Phần 1
MỞ ĐẦU
1.1. Tính cấp thiết của đề tài
Enzyme cellulase là hệ enzyme bao gồm các loại enzyme: C1, Cx, β-
clucosidase, có khả năng hoạt động phối hợp để phân giải cellulose thành glucose.
Enzyme cellulase được ứng dụng trong nông nghiệp chế biến thức ăn chăn nuôi,
trong công nghiệp thực phẩm để chế biến thực phẩm, trong quá trình li trích các
chất từ thực vật, trong việc phân hủy các phế liệu giàu cellulose….Theo Bhat
(2000), xấp xỉ 20% trong số 1 tỷ USD thu được từ lượng enzyme công nghiệp
được bán ra trên thế giới gồm các enzyme cellulase, hemicelluse và pectinase.
Hằng năm, nước ta phải nhập ngoại một lượng lớn những nguồn enzyme
cellulase để giải quyết vấn đề sản xuất và xử lý ô nhiễm môi trường. Việt Nam là
nước nhiệt đới có nền nông nghiệp rất phong phú, đa dạng và đang trên đà phát
triển. Vì vậy, lượng phế thải nông nghiệp rất dồi dào, cùng với sự công nghiệp
hóa hiện đại hóa của đất nước, ô nhiễm môi trường ngày càng trở thành nguy cơ
thật sự. Thành phần chính trong phế thải rắn có trong nông nghiệp, lâm nghiệp là
cellulase.
Việc phức hệ cellulase trong phân giải các nguồn thức ăn giàu celluloase
như rơm rạ, bã mía, gỗ mục đã và đang được triển khai ở nhiều nước, trong mọi
lĩnh vực như sản xuất protein đơn bào làm thức ăn cho gia súc [3].
Do đó, vi sinh vật phân giải cellulose có vai trò quan trọng trong chu trình tuần.
Vì vậy tôi chọn đề tài “Phân lập và đánh giá khả năng sinh enzyme cellulase
của một số vi sinh vật bản đia”.
1
1.2. Mục đích nghiên cứu
- Phân lập và đánh giá được khả năng sinh enzyme cellulose từ một số vi
sinh vật bản địa, làm tiền đề cho nghiên cứu xử lí các phụ phẩm chứa
cellulose.
1.3. Yêu cầu của đề tài
- Phân lập được vi sinh vật có hoạt tính sinh enzyme cellulase.
- Đánh giá được vi sinh vật có hoạt tính sinh enzyme cellulase.

nông nghiệp khác nhau bằng phương pháp lên men bán rắn và ứng dụng
enzym trong việc tách chiết dầu thực vật.
Năm 2002, theo báo cáo gần đây của CORAL, dịch nuôi cấy A. niger
trong MT Czapek-Dox chứa CMC1%, cho chạy điện di trên gel SDS-PAGE
(chứa 0,2% CMC) phát hiện có hai vạch có hoạt tính CMCase và trọng lượng
phân tử lần lượt là 83.000 và 50.000 Dalton. Ở Việt Nam, năm 1989, Lê
Hồng Mai nghiên cứu về sinh tổng hợp và một số đặc tính của cellulase (typ
CMCase) ở A. niger VS-1 trên MT lên men bán rắn. Năm 2001, Huỳnh Anh
nghiên cứu về nấm sợi T. reesei sinh tổng hợp enzym cellulase trên MT lỏng
với nguồn cacbon là CMC. Năm 2002, Kiều Hoa nghiên cứu sinh tổng hợp
enzym cellulase với nguồn cacbon là cellulose tinh khiết, cám trấu, bã mía,
vỏ cà phê. Năm 2003, Hoàng Quốc Khánh nghiên cứu khả năng sinh tổng
hợp và đặc điểm cellulase của A. niger Rnnl 363. Châu Hoàng Vũ cũng
3
nghiên cứu thu nhận và tinh sạch enzym cellulase từ nấm mốc T. reesei bằng
phương pháp lên men bán rắn . Năm 2004, Trần Thạnh Phong khảo sát khả
năng sinh tổng hợp enzym cellulase từ T. reesei và A. niger trên MT lên men
bán rắn. Năm 2005, Lê Thị Hồng Nga nghiên cứu sự sinh tổng hợp cảm ứng
pectinase và cellulase của một số chủng nấm mốc [20].
2.2. Giới thiệu về cellulose
Cellulose là polymer sinh học phong phú nhất trên trái đất (Murashima,
2002), được sinh tổng hợp chủ yếu bởi thực vật với tốc độ 4.109 tấn/năm.
Hàng năm có khoảng 232 tỷ tấn chất hữu cơ được thực vật tổng hợp thành
nhờ quá trình quang hợp. Hàng ngày, hàng giờ một lượng lớn cellulose được
tích lũy trong đất. Do các sản phẩm tổng hợp của thực vật thải ra, cây cối chết
đi, cành lá rụng xuống, một phần do con người thải ra dưới dạng rác rưởi,
giấy vụn, mùn cưa…[2], [3]. Trong số này có đến 30% là màng tế bào thực
vật mà thành phần chủ yếu là cellulose. Cellulose chiếm đến 89% trong bông
và 40-50% trong gỗ.
Cellulose là polysacarit chủ yếu của thành tế bào thực vật. Trong bông

