều nhưng trong quá trình thực hiện vẫn còn thiếu sót,
rất mong sự đóng góp ý kiến của quý thầy cô, bạn bè để đề tài này hoàn chỉnh hơn. 3
Chương 1. TỔNG QUAN

1.1. Tổng quan về cà chua

- Cà chua chín có hàm lượng solanin khoảng 8%.
5. Sắc tố
Trong cà chua có nhóm sắc tố thuộc nhóm carotenoid như: caroten,
lycopen, xantophyl. Quả cà chua xanh còn có chlorophyll. Tùy theo mức độ
chín mà sắc tố tăng dần nên màu của quả đậm hơn.
6. Vitamin
Trong cà chua chứa nhiều vitamin [4], [12], [33], gồm có:
- Vitamin C chiếm khoảng 20 – 40 (mg%).
- Vitamin B
1
chiếm khoảng 0,08 – 0,15 (mg%).
- Vitamin B
2
chiếm khoảng 0,05 – 0,07 (mg%).
- Vitamin PP chiếm khoảng 0,5 – 16,5 (mg%).
1.1.3. Tác dụng của cà chua
Trong cà chua có sắc tố lycopen cùng với caroten vừa ngăn chặn tế bào
ung thư vừa chống sự hình thành các cục máu đông trong thành mạch nên
giảm nguy cơ mắc bệnh tim mạch, chống lại các bệnh thoái hóa thần kinh và
bệnh liên quan đến tiểu đường. Lycopen được xem là chất chống oxy hóa
mạnh, có khả năng hóa giải các gốc tự do, ngăn chặn tế bào ung thư [3], [33].
Cà chua chứa vitamin C, B
1
, B
6
, PP, lycopen, β-caroten, chất khoáng
dễ hấp thu, giúp cho cơ thể tăng cường khả năng miễn dịch, phòng chống
nhiễm trùng [4], [10], [33]. Ngoài ra trong cà chua, hàm lượng đạm, đường,
chất béo có rất ít nên cà chua được xem là một loại thực phẩm nghèo năng
lượng (khoảng 35 calorie [33]) dành cho người béo phì. Cà chua có tính bình,

C – 3
o
C trong 1 ngày.
Khi bảo quản cà chua trong kho, yêu cầu của kho cần thoáng, sạch sẽ,
cao ráo, nên sử dụng kho lạnh để bảo quản cà chua trong thời gian dài.

6
Một số cách bảo quản cà chua:
1. Bảo quản ở nhiệt độ thường
Cà chua sau khi thu hoạch có thể đưa vào phòng mát, thoáng khí và có
độ ẩm thích hợp. Bảo quản ở nhiệt độ thường nhằm kéo dài mức độ tươi của
cà chua trước khi đưa vào chế biến, tiêu thụ [4], [10], [12].
2. Bảo quản lạnh
Cà chua nên bảo quản lạnh dưới 16
o
C [33] để giảm hư hỏng và ngăn
quá trình giảm chất lượng. Đây là cách bảo quản phổ biến nhất [4], [10], [12],
[33].
3. Bảo quản cà chua trong môi trường không khí thay đổi
Bảo quản trong môi trường không khí thay đổi là bao cà chua trong
các vật liệu chắn khí, trong đó môi trường khí được thay đổi để ức chế tác
nhân gây hư hỏng, nhờ đó có thể duy trì chất lượng và kéo dài thời hạn sử
dụng. Bảo quản bằng phương pháp này có thể kéo dài thời gian bảo quản của
cà chua từ 15 đến 20 ngày ở nhiệt độ từ 10 – 20
o
C, ở nhiệt độ thường có thể
bảo quản khoảng từ 3 đến 4 ngày [4], [10], [12], [33].
Có 2 phương pháp bảo quản đó là bảo quản trong túi màng mỏng và tạo
màng:
- Phương pháp bảo quản trong túi màng mỏng: Rau quả được đựng

Trong quá trình bảo quản trong kho, bệnh thối ướt có thể phát sinh
nhưng mức độ bị bệnh nặng hay nhẹ phụ thuộc vào nhiều yếu tố, trong đó yếu
tố nhiệt độ, độ ẩm và chất lượng cà chua giữ vai trò quyết định. Khi bề mặt
quả bị ẩm, không khí trong kho lưu thông kém hoặc bề mặt quả bị tổn thương
thì vi khuẩn sẽ xâm nhập và gây hư hỏng.

