TQTL ứng dụng biosensor trong KSCL thực phẩm GVHD: Vũ Thị Kim Hạnh SVTH: Huỳnh Thuận Nữ 1
LỜI MỞ ĐẦU
Trong công nghệ thực phẩm, thiết bị phân tích thích hợp không chỉ kiểm soát và đo
lường các thông số quan trọng của sản phẩm mà còn kiểm soát toàn bộ quá trình. Phân
tích thực phẩm gồm nhiều lĩnh vực, bao gồm xác định vấn đề dinh dưỡng (calories, hàm
lượng béo, carbohydrate, protein, vitamin, và chất khoáng), hàm lượng vi sinh vật (vi sinh
vật gây bệnh như Samonella, Listeria, Campylobacter, Escherichia coli O157, Yersina,
Shigella hay Vibrio; vi sinh vật gây hư hỏng như Bacillus cereus, Staphylococcus aureus,
Faecal streptococci, Clostridium perfringens, hay Pseudomonas,…); gia vị thực phẩm
(aspartame, saccharin, benzoate, sorbate, ascorbate, và sulphure dioxide) hay dư lượng
thuốc trừ sâu và thuốc diệt cỏ. Bên cạnh xác định được thành phần và đặc tính của thực
phẩm, phương pháp phân tích cũng cho biết được các biến đổi hóa học xảy ra trong quá
trình thu hoạch, chế biến, và bảo quản. Tuy nhiên, khó khăn trong phân tích không chỉ vì
có nhiều thành phần cần xác định mà còn vì có nhiều chất khác che lấp mất chất cần phân
tích.
Một thiết bị phân tích tốt phải thỏa mãn: độ chọn lọc cao, độ nhạy cao, độ tin cậy
cao, thời gian phân tích ngắn, ổn định, đơn giản, chi phí thấp, nhỏ gọn, dễ tự động hóa.
Biosensor có vai trò quan trọng trong chế biến thực phẩm, kiểm tra chất lượng, an toàn vì
nó đạt khá đầy đủ các tiêu chuẩn trên.
Trong bài báo cáo này, em sẽ trình bày về những ứng dụng của biosensor trong
kiểm soát chất lượng thực phẩm.
TQTL ứng dụng biosensor trong KSCL thực phẩm GVHD: Vũ Thị Kim Hạnh SVTH: Huỳnh Thuận Nữ 2
MỤC LỤC
PHẦN 1 Error! Bookmark not defined.
GIỚI THIỆU CHUNG VỀ BIOSENSOR 4
3.3 Biosensor điện hóa 50
PHẦN 4 55
ỨNG DỤNG BIOSENSOR TRONG PHÂN TÍCH THUỐC TRỪ SÂU TRONG THỰC PHẨM
55
4.1 Phương pháp ức chế enzyme 55
4.2 Phương pháp sử dụng enzyme thủy phân 58
4.2.1 Biosensor đo điện thế 59
4.2.2 Biosensor đo quang 60
4.2.3. Biosensor đo cường độ dòng điện 61
PHẦN 5 62
ỨNG DỤNG BIOSENSOR TRONG PHÂN TÍCH 62
THUỐC KHÁNG SINH (ANTIBIOTIC) TRONG THỰC PHẨM 62
5.1 Phân tích dư lượng β-lactam trong sữa 62
TQTL ứng dụng biosensor trong KSCL thực phẩm GVHD: Vũ Thị Kim Hạnh SVTH: Huỳnh Thuận Nữ 3
5.2 Phân tích streptomycin và dihydrostreptomycin trong sữa, mật ong và thịt heo 66
PHẦN 6 68
ỨNG DỤNG BIOSENSOR TRONG PHÂN TÍCH 68
KIM LOẠI NẶNG TRONG THỰC PHẨM 68
6.1 Biosensor phát hiện kim loại nặng dựa vào tính ức chế enzyme 69
6.2. Biosensor sử dụng protein 71
PHẦN 7 74
KẾT LUẬN 74
PHẦN 8 75
PHỤ LỤC 75
TÀI LIỆU THAM KHẢO 81
TQTL ứng dụng biosensor trong KSCL thực phẩm GVHD: Vũ Thị Kim Hạnh
SVTH: Huỳnh Thuận Nữ 5
được tín hiệu điện. Ví dụ: sử dụng transducer đo nhiệt độ trong khi phản ứng chuyển hóa
chất phân tích không xảy ra sự thay đổi enthalpy thì sẽ không có tín hiệu điện ở đầu ra.