tác động, làm thay đổi toàn bộ cấu trúc của chúng.
Trong phân tử cellulose có nhiều liên kết hydroxyl tồn tại dưới dạng tự
do, hydrogen của chúng dễ bị thay thế bởi một số gốc hóa học như metyl
hoặc gốc acetyl tạo nên các dẫn xuất ete hoặc este của cellulose. Một trong
những dẫn xuất được ứng dụng rất nhiều là CMC, trong đó một số nhóm
hydroxyl của cellulose được thay thế bằng gốc –OCH2COOH.
Trong tự nhiên cellulose khá bền vững, không tan và bị trương lên khi
hấp thụ nước. Cellulose bị thủy phân khi đun nóng với axit hay kiềm ở nồng độ
khá cao, hoặc bị phân giải dưới tác dụng của cellulose được tổng hợp bởi các vi
sinh vật.
2.3. Enzyme cellulase
2.3.1. Cấu trúc của enzyme cellulase
Cellulase có bản chất là protein được cấu tạo từ các đơn vị là axit amin,
các axit amin được nối với nhau bởi liên kết peptid –CO-NH- . Ngoài ra,
6
trong cấu trúc còn có những phần phụ khác, Cấu trúc hoàn chỉnh của các loại
enzyme nhóm endoglucanase (EG) và exoglucanase (CBH) giống nhau trong
hệ cellulase của nấm sợi, gồm một trung tâm xúc tác và một đuôi tận cùng,
phần đuôi này xuất phát từ trung tâm xúc tác và được gắn thêm vùng glycosil
hóa, cuối đuôi là vùng gắn kết với cellulose (CBD: Cellulose binding
domain). Vùng này có vai trò tạo liên kết với cellulose tinh thể. Trong quá
trình phân hủy cellulose có sự tương quan mạnh giữa khả năng xúc tác phân
giải cellulose của các enzyme và ái lực của enzyme này đối với cellulose.
Hơn nửa, hoạt tính của cellulase dựa vào tinh thể cellulose và khả năng kết
hợp của CBD với cellulose. Điều này chứng tỏ CBD làm gia tăng hoạt tính
cellulase đối với tinh thể cellulose. Sự có mặt của CBD sẽ hỗ trợ cho
enzyme cellulase thực hiện việc cắt đứt nhiều liên kết trong cellulose tinh thể.
Vùng gắn kết với cellulose có cấu tạo khác với liên kết thông thường của
protein và việc thay đổi chiều dài của vùng glycosil hóa có ảnh hưởng đến
hoạt tính xúc tác của enzyme.

