LỜI CẢM ƠN
Tôi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới TS. Lâm Đại Nhân đã tận
tình hướng dẫn, giúp đỡ tôi trong suốt quá trình thực hiện đề tài.
Tôi cũng xin bày tỏ lòng biết ơn chân thành tới GS.TS. Lê Trần
Bình, PGS.TS. Chu Hoàng Hà đã tạo điều kiện giúp đỡ và đóng góp
những ý kiến quý báu để tồi hoàn thành bản luận văn.
Tồi xin bày tỏ lòng biết ơn tới các thầy, cồ trong Ban Giám Hiệu
trường ĐHSP Hà Nội 2, Ban Chủ nhiệm khoa Sinh - KTNN trường
ĐHSP Hà Nội 2, Phòng Tổ chúc cán bộ, Phòng
Sau đại học trường ĐHSP Hà Nội 2 đã tạo mọi điều kiện trong thời
gian tôi học tập chương trình thạc sĩ.
Trong thời gian thực tập tôi cũng nhận được sự giúp đỡ tận tình
của Th.s. Đặng Thị Hương, Tập thể cán bộ Phòng Công nghệ tế bào
thực vật, Viện Công nghệ sinh học. Nhân dịp này tồi xin chân thành
cảm ơn sự giúp đỡ quý báu đó.
Tôi xin chân thành cảm ơn gia đình và bạn bè những người đã
luôn động viên, góp ý cho tôi trong thời gian qua.
MỤC LỤC
2Hà Nội, tháng 10 năm 2010
La Việt Hồng
LỜT CẢM ƠN
LỜI CAM ĐOAN
MỤC LỤC
DANH MỤC BẢNG
DANH MỤC HÌNH
DANH MỤC TÙ VIÉT TẮT
MỞ ĐẦU 1
1. Tính cấp thiết của đề tài 1

1.3.6. K
ỷ thuật xác định trình tự nucleotide 19
1.3.7. X
ử lí số liệu 20
CHƯƠNG 2. VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNGPHÁPNGHIÊN cứu 22
2.1. Vật liệu nghiên cứu 22
2.1.1. V
ật liệu thực vật 22
2.1.2. H
4óa chất và thiết bị 22
2.2. Phương pháp nghiên cứu 23
2.2.1. S
ơ đồ thí nghiệm 23
2.2.2. P
hương pháp nghiên cứu 23
CHƯƠNG 3. KÉT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 31
3.1. Thiết kế mồi 31
3.2. Tách RNA tổng số 32
3.3. Nhân dòng các đoạn gen 33
3.4. Tách dòng gen và xác định trình tự gen 34
3.4.1. Tạo plasmide tái tô hợp 34
3.4.2. Biến nạp vector tái tố hợp vào tế bào khả biến E.colỉ DH5a 35
3.4.3. Chọn lọc plasmide tái tô hợp băng phương pháp colony-PCR 36
3.4.4. Tách plasmide và cắt kiếm tra gen bang enzyme giới hạn 37
3.4.5. Xác định trình tự các đoạn A, F, p của CTV ở các mẫu CT, HG, 38 HN
và VL
KÉT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 45