1.2 Đặc điểm – Yêu cầu về biosensor
Để định lượng, biosensor phải đáp ứng yêu cầu liên quan đến đo lường: khả năng
lặp lại, khả năng tái sử dụng, tính chọn lọc, tính nhạy cảm, vùng trả lời tuyến tính và thời
gian đáp ứng tín hiệu tốt [1].
Các phép đo có khả năng lặp lại tốt nếu như hai loạt kết quả thu được tương tự
nhau được thực hiện bởi cùng người phân tích, sử dụng cùng một loại biosensor trong
cùng một mẫu phân tích.
Phương pháp đo có khả năng tái sử dụng cao nếu các kết quả trước có thể đạt được
khi tiến hành phân tích lặp lại lần hai.
Tính chọn lọc của biosensor thể hiện ở khả năng nhận ra một hợp chất đơn trong
hỗn hợp các cấu tử của mẫu, khả năng này phụ thuộc vào cơ quan thụ cảm sinh học và bộ
biến năng. Một biosensor có tính chọn lọc cao nếu như thành phần tạp chất của mẫu thấp.
Tính nhạy cảm của biosensor thể hiện ở sự thay đổi về lượng thì sẽ gây ra sự thay
đổi về tín hiệu trả lời: a = s m
trong đó a: Độ dao động về biên độ của dòng ra
m: Độ dao động về biên độ của dòng vào
s: Độ nhạy cảm của biosensor, đặc trưng cho mức độ phù hợp của biosensor
trong một ứng dụng cụ thể.
Đối với biosensor đo bằng điện thế thì biên độ của tín hiệu trả lời tỷ lệ thuận với
logarite của nồng độ chất phân tích. Theo định luật Nernst: a = s (logc).
Vùng tín hiệu tuyến tính thu được là một đường cong hiệu chỉnh của tín hiệu trả lời
với nồng độ khác nhau của chất phân tích. Đường cong chỉ thật sự có ý nghĩa nếu tiến
hành hiệu chỉnh cả hai loạt nồng độ tăng và giảm. Đường cong hiệu chỉnh gọi là tốt nếu
như tín hiệu trả lời ổn định theo thời gian.
Thời gian đáp ứng khá dài bởi bản chất của đường cong hiệu chỉnh, nó cho biết
một phương pháp đo cho tín hiệu trả lời nhanh hay chậm khi thay đổi nồng độ.
với khí và dung dịch chứa ion của khí này. Thông dụng nhất là điện cực hydro, điện
cực oxy, điện cực clo.
Điện cực màng chọn lọc ion: thông thường là các bán pin có lớp màng phân cách
dung dịch cần phân tích với một dung dịch chuẩn ở bên trong. Điện cực thủy tinh đo
pH là điện cực màng chọn lọc ion thông dụng nhất, dùng để kiểm soát nồng độ ion H
+
(pH) hay các cation hóa trị 1. Phần cuối của điện cực là một bầu thủy tinh có thành
mỏng và có thành phần đặc biệt. Bên trong bầu thủy tinh chứa dung dịch H
+
có nồng
TQTL ứng dụng biosensor trong KSCL thực phẩm GVHD: Vũ Thị Kim Hạnh SVTH: Huỳnh Thuận Nữ 7
độ xác định. Nhúng vào dung dịch H
+
là dây dẫn Pt hay kim loại Ag phủ AgCl. Toàn
bộ bộ phận trên được đặt trong ống bảo vệ. Bằng việc thay thế thành phần của thủy
tinh sao cho điện thế màng không phụ thuộc vào giá trị pH, thường sử dụng Al
2
O
3
và
B
2
O
3
ta có thể tạo ra các điện cực màng thủy tinh dùng xác định các cation hóa trị I
như Na
+
điện cực calomel. Nồng độ dung dịch KCl sử dụng là bão hòa hay 3.5M.