polysaccharide phong phú nhất trong tự nhiên. Việc phân hủy sinh học
cellulose bởi vi sinh vật là một trong những bước chính của chu trình carbon
trên trái đất.
2.3.5. Cơ chế hoạt động
Hoạt động của phân tử enzym được biểu hiện trong trung tâm hoạt
động. Trung tâm hoạt động của enzym (E) có cấu trúc không gian tương ứng
với cơ chất (S) mà chúng tham gia. Phản ứng không có sẳn mà được hình
thành trong quá trình enzym tiếp xúc với cơ chất giống như chìa khóa vào ổ
khóa tạo thành enzym - cơ chất (E-S).
Cơ chế tác động của enzym vào cơ chất qua ba giai đoạn:
Giai đoạn 1: Enzym (E) tương tác với cơ chất (S) bằng những liên kết
yếu tạo thành phức enzym - cơ chất (E-S).
Giai đoạn 2: Khi cơ chất (S) tạo phức với enzym (E) sẽ bị thay đổi cấu
hình không gian và mức độ bền vững các liên kết. Các liên kết bị phá vỡ và
tạo ra sản phẩm. Phức enzym cơ chất (E-S) sẽ được tách ra.
Giai đoạn 3: Enzym sẽ được giải phóng, cơ chất sẽ chuyển thành sản
phẩm và tách khỏi enzym.
Phản ứng tổng quát:
E + S E-S E + P
E- enzym (enzyme) ; S- cơ chất (substracte) ; P- sản phẩm (Products)
Tên gọi cellulose dùng để chỉ chung cho các enzyme tham gia
phân cắt các chất cellulose. Tất cả các enzyme cellulose đều có tác dụng
phân cắt liên kết -1,4 giữa 2 đơn vị glucose và được các nhà khoa học phân
ra làm 3 nhóm chủ yếu sau đây:
9
1,4 –D-glucan cellobiohydrolase(EC.3.2.1.91)(CBH). Enzyme cắt đầu
cuối của chuỗi cellulose để tạo thành cellobiose. Enzyme này còn có một loạt
các tên như: cellobiohydrolase, cellobiosidase và avicellase. Ngày nay nó
được coi là enzyme chủ đạo phân giải cellulose, bởi nó có khả năng phân cắt
cellulose ở vùng kết tinh.

loài phát triển mạnh, có loài phát triển yếu. Chính vì thế, việc phân hủy
cellulose trong tự nhiên được tiến hành không đồng bộ, xảy ra rất chậm.
11
2.4. Hoạt lực của enzyme cellulase (cơ chế thủy phân cellulose)
Thủy phân cellulose phải có sự tham gia của cả ba loại enzyme
cellulose như endoglucanase, exoglucanase và β-glucosidase. Thiếu một
trong ba loại enzyme trên thì không thể thủy phân phân tử cellulose đến cùng.
Từ những nghiên cứu riêng lẻ đối với từng loại enzyme đến nghiên cứu
tác động tổng hợp của cả ba loại enzyme cellulose, nhiều nhà khoa học đều
đưa ra kết luận chung là các loại enzyme cellulose sẽ thay phiên nhau phân
hủy cellulose để tạo thành sản phẩm cuối cùng là glucose. Có nhiều cách giải
thích khác nhau về cơ chế tác động của cellulose, trong đó cách giải thích do
Erikson đưa ra được nhiều người công nhận hơn cả.
Theo Erikson và cộng tác viên (1980), cơ chế tác động hiệp đồng của
3 loại cellulose như sau: đầu tiên endoglucanase tác động vào vùng vô định
hình trên bề mặt cellulose, cắt liên kết β-1,4-glucosid và tạo ra các đầu mạch
tự do. Tiếp đó exoglucanase tấn công cắt ra từng đoạn cellobiose từ đầu
mạch được tạo thành. Kết quả tác động của endoglucanase và exoglucanase
tạo ra các celloligosaccharit mạch ngắn, cellobiose, glucose. β-glucosidase
thủy phân tiếp và tạo thành glucose. Các loài vi sinh vật có khả năng sinh
tổng hợp cellulose trong điều kiện tự nhiên thường bị ảnh hưởng bởi tác động
nhiều mặt của các yếu tố ngoại cảnh nên có loài phát triển rất mạnh, có loài
lại phát triển yếu. Chính vì thế, việc phân hủy cellulose trong tự nhiên được
tiến hành không đồng bộ, xảy ra rất chậm.
Trong điều kiện phòng thí nghiệm hay điều kiện công nghiệp, việc
phân hủy cellulose bằng enzyme, ngoài các yếu tố kỹ thuật như nhiệt độ pH,
nồng độ cơ chất, lượng enzyme…, một yếu tố hết sức quan trọng là tính
đồng bộ của hệ enzyme cellulose từ nhiều nguồn vi sinh vật khác nhau. Quá
trình thủy phân cellulose chỉ có thể được tiến hành đến sản phẩm cuối cùng
khi sử dụng đồng bộ ba loại enzyme cellulose.