8

Hình 1.1. Cà chua bị bệnh thối ướt
1.2. Vi khuẩn Erwinia spp. gây bệnh thối ở cà chua
1.2.1. Phân loại
Vi khuẩn Erwinia spp. thuộc:
Giới (Kingdom) : Bacteria
Ngành (Phylum) : Proteobacteria
Lớp (Class) : Gamma-Proteobacteria
Bộ (Order) : Enterobacteriales
Họ (Family) : Enterobacteriaceae
Giống (Genus) : Erwinia
1.2.2. Đặc điểm vi khuẩn
Erwinia là loài vi khuẩn có họ hàng với Enterobacteriaceae, được chia
thành hai nhóm: nhóm gây bệnh thối mềm và nhóm gây bệnh héo ở cây trồng
[5]. Chi Erwinia bao gồm chủ yếu là các loài vi khuẩn gây bệnh thực vật,
được gọi tên theo nhà vi khuẩn thực vật học đầu tiên là Erwin Frink Smith. Vi
khuẩn Erwinia có 3 loài là amylovora, herbicola và carotovora. Trong đó có
một số vi khuẩn thường gặp là Erwinia carotovora ssp. carotovora, Erwinia
carotovora ssp. atroseptica, Erwinia chrysanthemi [23], [32], [34], [38]. Đây
là chi vi khuẩn Gram âm có quan hệ gần với Escherichia coli, Shigella,
Salmonella và Yersinia [1], [24], [37].

9

Endoglucanase có khả năng phá vỡ cellulose trong thành tế bào của cây chủ.
Pectinase có khả năng phân hủy pectin trong thành tế bào thực vật, gây tổn
thương tế bào và làm mô bị mềm nhũn [8], [18], [24], [31].
Vi khuẩn thường xâm nhập vào thực vật thông qua lỗ tự nhiên như khí
khổng, lỗ vỏ, thân, rễ hoặc qua các vết thương do xây xước, côn trùng [18].
Khi vi khuẩn xâm nhập vào vết thương của quả cà chua, chúng sẽ sinh trưởng
và nhân lên, sản sinh ra các enzyme phá vỡ thành tế bào, làm mềm mô và
chảy dịch. Dịch bào chảy ra lại cung cấp chất dinh dưỡng cho vi khuẩn phát
triển. Vi khuẩn tiếp tục di chuyển, tiết ra emzyme và gây thối nhũn quả cà

10
chua. Khả năng gây bệnh của vi khuẩn Erwinia spp. phụ thuộc 3 yếu tố: độc
lực, số lượng vi khuẩn và đường xâm nhập [6], [7], [13]. Độc lực của vi
khuẩn là năng lực gây bệnh của vi khuẩn. Số lượng vi khuẩn ban đầu phải đủ
lớn thì mới có khả năng gây bệnh. Cuối cùng, vi khuẩn phải xâm nhập đúng
con đường và đường xâm nhập phải thích hợp như vết thương, chỗ dập nát
trên quả.
Một số vi khuẩn gây bệnh cho người như Salmonela, Shigella,
Escherichia, Listeria có thể tồn tại trên bề mặt quả cà chua tươi và chúng có
thể nhân lên trong điều kiện thích hợp [24], [27], [37]. Khi vi khuẩn Erwinia
spp. bắt đầu gây bệnh thối ướt thì sẽ làm pH tăng nhẹ, tạo điều kiện thuận cho
một số vi khuẩn gây bệnh thực phẩm hoạt động như Salmonela, Shigella [1],
[18], [19]. Các quả cà chua bị bệnh thối ướt còn có một số loài nấm sẽ sinh
sống và phát triển, trong đó có nấm mốc. Nấm mốc có trong quả cà chua sẽ
sinh ra một số độc tố có hại cho cơ thể con người. Vì vậy, để đảm bảo an toàn
thực phẩm thì cần loại bỏ những quả đã hư, mềm nhũn, chảy dịch, có mùi thối
nhằm tránh lây lan bệnh thối ướt cho các quả tươi và ngăn chặn khả năng
nhiễm bệnh từ thực phẩm.
1.2.3. Một số nghiên cứu trong và ngoài nước về vi khuẩn Erwinia spp.
Trên thế giới:

hiện vi khuẩn Erwinia carotovora subsp. carotovora trên cây địa lan bằng
phương pháp PCR. Hai nghiên cứu trên cho thấy vi khuẩn Erwinia spp. là
nguyên nhân gây bệnh thối ướt cho cây cảnh. Ngoài ra, các nghiên cứu còn
chỉ ra hình thái khuẩn lạc của vi khuẩn Erwinia spp. trên mỗi môi trường
nuôi cấy. 12
Chương 2. ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.1. Đối tượng nghiên cứu
2.1.1. Cà chua
Cà chua dùng để gây bệnh: Quả có màu đỏ tươi, vỏ căng bóng, mùi cà
chua đặc trưng, tỷ lệ thịt quả nhiều, cấu trúc cứng. Cà chua nguyên liệu được
mua tại chợ Đầm – Nha Trang, được thu, hái, vận chuyển từ Đà Lạt.