Chú thích:
a) Màng bán thấm
b) Thành phần sinh học
c) Màng thủy tinh
d) Điện cực thủy tinh đo pH
e) Điện thế giữa điện cực đo và điện cực so sánh
g) Dung dịch HCl
f) Điện cực đo Ag/AgCl
h) Điện cực so sánh
Hình 1.2: Cấu tạo của một biosensor enzyme đo điện thế
TQTL ứng dụng biosensor trong KSCL thực phẩm GVHD: Vũ Thị Kim Hạnh SVTH: Huỳnh Thuận Nữ 8
Ứng dụng của biosensor đo điện thế: dùng để đo nồng độ ure trong máu và nước
tiểu, đo nồng độ glucose, amino acid, amydalin, penicillin, adenosine, acetylcholine, kim
loại nặng, dư lượng thuốc trừ sâu, tổng chất độc (total toxicity), đo nồng độ anti-
dinitrophenol, anti-digoxin,
1.4.2 Biosensor đo cường độ dòng điện
Nguyên tắc hoạt động của biosensor đo cường độ dòng điện là xác định cường độ
dòng điện chạy qua mạch đo khi đặt một hiệu điện thế cố định giữa hai điện cực (điện cực
đo và điện cực so sánh). Khi đó cường độ dòng điện hàm của mật độ các hạt tích điện
trong dung dịch và điện thế đặt giữa hai điện cực. Bằng cách đo cường độ dòng điện, ta có
thể suy ra được nồng độ của các chất cần phân tích.
Cấu tạo transducer gồm điện cực so sánh thường là điện cực Ag/AgCl và điện cực
đo. Điện cực đo hiện nay đang được sử dụng rộng rãi là điện cực oxy và điện cực
hydroperoxyde.
ref
. Nhiệt độ của mối hàn thứ hai khi đặt trong môi trường nghiên cứu sẽ nhạy cảm với
sự thay đổi nhiệt độ của môi trường gây ra do phản ứng xúc tác bởi enzyme.
Ưu điểm: Kích thước nhỏ nên có thể đo nhiệt độ ở từng thời điểm và tăng vận tốc
đáp ứng, không phải kiểm soát chặt chẽ nhiệt độ
Nhược điểm: độ nhạy với sự thay đổi nhiệt độ trong phản ứng enzyme khá thấp.
Nó được ứng dụng chủ yếu trong y học để đo nồng độ các chất trong máu.
1.4.3.2 Nhiệt điện trở (thermistor)
Nguyên lý hoạt động của nó là đo điện trở của kim loại, do điện trở đó thay đổi khi
nhiệt độ thay đổi.
Một ví dụ về phương pháp sử dụng enzyme – nhiệt điện trở:
Hình 1.4: Cấu tạo của biosensor đo nhiệt : a. Ống mao dẫn; b. Lớp vỏ áo nhiệt; c.
Thiết bị trao đổi nhiệt; d. Lớp cách nhiệt; e. Nhiệt điện trở so sánh; f. Cột chứa
enzyme; g. Nhiệt điện trở đo; h. ống mao dẫn; i. Nguồn điện.
TQTL ứng dụng biosensor trong KSCL thực phẩm GVHD: Vũ Thị Kim Hạnh SVTH: Huỳnh Thuận Nữ 10
Cơ chất được đi vào thiết bị trao đổi nhiệt rồi qua cột enzyme để phản ứng với
enzyme và giải phóng ra nhiệt, nhiệt độ giải phóng ra sẽ được đo bởi nhiệt điện trở so
sánh. Kết quả đo được sau đó đi ra qua bộ xử lý để thu nhận tín hiệu.
Mối quan hệ giữa điện trở và nhiệt độ được xác định theo phương trình:
Trong đó R
1
: điện trở của nhiệt điện trở so sánh, R
2
: điện trở của nhiệt điện trở đo,
T
).