Fusarium oxysporum
Mucor pussilus
Pen, notatum
Penicillium spp
Trichoderma lignorum
Trichoderma reesei
Trichoderma viride
Trichoderma konongi
Actinomyces aureus
Act.cellulose
Act.diastaticus
Act.roseus
Act.griseus
Act.melamocylas
Act.coelicolor
Act.candidus
Act.chromogenes
Act.hygroscopicus
Act.griseofulvin
Act.ochroleucus
Act.thermofulcus
Act.xanthostrums
Thermonospara curvata
Preudomonas
Fluorescens
B.megaterium
B.menenteroides
Clostridium sp
Acetobacter xylium
Vi khuẩn dạ cỏ

phương pháp khô, phương pháp này cho chất lượng cà phê không cao. Để
tiến hành nâng cao chất lượng cà phê, phương pháp lên men đã được áp dụng.
Đó là quá trình sử dụng phức hệ enzyme cellulose và pectinase để xử lý bóc
vỏ cà phê và làm tăng khả năng ly trích dịch quả. Trong khâu bóc vỏ,
cellulose gây hiện tượng thẫm màu, làm giảm chất lượng sau khi sấy, đồng
thời cản trở cho việc bóc vỏ. Khi sử dụng chế phẩm A.niger có tên thương
mại là Biovina-09 có hoạt tính pectinase và cho thấy số lượng cà phê được
bóc vỏ tăng, hạt cà phê được bóc vỏ bằng chế phẩm không còn nhớt như hạt
không sử dụng chế phẩm enzyme và hiệu suất bóc vỏ khá cao. Trong quá
trình ly trích dịch quả, cellulose và pectin cản trở sự thoát các chất hòa tan
trong tế bào ra ngoài tế bào. Khi sử dụng chế phẩm Biotin-09 hiệu suất trích
ly cao hơn mẫu không sử dụng là 46% [4].
15
2.6.2. Trong công nghệ xử lý rác thác và sản xuất phân bón vi sinh
Rác thải là nguồn chính gây nên ô nhiễm môi trường dẫn tới mất cân
bằng sinh thái và phá hủy môi trường sống, đe dọa tới sức khỏe và cuộc sống
con người. Thành phần hữu cơ chính trong rác thải là cellulose, nên việc sử
dụng công nghệ vi sinh trong xử lý rác thải cải thiện môi trường rất có hiệu
quả. Hiện nay, có nhiều những nghiên cứu về việc sử dụng cellulose do ác
chủng vi sinh vật tiết ra nhằm thủy phân cellulose trong rác thải. Phức hệ
cellulose được sử dụng để xử lý nguồn nước thải do các nhà máy giấy thải ra.
Nguyên liệu làm giấy là gỗ (sinh khối của thực vật bậc cao). Sinh khối này
chứa rất nhiều loại polysaccharide, trong đó các polysaccharide quan trong
quyết định tới chất lượng, số lượng giấy là cellulose. Vì vậy, nước thải của
các nhà máy giấy, các cơ sở chế biến gỗ, các xưởng mộc bổ sung các chế
phẩm chứa phức hệ cellulose đem lại hiệu quả cao [8].
2.6.3. Trong xử lý môi trường
Các chất thải hữu cơ chiếm một khối lượng rất lớn trong tổng số chất
thải hữu cơ hiện nay ở các đô thị và các khu công nghiệp. Trong các chất thải
hữu cơ có nguồn gốc thực vật, cellulose chiếm khoảng 50%. Các chất thải