DANH MỤC HÌNH
6Hình 3.2. Ket quả điện di sản phấm RT-PCR trên gel agarose 0,8%; M: marker
lkb Hình 3.3. Ket quả điện di kiếm tra sản phẩm tinh sạch PCR; M: Marker 1 kb
Hình 3.4. Sơ đồ cấu tạo vector pBT
Hình 3.5. Khuẩn lạc màu xanh trắng sau khi nuôi qua đêm ở 37°c trên môi trường
LB đặc
Hình 3.6. Ket quả điện di sản phâm colony-PCR với cặp mồi pƯClB trên gel
agarose 1% các mẫu CT, HG, HN và VL, M: Marker 1 kb
Hình 3.7. Ket quả điện di kiếm tra sản phâm cắt plasmide pBT tái tô hợp bằng
enzyme giới hạn đối với mẫu HG, HN, CT và VL; M: Marker 1 kb
Hình 3.8. Ket quả so sánh trình tự nucleotide đoạn A giữa các mẫu CT, HG. HN và
Hình 3.9. Cây phát sinh chủng loại xây dựng trên cơ sở so sánh trình tự đoạn gen
A của CT, HG, HN và VL với các trình tự tương ứng công bố trên GenBank
Hình 3.10. Ket quả so sánh trình tự nucleotide đoạn F giữa các mẫu CT, HG, HN
và VL
Hình 3.11. Cây phát sinh chủng loại xây dựng trên cơ sở so sánh trình tự đoạn
gen F của CT, HG, HN và VL với các trình tự tương ứng công bố trên GenBankHình 3.12. Kết quả so sánh trình tự nucleotide đoạn p giữa các mẫu CT, HG, HN
và VL
Hình 3.13. Cây phát sinh chủng loại xây dựng trên cơ sở so sánh trình tự đoạn gen
p của CT, HG, HN và VL với các trình tự tương ứng công bố trên GenBank
|jg microgram
pl microlitre
[Jĩn micrometer
bp base pair

nm Nanometer
ORF Open reading frames - khung đọc mở
PNAS Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States
of America (Kỷ yếu Viện Khoa học Quốc gia Hoa Kỳ)
PCR Polymerase Chain Reaction (Phản ứng chuồi polymerase)
PCS Polycloning site - vùng nhân dòng đa điêm cắt
PMF Polymethoxylated flavones
RNA Ribonucleic acid
RNase Ribonuclease
RT- PCR Reverse transcription polymerase chain reaction (phản ứng PCR phiên
mă ngược)
TAE Tris - Acetate - EDTA
Taq Thermus aquatic us
v/p vòng/phút
VL VTnh Long (mẫu thu tại tỉnh VTnh Long)
X-gal 5-brom-4-chloro-3-indolyl-P"D-galactosidase
DANH MỤC TÙ VIÉT TẤT
9MỞ ĐẦU
1. Tính cấp thiết của đề tài
Cây có múi (CCM) là tên gọi chung của nhóm cây cam, quýt, bưởi, chanh cùng họ
Rutaceae [45]. CCM giữ một vị trí quan trọng trong các loạicây ăn quả vì đây là loại cây có giá trị dinh dưỡng cao, có hương vị thơm ngon, được
nhiều người ưa dùng. Sản phẩm của CCM được sử dụng với nhiều mục đích khác
nhau như để ăn tươi, vắt lấy nước uống, lấy mùi vị, chế biến thức ăn, làm mứt, chế
biến nước giải khát, làm hương liệu