TQTL ứng dụng biosensor trong KSCL thực phẩm GVHD: Vũ Thị Kim Hạnh SVTH: Huỳnh Thuận Nữ 11
Với công thức trên, có thể ước lượng rằng khi tần số cộng hưởng của tinh thể sử
dụng là 9MHz thì độ nhạy của phép đo là 400 Hz/µg. Tinh thể thạch anh có tần số cộng
hưởng 9Mhz thưòng được sử dụng nhất, nó rộng khoảng 15 mm và dày 0.15 mm, có hình
dĩa, khối vuông hay tam giác. Trên mỗi mặt của tinh thể được phủ lớp kim loại mỏng dày
từ 0.3 – 1 mm, lớp này sẽ đóng vai trò là điện cực, đó có thể là vàng, bạc, nhôm hay
niken, cuối cùng là lớp mỏng bioreceptor được gắn lên bề mặt của điện cực.
Điện cực điện áp được dùng để đo amoniac, methane, lưu huỳnh dioxit và cơ chất
phosphate hữu cơ. Ta có thể dùng nó để xác định nồng độ formaldehyde nhờ
formaldehyde dehydrogenase hay xác định dư lượng thuốc trừ sâu vô cơ phospho vốn
kìm hãm enzyme xholinesterase.
Ưu điểm của nó là cho thời gian đáp ứng nhanh, nhỏ gọn và rẻ tiền. Tuy nhiên nó
không được dùng để phân tích mẫu dạng lỏng, dễ bị hư hỏng do độ ẩm không khí.
Hình 1.1: Sơ đồ cấu tạo của enzyme-based biosensor điện áp
1.4.5 Biosensor quang
Nguyên tắc hoạt động của biosensor quang như sau: Dung dịch phân tích được tiếp
xúc với màng và khi phản ứng ở bioreceptor xảy ra thì sẽ có hiện tượng ánh sáng bị hấp
thụ hoặc phát ra ánh sáng màu. Người ta có thể xác định được hàm lượng các chất của
mẫu phân tích thông qua việc đo độ hấp thụ ánh sáng hoặc sự phát quang ánh sáng của
các chất tạo thành do phản ứng xúc tác bởi enzyme.
Cơ sở của kiểu điện cực quang là sự kết hợp các sợi dẫn ánh sáng với phép trắc
phổ quang, phép trắc huỳnh quang, hoặc phép đo phản xạ quang. Nó có khả năng chỉ báo
những thay đổi của các thông số quang học, chẳng hạn như sự hấp thụ ánh sáng, chiều dài
bước sóng hoặc chỉ số phản xạ trong môi trường đo bao quanh sợi dẫn. Những thiết bị
này gắn vào hoặc là sợi đơn hoặc là chùm sợi kép để ánh sáng tới và chùm tia sáng được
trong đó C-nồng độ chất hấp thụ, K-hằng số hấp thụ, e- hằng số tán sắc
Kĩ thuật này được dùng để định lượng glucose trong máu nhờ thuốc hiện màu MBTH (3-
methyl-2-benzotiazolinon) và DMAB (3-dimethyl-aminobenzoic acid). Hai enzyme
glucoxydase (GOD) và peroxydase được cố định bằng cách hấp thụ lên bề mặt tấm nền đã
phủ thuốc nhuộm. Khi mẫu phân tích tiếp xúc với tấm nền thì phản ứng xảy ra như sau:
Glucose
m
aãu
+ O
2
GOD
Acid Gluconic
+
H
2
O
2
+
+
MTBH
DMAB
MTBH-DMAB (maøu xanh)
peroxydase
H
2
O
1.4.6 Biosensor enzyme
Biosensor enzyme là biosensor sử dụng enzyme làm bioreceptor. Enzyme này sẽ
xúc tác cho phản ứng chuyển cơ chất thành sản phẩm mà transducer có thể định tính và
định lượng được. Nồng độ chất phân tích sẽ được xác định dựa vào tín hiệu transducer có
được. Enzyme sử dụng có thể ở dạng hòa tan trong dung dịch hoặc ở dạng màng cố định
lên transducer. Tất cả các loại transducer nhắc đến đều có thể gằn với màng enzyme.
1.4.7 Biosensor miễn dịch:
Biosensor miễn dịch là biosensor sử dụng kháng thể hoặc kháng nguyên làm
bioreceptor. Nguyên tắc hoạt động của nó là dựa vào tín hiệu sinh ra khi có sự tương tác
giữa các kháng nguyên – kháng thể.