thương các cơ quan bên trong tế bào, đảm bảo sự nguyên vẹn của các nhân
tố di truyền. Do đó, phương pháp này đã nhanh chóng thay thế các phương
pháp cơ học và hóa học [22].
Ngoài ra, việc sản xuất enzyme cellulase có hoạt độ cao để phân hủy
cellulose thành các nguồn nhiên liệu sinh học đang được quan tâm đặc biệt
trong ngành công nghiệp năng lượng sạch của toàn thế giới.
17
2.7. Tình hình nghiên cứu enzyme cellulase
2.7.1 Tình hình nghiên cứu trên thế giới
Nghiên cứu và ứng dụng của cellulase bắt đầu từ những năm 1950.
Cuối thế kỉ XIX đã có rất nhiều tác giả nghiên cứu về khả năng tổng hợp
cellulase từ các loại vi sinh vật. Một số nghiên cứu về cellulase từ nấm của
một số tác giả như: Trichoderma reseii (Ogawa và cộng sự, 1991),
Aspergillus sp (Lusta và cộng sự, 1999), Schizophillum commune (Wilick &
Seligy, 1985). Năm 2000, Mawadza và cộng sự đã nghiên cứu về khả năng
sinh tổng hợp cellulase từ các loài vi sinh vật có đặc hiệu cao bao gồm phức
hệ 3 enzyme: endoglucanse, cellobihydrolase, và β- glucosidase thủy phân
hoàn toàn cellulose.
Trong số những nghiên cứu về khả năng sinh cellulase của vi khuẩn thì
Bacillus là chủng có khả năng sản sinh cellulase ngoại bào với số lượng lớn,
và được quan tâm nghiên cứu nhiều hơn cả đặc biệt là: B.subtilis (Park và
cộng sự, 1991), B.polymxa, B.cereus (Robson & Chambliss, 1989),
B.pumilus (Christakopoulo và cộng sự, 1999).
Do cellulase có nhiều ứng dụng, cho nên có rất nhiều nghiên cứu về
enzyme cellulase như: Nghiên cứu về các tính chất lý hóa của chúng như xác
định khối lượng phân tử của Macarron và cộng sự (1993); Sang và cộng sự
(1995); henriksson và cộng sự (1999); Karisson và cộng sự (2001); Coral và
cộng sự (2002); Hiroshi và cộng sự (2005), xác định nhiệt độ tối ưu của Isabel
và cộng sự (1992) ; Macarron và cộng sự (1993) ; Coral và cộng sự (2002), xác
định pH tối ưu (Macarrón và cộng sự, 1993 ; Coral và cộng sự, 2002), xác định

- Kính hiển vi
- Máy nghiền mẫu
- Máy đo OD

20
Hóa chất
STT Hóa chất Nguồn gốc
1 KNO
3
(2,5g) Trung Quốc
2 K
2
HPO
4
(1,0g) Trung Quốc
3 M
g
SO
4
(0,3g) Trung Quốc
4 CaCl
2
(0,1g) Trung Quốc
5 Agar (3%) Việt Nam
6 FeCl
3
( 0.01g) Trung Quốc
7 NaCl (0,1g) Trung Quốc
8 Nước cất
(1000ml)