chủng virus được chính xác. Bcn cạnh đó còn có ý nghĩa quan trọng trong việc
nghiên cứu tạo cây chuyển gen kháng virus.
3. Nhiệm vụ nghiên cứu
- Xác định trình tự 3 đoạn gen của 4 dòng virus gây bệnh trên CCM ở các tỉnh Hà
Giang, Hà Nội, cần Thơ và Vĩnh Long.
- Cây phân loại về sự đa dạng di truyền các đoạn gen của các dòng virus trên.
4. Đối tượng và phạm vi nghiên cứu
- Đối tượng: 4 mẫu lá nhiễm các dòng virus Citrus Tristeza thu tại các tỉnh Hà
Giang, Hà Nội, cần Thơ và Vĩnh Long.
- Phạm vi: xác định trình tự nucleotide 3 đoạn gen của mỗi dòng virus, xây dựng cây
phân loại về sự đa dạng di truyền của 4 dòng virus nghiên cứu.
CHƯƠNG 1. TỎNG QUAN TÀI LIỆU
1.1. Nguồn gốc, phân bố và giá trị của cây có múi
CCM thuộc họ Rutaceae và có khoảng 150 chi và 1500 loài được trồng ở vùng
nhiệt đới và bán nhiệt đới [43], [45]. CCM phát sinh từ vùng Đông Nam Châu Á,
trong đó sự phát triển của một số loài cam quýt được kéo dài từ biên giới Đông Bắc
của Ấn Độ qua Myanma và một số vùng phía nam của Đảo Hải Nam. Những loài này
bao gồm: chanh tây, chanh ta, thanh yên, bưởi, cam ngọt, cam chua [6].
Hiện nay CCM được trồng khắp nơi trên thế giới trong vùng khí hậu nhiệt đới
và Á nhiệt đới. Những vùng trồng phân bố từ vĩ độ 35° Nam đến Bắc, những vùng
thương mại chính là Á nhiệt đới tại vĩ độ cao hơn 20° Nam hay Bắc của xích đạo. Ớ
Việt Nam, CCM được trồng từ Bắc tới Nam. Riêng Đồng bằng sông Cửu Long, CCM
hiện diện tập trung ở các tỉnh Tiền Giang, Vĩnh Long, Đồng Tháp và cần Thơ với các
chủng loại đặc sản như bưởi năm roi, bưởi da xanh, quýt tiều, quýt đường, cam mật,
12cam dây, cam sành [6].
Cây ăn quả có múi là một loại cây ăn quả lâu năm, nhanh cho thu hoạch, một
số loài có thể cho thu hoạch quả vào năm thứ 2 sau khi trồng. Ở nước ta, 1 ha cam

lượng

(%)
Muối khoáng
(mg/100g)
Ca
p
Fe
Cam
87,5
0,5
0,5
8,4
1,4
43
34
23
0,4
Chan
h
87,5
0,5
0,3
3,6
1,3
18
40
22
0,6
Quýt

Nga bắt đầu thế kỷ 11, các loại quả CCM được sử dụng để phòng ngừa và chữa trị
bệnh y học trong nhân gian, ơ nước ta, nhân dân đã dùng cây lá và hoa quả các loại
cây ăn quả có múi đế phòng và chữa bệnh từ xa xưa, như vỏ quýt có tên dược liệu là
“trần bì”, được sử dụng nhiều trong một số bài thuốc y học cố truyền [1]. Nghiên cứu
mới đây của các nhà khoa học Hoa Kỳ cho thấy hợp chất được chiết xuất từ vỏ cam
quít có tên khoa học là polymethoxylated flavones (PMF) - là những yếu tố chống oxy
hóa tích cực thuộc nhóm flavonoid, có khả năng hạn chế gan xuất tiết loại cholesterol
độc hại LDL - gây ra các bệnh tim mạch [50]. Một thử nghiệm của các nhà khoa học
Israel (Học viện Công nghệ Technion) trên chuột cũng cho thấy tác dụng rất tốt của
dịch chiết từ vở quả cam, chanh, quýt có tác dụng chữa hen suyễn do dịch chiết này
có chứa limonene [50].
Bảng 1.2. Hàm lượng vitamin trong quả cam, chanh, quýt, bưởi (mg/100g)
Loại quả
Vitamin A
Vitamin BI
Vitamin B2
Vitamin pp
Vitamin c
Cam
0,30
0,08
0,03
0,20
48
Chanh
0,30
0,04
0,01
0,01
50