Mỗi kháng thể là một protein hình chữ Y, gồm 4 chuỗi polypeptide, trong đó có
hai chuỗi nặng và hai chuỗi nhẹ liên kết với nhau bởi các cầu disulfite. Một phần cấu trúc
của các chuỗi là cố định, nhưng các phần đầu mút của hai nhánh chữ Y lại biến đổi và tạo
nên các vị trí kết hợp có khả năng phản ứng với các chất hóa học khác gọi là kháng
nguyên. Kháng nguyên là các “chất lạ” có bản chất protein hay hydrat cacbon.
Phản ứng kháng nguyên – kháng thể được xác định bằng nhiều cách, trong đó có
kĩ thuật ELISA (enzyme linked immunosorben assay: kĩ thuật hấp thụ miễn dịch có gắn
enzyme).
1.4.8 Biosensor vi sinh vật
Biosensor vi sinh vật tạo thành khi gắn vi sinh vật với transducer co thể phát hiện
(dò tìm và nhận biết) được quá trình trao đổi chất. Vi sinh vật có hệ enzyme tác động đến
sự chuyển hóa sinh học. Ưu điểm khi dùng vi sinh vật làm bioreceptor là khi cố định vi
sinh vật lên transducer, không cần phải tách chiết hay tinh sạch như enzyme, và do
enzyme được duy trì ở môi trường tự nhiên nên tránh được vấn đề như tái sinh cofactor.
Vi sinh vật được cố định bởi phương pháp vật lí như cố định trong gel, hay màng thẩm
TQTL ứng dụng biosensor trong KSCL thực phẩm GVHD: Vũ Thị Kim Hạnh SVTH: Huỳnh Thuận Nữ 14
tách. Transducer có thể là điện cực đo điện thế hay điện cực đo cường độ dòng điện vì có
segmentation), đây là nguyên tắc cơ bản của FIA. Bọt khí không được thêm vào dòng
chất mang của FIA, mặc dù nó cần phối trộn các chất trước. Mẫu lỏng được cho vào
thông qua injection valve, loop với lượng thể tích biết trước và chuyển đến biosensor.
TQTL ứng dụng biosensor trong KSCL thực phẩm GVHD: Vũ Thị Kim Hạnh SVTH: Huỳnh Thuận Nữ 15
(a) Xác định cơ chất:
Xác định cơ chất của phản ứng enzyme bằng biosensor kết hợp với FIA thường
đơn giản. Cơ chất chỉ đơn giản được tiêm vào dòng chất mang qua van tiêm (injection
valve). Cơ chất được phát hiện và xác định khi nó tiếp xúc với biosensor.
Hệ thống FIA gồm có 2 bơm điều khiển bằng máy tính (để vận chuyển chất mạng
và inject mẫu), injection valve với loop (lần lượt nhận mẫu và chất mang), biosensor,
detection cell, và linking tubes có đường kính trong 0.5 – 1 mm.
Không giống như phương pháp gián đoạn, đường cong đáp ứng không bao giờ
được tới đường thẳng (ứng với trạng thái ổn định) nhưng lại có dạng peak với chiều cao
tương ứng với nồng độ chất phân tích. Nồng độ trong mẫu được xác định bằng cách so
sánh với dung dịch chuẩn biết trước (dung dịch này được inject vào cùng điều kiện).
FIA có ưu điểm là làm việc với lượng mẫu nhỏ (25 – 200µl) và tốc độ bị giới hạn
bởi thời gian đáp ứng của biosensor. Nếu tốc độ mẫu đi qua biosensor được xem là hằng
số, thì đáp ứng của biosensor nhanh sẽ làm cho chiều cao peak cao hơn trong FIA, cải
thiện được tín hiệu.
(b) Xác định chất ức chế:
Việc xác định chất ức chế của phản ứng enzyme cần sự có mặt của cơ chất. Có 2
khả năng:
- chất ức chế được tiêm (inject) vào dòng chất mang chứa cơ chất
- hay cơ chất được tiêm vào dòng chất mang chứa chất ức chế.
Phương pháp thứ nhất chỉ thực hiện khi phản ứng ức chế nhanh (ví dụ, sự ức chế
urease bởi fluoride ion) và có nhược điểm là tiêu thụ cơ chất nhiều.