Hình 2.1. Cà chua dùng để gây bệnh
Cà chua bị bệnh: Quả có màu đỏ, trên bề mặt quả vỏ bị nứt, có vết nhũn
mềm, có thể xuất hiện nấm mốc và bị chảy dịch. Quả cà chua được lấy tại chợ
Đầm- Nha Trang, được thu, hái, vận chuyển từ Đà Lạt.

Hình 2.2. Cà chua nguyên liệu bị bệnh thối ướt

13
2.1.2. Vi khuẩn Erwinia spp.
Các chủng vi khuẩn Erwinia spp. gây bệnh trên cà chua sau thu hoạch.
2.1.3. Hóa chất, môi trường
Môi trường PGA
- Khoai tây : 200g
- Glucose : 20g

Định kỳ
nhập cà
chua
(ngày)
Thời
gian
lưu trữ
(ngày)
Đi
ều kiện
bảo quản

Tổng sản
lượng
(kg)
Sản phẩm
bị hỏng
(kg)
Sản phẩm
hỏng do
thối ướt
(kg) 2.2.2. Sơ đồ bố trí thí nghiệm tổng quát
- Tiến hành bào gây bệnh nhân tạo và theo dõi diễn biến của bệnh.
- Xác định chủng vi khuẩn Erwinia spp.
2.2.3. Sơ đồ bố trí thí nghiệm phân lập vi khuẩn gây bệnh thối ướt ở cà chua Hình 2.4. Sơ đồ bố trí thí nghiệm phân lập vi khuẩn gây bệnh thối ướt
Rửa cồn 70
o


Ủ (37
o
C, 24h)

10
-
5

10
-
4

10
-
3

Cà chua b
ị bệnh

C
ồn 70
o

Ủ (24h)
Ủ (37
o
C, 24h)16

, hơ qua ngọn lửa đèn cồn để khử
trùng và cháy hết cồn ở đầu que cấy. Để đầu que cấy trang nguội trong không
gian vô trùng của ngọn lửa.
Mở đĩa petri, đặt nhẹ nhàng que cấy lên bề mặt thạch của đĩa petri.
Dùng đầu que cấy trải đều dịch vi khuẩn lên bề mặt thạch.
- Sau khi cấy xong, chờ bề mặt thạch khô, tiến hành bao gói, lật ngược
đĩa, ủ ở 37
o
C, thời gian 24 giờ.
- Cấy ria trên đĩa chứa môi trường PGA.
Dùng que cấy ria đã vô trùng gạt lấy một ít khuẩn lạc trên bề mặt thạch.

17
Ria các đường trên đĩa petri chứa môi trường thạch thích hợp. Sau mỗi
đường ria liên tục, đốt khử trùng que cấy và làm nguội trước khi thực hiện
đường ria tiếp theo.
- Tiến hành bao gói, lật ngược đĩa, ủ ở nhiệt độ 37
o
C và thời gian 24 giờ.
- Hơ que cấy ria đã vô trùng qua ngọn lửa đèn cồn, để nguội rồi gạt lấy
một ít khuẩn lạc trên bề mặt thạch. Đặt nhẹ đầu que cấy chứa vi khuẩn lên bề
mặt môi trường ở đáy ống, sau đó cấy theo hình chữ chi từ đáy ống nghiệm
lên đến đầu trên của mặt thạch nghiêng.
- Sau khi cấy xong đặt các ống nghiệm vào giá đỡ rồi đem ủ ở 37
o
C
trong 24 giờ.
2.2.4. Sơ đồ bố trí thí nghiệm quan sát khuẩn lạc và tế bào vi khuẩn
Cấy ria trong ống nghiệm
Môi trường
PGA
Ủ (37
o
C, 24h)
Cà chua bị bệnh
Quan sát khuẩn lạc

Quan sát tế bào vi khuẩn
Nhuộm đơn
Nhuộm gram