Bệnh héo và chết cây do nấm Clitocybe tabessens thường xảy ra trong
vườn trồng bưởi năm roi và quýt tiều. Triệu chứng biếu hiện qua hiện tượng
lá đọt héo như thiếu nước, khi bệnh nặng thường héo toàn cây, lá khô. Bệnh nặng
trong mùa nắng, bưởi năm roi là bị hại nặng nhất.
1.2.3. Bệnh vàng lá Greening
Là một bệnh gây thiệt hại nặng đến nền sản xuất CCM thế giới nhất là Châu
Phi và Châu Á. Ờ Trung Quốc người ta gọi là “Huanglongbing”, Nam Phi gọi là
Greening. Tuy chưa có một báo cáo chính thức thiệt hại của bệnh, nhưng ở
Philippines người ta đánh giá mức độ nhiễm lên đến 7 triệu CCM [8]. Thái lan có
khoảng 95% cây bị nhiễm bệnh ở các tỉnh phía Bắc và Đông [12], nhiều nước khác
cũng cho thấy thiệt hại của Greening. Ở Việt Nam, bệnh này cũng gây thiệt hại nặng
từ Bắc chí Nam. Có hai dòng chủ yếu gây bệnh này: dòng Châu Phi phát triển mạnh
15trong điều kiện nhiệt độ 20 - 25°c, dòng Châu Á phát triển cả trong điều kiện lạnh và
nóng (lên đến 35°C) [38]. Vi khuẩn Liberibacters gây bệnh Greening có thế nhiễm
trên tất cả CCM, cam mật, quýt và các dòng lai của quýt là nhiễm nặng nhất. Bưởi
chùm, chanh Rangpus, chanh núm và bưởi nhiễm ít hơn. Chanh giấy, cam ba lá và các
dòng lai có xu hướng chống chịu tốt hơn. Tuy nhiên, không có giống nào kháng lại
bệnh này cả.
Triệu chứng trên lá: sơ khởi với phiến lá biến màu vàng, nhưng kích thước lá
bình thường, đôi khi hình thành những đốm vàng. Những lá mới sau đó nhỏ hơn kích
thước bình thường và mọc thắng đứng, lá bị vàng như triệu chứng thiếu kẽm và sắt.
Ket quả phân tích lá cho thấy hàm lượmg kali cao, nhưng hàm lượng canxi, magie và
kẽm thấp [17], [24].
Triệu chứng trên quả: quả trên cây nhiễm bệnh trở nên nhỏ lại, biến dạng và có
vị đắng hơn, có thế do hàm lượng axit cao và hàm lượng đường giảm thấp. Quả
thường rụng sớm, những quả còn lại thường vẫn giữ được màu xanh [28], có thế vì lý

khỏi thân. Giảm năng suất và kích thước quả, cành trở nên giòn và dễ gãy.
• Gây lõm thân trên chanh tàu: cây vẫn sinh trưởng bình thường, thân chính và
cành bị quặc quẹo, khi bóc vỏ thân, phần gỗ bị lõm vào rất nhiều.
• Gây vàng nửa dưới quả gặp ở quýt đường: cây vẫn sinh trưởng và xanh tốt, tuy
nhiên khi quả đạt kích thước bằng quả bóng bàn thì quả bị vàng phần nửa dưới
lên cuống quả, quả rụng hàng loạt, gây thất thoát nặng cho nhà vườn.
Dịch bệnh gây thiệt hại cây với cây cam chua lần đầu tiên được báo cáo ở Nam
Phi trong những năm đầu của thế kỷ 20, và ở Argentina và Brazil trong thập niên 30
thế kỷ trước sau khi các nước này nhập khấu các CCM nhiễm bệnh và rệp truyền bệnh
Toxoptera citricida. Hơn 80 triệu cây ghép trên gốc cam chua (Citrus aurantium) đã
bị chết hoặc không sinh sản được bởi CTV. Các thiệt hại gây ra tại Argentina (hơn 10
17triệu cây), Brazil (hơn 6 triệu cây) và Hoa Kỳ (hơn 3 triệu cây) [14]. Chỉ riêng ở Tây
Ban Nha có hơn 40 triệu cây, chủ yếu là cam ngọt (Citrus sinensis) và quýt (Citrus
reticulata) được ghép với cam chua cũng giảm khả năng sinh sản [15]. Ngoài ra, CTV
có thể gây ra thân rỗ ở một số giống CCM bất kể gốc ghép được sử dụng, đó là
nguyên nhân quan trọng dẫn đến sự suy giảm của năng suất và chất lượng quả. Đã có
rất nhiều nghiên cứu về bệnh citrus tristeza virus ở vườn cây ăn quả có múi ở Châu
Âu [15], [21], [22]. Khi cây bị bệnh tàn lụi cho ra rất nhiều hoa và quả nhưng chỉ vài
năm cây tàn lụi và chết nhanh chóng [7].
Hiện nay, ở nước ta bệnh Tristeza thấy xuất hiện trên các vườn quýt với triệu
chứng quả bị vàng nửa dưới, còn trên chanh giấy với triệu chứng gân trong và dòng
virus gây lõm thân trên chanh tàu [3], [44].
B
18