Phương pháp thứ hai: được sử dụng rộng rãi hơn vì tính ức chế thường chậm, đặc
1.6 Các lĩnh vực ứng dụng của biosensor
Từ những cuộc nghiên cứu mở đầu của Clark và Lyon “làm thế nào để điện điện
hóa thông minh hơn’’ vào năm 1962, Updike và Hicks năm 1967, biosensor ngày càng
phát triển và được sử dụng rộng rãi trong các lĩnh vực khác nhau, đặc biệt là trong lĩnh
vực y học, công nghệ thực phẩm và môi trường.
Trong y học, đa số biosensor sử dụng là biosensor enzyme, nó được dùng để phát
hiện và chẩn đoán bệnh tật. Ngày nay nó còn là công cụ hữu hiệu để chăm sóc sức khỏe
tại nhà với rất nhiều tính năng tốt. Điển hình nhất là biosensor đo nồng độ glucose trong
máu cho người bệnh tiểu đường, hoặc biosensor đo nồng độ ure trong máu dành cho
người mắc bệnh thận có ý nghĩa quan trọng. Nó là một loại thiết bị cầm tay với loại chip
chế tạo trên cơ sở của điện cực chọn lọc ion và điện cực đo dòng điện, kích thước nhỏ, dễ
mang theo, tiện sử dụng, giúp cho người bệnh có thể sử dụng ở bất cứ nơi nào khi cần.
Trong lĩnh vực môi trường, biosensor tỏ ra là một công cụ hữu hiệu để đo các chất
độc hữu cơ, vô cơ trong nguồn nước để có biện pháp xử lý nước thích hợp như kim loại
nặng, các loại thuốc trừ sâu, vi sinh vật, chỉ số BOD,… Biosensor vi sinh vật là hay sử
dụng nhất với thời gian phân tích khá ngắn (khoảng 15 phút).
Trong ngành thực phẩm, việc kiểm tra chất lượng thực phẩm dựa trên các phương
pháp truyền thống thường mất nhiều thời gian từ vài giờ đến vài ngày. Nhưng với kỹ
thuật dùng biosensor đã mang lại cho ngành công nghiệp thực phẩm một thiết bị theo dõi
và đo lường nhanh, độ nhạy cao, sử dụng thuận lợi hơn so với những phương pháp truyền
thống, trong đó biosensor đã được ứng dụng để kiểm soát thành phần các chất dinh
dưỡng, số lượng vi sinh vật, thuốc bảo vệ thực vật, thuốc kháng sinh, kim loại nặng trong
thực phẩm cũng như kiểm soát một số quá trình lên men. TQTL ứng dụng biosensor trong KSCL thực phẩm GVHD: Vũ Thị Kim Hạnh SVTH: Huỳnh Thuận Nữ 17
PHẦN 2
tác phản ứng xảy ra như sau khi có mặt glucose và O
2
:
TQTL ứng dụng biosensor trong KSCL thực phẩm GVHD: Vũ Thị Kim Hạnh SVTH: Huỳnh Thuận Nữ 18
Do nồng độ glucose tỷ lệ với lượng O
2
tiêu thụ và lượng H
2
O
2
tạo ra nên có thể sử
dụng điện cực phát hiện O
2
hoặc H
2
O
2
có phủ màng enzyme glucose oxidase để xác định
nồng độ glucose.
2.1.1.1 Biosensor dựa trên phát hiện oxy hay H
2
O
2
Biosensor dựa trên việc phát hiện oxy đơn giản nhất là sử dụng điện cực oxy của
Clark làm điện cực làm việc.
+ H
2
O Acid gluconic + H
2
O
2
(1)
GOD
TQTL ứng dụng biosensor trong KSCL thực phẩm GVHD: Vũ Thị Kim Hạnh SVTH: Huỳnh Thuận Nữ 19
điện cực bị giảm, cường độ dòng điện cũng giảm. Do đó, có thể nói, cường độ dòng điện
tỷ lệ nghịch với nồng độ cơ chất. Dòng điện được đo sau khi khuếch đại và được chỉ thị
trực tiếp bằng số hoặc biểu diễn dưới dạng nồng độ oxy hay áp suất riêng phần của oxy.
Thông thường, người ta còn sử dụng enzyme catalase đồng cố định với enzyme oxidase
để khôi phục lại một nửa lượng O
2
tiêu thụ. Chú ý: toàn bộ dung dịch tiếp xúc với
biosensor đều phải bão hòa oxy, và trước mỗi lần đo biosensor cũng phải được nhúng
trong dung dịch đệm bão hòa oxy cho đến khi tín hiệu ổn định thì mới đem nhúng sang
dung dịch chứa cơ chất [3].
Hình 2.2: Đường cong biểu diễn sự thay đổi cường độ dòng điện khi biosensor tiếp xúc
với mẫu chứa cơ chất của enzyme
Điện cực này có ưu điểm là không bị các thành phần khác trong dung dịch gây
nhiễu (do có màng bán thấm ngăn không cho các chất đến điện cực trừ O
2
) nhưng cũng có
nhược điểm là tín hiệu điện phụ thuộc vào nồng độ oxy trong dung dịch (do phải đảm bảo
SVTH: Huỳnh Thuận Nữ 20
2.1.1.2 Một số loại biosensor đo cường độ dòng điện khác
Ở “thế hệ thứ nhất” của biosensor, O
2
và H
2
O
2
là chất trao đổi điện tử với điện cực,
nhưng như thế sẽ phải đặt một điện thế khá lớn lên điện cực, điều này sẽ gây lệch kết quả,
nguyên nhân là do có một số hợp chất khác cũng bị oxy hóa ở điện cực cùng với H
2
O
2
.
Do đó, “thế hệ thứ hai” của biosensor là sử dụng mediator (chất vận chuyển điện tử trung
gian nhân tạo) làm chất trao đổi điện tử với điện cực, như thế sẽ giảm được điện thế đặt
vào điện cực (chỉ còn khoảng 0,19 V so với điện cực chuẩn) [1]. Mediator sử dụng nhiều
nhất là ferrocene. Phản ứng của nó như sau:
Hình 2. 3: Cơ chế vận chuyển điện tử nhờ mediator
FAD (flavin adenine dinucletide) là cofactor của enzyme glucoxidase, nó lấy điện
tử từ cơ chất và trở thành dạng khử FADH
2
, khi có ferrocene, FADH
2
bị oxy hóa trở lại
thành FAD. Trong quá trình ferrocene chuyển thành ferrocinium ion, điện tử được truyền
vận chuyển electron và giảm điện thế đặt vào. Đó là trường hợp của ví dụ này [8].
Screen-print là một kỹ thuật để chế tạo transducer điện hóa của biosensor.
Transducer được chế tạo bằng phương pháp screen-print được gọi tắt là screen-print
transducer. Cấu tạo của nó gồm “đường dẫn” Ag, điện cực carbon làm việc, điện cực
carbon đếm, và điện cực Ag/AgCl so sánh. Những điện cực này được in trên lớp màng
polymer (tùy theo từng trường hợp mà lớp màng này có thể khác nhau, trong trường hợp
chế tạo biosensor đo nồng độ glucose, người ta dùng màng polyethylen telephtarate) bằng
phương pháp screen-print. Một lớp màng cách điện sẽ được in trực tiếp lên điện cực trừ
những vùng xảy ra phản ứng enzyme. [7]
Hình 2. 5: Điện cực screen-print điển hình (kích thước của nó có thể thay đổi tùy từng
trường hợp chế tạo)
Biosensor sử dụng screen-print transducer được gọi là screen-print biosensor. Để
xác định nồng độ glucose trong sản xuất rượu vang, người ta sử dụng screen-print
e
Điện
cực
phân
cực
Cơ chất
S
ản phẩm
FAD
FADH
Oxidase
H
2
O
mmol/dm
3
). Điện thế đặt vào điện cực làm việc là – 0,16V (so với điện cực Ag/AgCl).
Phản ứng xảy ra ở điện cực khi nhúng biosensor vào dung dịch mẫu được thể hiện trên
hình 2.6. Quá trình vận chuyển electron đến điện cực xảy ra do sự chuyển đổi giữa các
dạng oxy hóa và khử của các cặp chất và cuối cùng là cặp oxy hóa khử của mediator sẽ
đóng vai trò trao đổi electron trực tiếp với điện cực, làm sinh ra cường độ dòng điện tỷ lệ
với lượng glucose tham gia phản ứng. Bằng cách đo cường độ dòng điện và từ đường
chuẩn, ta có thể suy ra được nồng độ gluose trong mẫu.