tích sự xâm nhiễm ở hai loài cây có múi khác nhau, Citrus macrophylla (loài ít nhạy
cảm với CTV) và cam chua (loài nhạy cảm hơn với CTV), đã cho thấy rằng trong các
cây chủ nhạy cảm hơn có các điếm xâm nhiễm bao gồm một nhóm các tế bào, trong
khi ở những loài CCM ít nhạy cảm với CTV thường là duy nhất một tế bào.
20
1.2.4.3. Virus Citrus Tristeza
Virus Citrus Tristeza (CTV) có nguồn gốc ở Châu Á và đã lan truyền đến tất
cả các nước đang phát triến CCM. CTV thuộc chi Closterovỉrus có kích thước
khoảng 2000
X
12 nm [23], [13], [33] (Hình 1.3 B). Genome là sợi RNA đơn dương,
không phân đoạn. Vo protein bao gồm hai phân tử protein CP và CPm có kích thước
phân tử tương ứng khoảng 25 kDa (chiếm 95%) và 27 kDa (chiếm 5%) [41]. Protein
CP cấu tạo nên phần thân của virus còn protein CPm cấu tạo nên phần đuôi ngắn của
virus. Hình thành hạt virion có cấu trúc “rắn đuôi chuông” ở đầu 5’ của hạt virion,
cấu trúc virion bất thườn này lần đầu tiên được phát hiện ở BVY (Beet yellows virus)
[19]. Những phân tích hoá sinh và di truyền cho thấy hai protein này giữ những chức
năng khác nhau trong hạt virion virus.
Bộ gen của CTV có kích thước khoảng 19,3 kb (Hình 1.3 A) bao gồm 12
khung đọc mở (ORF - open reading frames) và hai vùng không mã hoá (UTR) đầu 5’
và đầu 3’, mã hoá cho ít nhất 19 protein bao gồm 2 enzyme protease tương tự papain,
các protein liên quan tới sự tái bản (RNA polymerase, helicase, methyltransferase),
protein giống với heat shock protein Hsp70 homolog (Hsp70h), 2 protein vỏ CP và
CPm, protein p23 tương tác với RNA, protein p20 được tích luỹ trong thể vùi. Một
so protein chưa rõ chức năng như p61, pl3, p 18 [32], [33], [34], [47]. Hsp70h đóng
vai trò kép liên quan đến việc hình thành đuôi của virion, và sự chuyển động của
virus từ tế bào này sang tế bào khác [10].

p33
1 1
HSP70h

CPm
n í n1
RdRp
]

p6CP

□

p
up23

CTV9R (a)
B
Hình 1.3. (A) Tố chức genome c
ủa CTV kiêu dại
(CTV9R): PRO: protein giống papain, MT:

bệnh.
- Phương pháp hữu hiệu nhất có thể sử dụng là dùng kháng thể để giám định
23bệnh thông qua ELISA, Immuno Sorbent Eletron Microcopy (ISEM), Dot
Immuno Blot Assay (DIBA) hoặc que thử nhanh.
- Phương pháp RT-PCR cũng được sử dụng rộng rãi trong việc giám định bệnh.
- Sự phát triển của Tissue print-ELISA [15], [20], để phát hiện CTV trong các
mặt cắt của nguyên liệu thực vật trên màng nitrocellulose, cho phép kiếm tra
với độ nhạy cảm cao của hàng ngàn mẫu một cách đơn giản mà không cần
phải chiết xuất.
Đẻ phòng chống bệnh Tristeza, nhiều phương pháp có thể được áp dụng như
loại trừ cây bệnh, thay đổi phương pháp canh tác như trồng xen canh với ối. Biện
pháp phòng trừ sinh học như sử dụng dòng nhẹ đế bảo vệ chéo, sử dụng gốc ghép
kháng bệnh, sử dụng công nghệ sinh học thông qua chuyển gen, cụ thể như:
- Dùng dòng gây bệnh nhẹ để chủng lên cây và cây sẽ chống chịu tốt khi có
dòng khác độc hơn tấn công (cơ chế bảo vệ chéo - Mild strain crossprotection)
- Sử dụng giống kháng hoặc gốc ghép kháng: nhiều giống CCM tỏ ra chống
chịu bệnh này nghĩa là virus vẫn tồn tại trên cây nhưng không lộ triệu chứng.
Một số giống khác kháng lại bệnh cũng có nghĩa là virus không nhân mật số
trên cây bị nhiễm. Những cây này thuộc nhóm Poncirus trifoliate, Swingled
glutỉnosa và Severinia buxifolia [30].
- Tạo cây chuyến gen kháng đang được ứng dụng ở nhiều nước trên thế giới,
trong đó Hoa Kỳ là nước đi đầu và đã bắt đầu từ 1996. Người ta sử dụng
chính gen từ vỏ protein của virus hay gen cần thiết cho sự sao chép của virus
đế chuyển vào cây với hy vọng đem lại tính khảng cho cây. Tuy nhiên kết quả
mới ở trong phạm vi phòng thí nghiệm và mức độ nhà lưới.
Sử dụng thuốc Coníĩdor cho bệnh vàng lá Greening và rầy chống cánh cũng có
tác dụng tốt đối với rầy mềm, trung gian truyền bệnh Tristeza.

chế nguyên bản một đoạn DNA nhất định trong một khoảng thời gian ngắn, nhờ sự
xúc tác của DNA polymerase. Tất cả các DNA polymerase khi hoạt động tổng hợp
một mạch DNA mới từ mạch khuôn đều cần sự hiện diện của những cặp mồi đặc
25hiệu. Mồi (primer) là những đoạn DNA ngắn có khả năng bắt cặp bổ sung với một
đầu của mạch khuôn và DNA polymerase sẽ nối dài đế hình thành mạch mới. Quá
trình này gồm ba bước:
Biến tính DNA từ dạng sợi kép thành dạng sợi đơn bằng cách nâng nhiệt độ
lên 94-95°C trong khoảng thời gian 30 giây đến 1 phút.
Gắn mồi với đoạn DNA cần nhân thông qua hạ nhiệt độ xuống 40- 60°c, trong
khoảng 30 giây đến 1 phút, phụ thuộc vào độ dài và tỉ lệ G+C của đoạn mồi.
Phản ứng polymerase tổng hợp phân tử DNA kéo dài từ đoạn mồi. Hai phân tử
DNA mới được tống hợp theo nguyên tắc bố sung từ hai phân tử khuôn ban đầu. Thời
gian kéo dài từ 1 phút đến vài phút. Đe tránh hiện tượng bắt cặp không đặc hiệu,
phản ứng tống hợp nên được thực hiện ở nhiệt độ
72°c.
Loại polymerase dùng trong
PCR là loại chịu nhiệt (Taq polymerase) được tách chiết từ vi khuấn Thermus
aquaticus, một loại vi khuấn được phân lập từ suối nước nóng. Hiện nay enzyme này
được sản xuất chủ yếu theo con đường tái tổ hợp [5].
Như vậy, sau mỗi chu kỳ phản ứng lượng DNA cần nhân bản sẽ tăng gấp đôi,
với N sợi khuôn ban đầu sau n chu kỳ sẽ có Nx2
n
sợi DNA được nhân lên. Ví dụ, sau
khoảng 20 chu kỳ có tới trên 30 triệu bản được nhân lên từ một sợi khuôn ban đầu.
1.3.3. Kỹ thuật biến nạp plasmid vào
Escherichia colỉ