Hình 2. 6: Cơ chế phản ứng xảy ra ở điện cực (ox: dạng oxy hóa, red: dạng khử)
Với biosensor như thế, ta có thể xác định được hàm lượng glucose trong nước nho,
hoặc rượu vang với khoảng tuyến tính 4,9 – 49,0 µmol/dm
3
.
2.1.1.4 Biosensor quang
Ngoài ra, người ta còn có thể sử dụng biosensor đo quang sử dụng phẩm lam Phổ
(Prussian blue – PB) [6].
Prussian blue là muối feri-ferocyanua của kali, natri hoặc amoni, có màu lam đậm.
Nó là chất xúc tác điện cho quá trình oxy hóa – khử của H
2
O
2
. Dạng khử của Prussian
blue (còn gọi là Prussian white – PW) có tác dụng xúc tác quá trình khử O
2
, và dạng oxy
hóa của nó lại có tác dụng xúc tác quá trình oxy hóa hydrogen peroxide [5].
Khi PB thay đổi dạng oxy hóa, nó sẽ thay đổi màu sắc. Bằng cách đo độ hấp thu
của lớp màng PB, ta có thể suy ra được nồng độ chất cần phân tích.
thấp thì sẽ làm biến tính enzyme, độ nhạy cũng giảm. Nếu pH > 8 sẽ có hiện tượng
enzyme bị phân hủy và làm trôi màng PB. Để tránh ức chế enzyme và làm hỏng màng
PN, ta nên dùng dung dịch đệm potassium actate pH 5,0. Ngoài ra trong dung dịch đệm
có chứa ion Kali nên sẽ giảm được thời gian “tái sinh” màng do cation kim loại có tác
dụng khử PB thành PW. Khi tăng hàm lượng vitamin C trong dòng chất mang sẽ làm
giảm độ nhạy của phép đo.
Thông số kỹ thuật của biosensor: biosensor trong hệ thống FIA có khoảng tuyến
tính là 0,1 – 1 mM, phân tích được 15 mẫu/h.
TQTL ứng dụng biosensor trong KSCL thực phẩm GVHD: Vũ Thị Kim Hạnh SVTH: Huỳnh Thuận Nữ 24
Bảng 2. 1: Kết quả phân tích nồng độ glucose (mM) trong một số loại nước uống bằng
biosensor và phương pháp quang phổ
Mẫu Biosensor Phương pháp quang phổ
Nước ép nho
95,1 1,3 93,7 3,7
Nước ép táo
135,0 1,3 134,1 5,6
Rượu vang đỏ
45,1 1,2 43,2 3,6
Rượu vang trắng
46,7 1,0 43,7 3,9
Coca - cola
76,7 0,3 77,3 3,2
Red Bull
216,4 2.4 216,6 8,7
2.1.2 Biosensor xác định ethanol
Nhiều loại biosensor đã được dùng để xác định hàm lượng ethanol trong mẫu, phổ
RCH
2
OH + O
2
RCHO + H
2
O
2
AOD
TQTL ứng dụng biosensor trong KSCL thực phẩm GVHD: Vũ Thị Kim Hạnh SVTH: Huỳnh Thuận Nữ 25
không bị oxy hóa bởi oxy, do đó, nó phải cần một số loại mediator để oxy hóa NADH
như flavine mononucleotide (FMN). Phản ứng xảy ra ở điện cực như sau:
CH
3
CH
2
OH + NAD
+
CH3CHO + NADH + H
+
NADH + FMN + H
+
NAD+ + FMNH
2
2
O
2
), phenylalanine, galactose và
oxalate; thường ứng dụng trong dược, lên men, và công nghiệp thực phẩm. Trong những
trường hợp đó, những oxidase tương ứng kết hợp với catalase được dùng làm bioreceptor
trong SIRE biosensor P100 với quá trình oxy hóa hydrogen peroxide ở 650mV. Trong bài
này, alcohol dehydrogenase (ADH) từ Sacchromyces cerevisae được dùng làm
bioreceptor với sự có mặt của NAD
+
.
Copyright: Tài liệu đại học ©