: 10 g/l
21
MgSO
4
: 0,5 g/l
KCl: 0,5 g/l
NaCl :1%
FeSO
4
: 0,001g
Thạch : 20 g/l
H
2
O : 1 lít
K
2
HPO
4
: 2 g/l
pH : 5 - 6
Môi trường thử hoạt tính: Sử dụng môi trường có thành phần giống với
môi trường Cracek- Dox cơ sở nhưng thay đổi nguồn cacbon bằng CMC
(cacbonxylmethylcellulose) để đánh giá hoạt tính cellulase của các chủng vi
sinh vật, thành phần môi trường như sau:
3.3. Phương pháp nghiên cứu
3.3.1. Phương pháp phân lập
3.3.1.1. Thu thập mẫu
Thu lá cây mục, rơm rạ mục và rác thải ở những nơi khô ráo, mỗi loại
mẫu lấy khoảng 20g mỗi lần, tiến hành lấy mẫu. Mẫu lấy xong sẽ được cho
vào túi nilon rồi đánh dấu và ghi đầy đủ thông tin thời gian và địa điểm được lấy.

Pha loãng mẫu
Pha loãng mẫu là một trong những công đoạn cơ bản nhưng rất quan
trọng trong quá trình phân tích vi sinh vật. Việc pha loãng mẫu ở các nồng độ
thích hợp sẽ giúp ích rất nhiều trong quá trình định lượng cũng như phân tích
vi sinh vật.
Đối với mẫu chất lỏng: Dùng pipet hút 1ml mẫu cho vào ống nghiệm
chứa 9ml dung dịch pha loãng, khi đó ta sẽ được nồng độ pha loãng là 10
-1
.
Tiếp tục từ ống nghiệm 10
-1
hút tiếp 1ml và cho vào ống chứa 9ml dung dịch
pha loãng ta được độ pha loãng 10
-2
. Tiếp tục như vậy đến nồng độ cần thiết khác.
Đối với mẫu rắn: Cân chính xác 10g mẫu, sau đó cho vào 90ml dung
dịch pha loãng để được nồng độ pha loãng 10
-1
. Tiếp tục pha loãng tương tự
như mẫu chất lỏng.
Phân lập
23
Dùng pipet hút lấy 1 ít dung dịch mẫu đó, nhỏ 1 giọt vào hộp peptri
đầu tiên lấy que trang trang đều, rồi vẫn dùng que trang đó trang tiếp vào
khoảng 6 – 7 hộp peptri tiếp theo mà không cần nhỏ thêm dung dịch mẫu vào.
Làm lần lượt như vậy đối với từng mẫu. Sau khi trang mẫu vào các hộp peptri
xong đánh dấu và gói cẩn thận lại đem nuôi trong tủ ấm khoảng 30
0
C.
Thường xuyên kiểm tra các hộp peptri mỗi ngày. Nếu thấy khuẩn lạc

Dùng khoan nút chai khoan các lỗ trên môi trường thử hoạt tính, tương
ứng với từng loại enzyme. Nhỏ vào lỗ khoan 100μm dung dịch enzyme đã
chuẩn bi sẵn, để tủ lạnh 6h – 8h cho enzyme khuếch tán vào môi trường thạch
sau đó cho vào tủ ấm ở 30
0
C trong 24h. Hiện hình vòng phân giải bằng dung
dịch thuốc thử lugon đỏ 1%. Hoạt tính enzyme được xác định bằng hiệu số (D
– d, cm)
Với d: Đường kính lỗ đục
D: đường kính vòng phân giải.
3.3.3. Phương pháp bố trí thí nghiệm xác định điều kiện nuôi cấy thích
hợp
+ Phương pháp xác định thời gian nuôi cấy thích hợp
Nấm mốc được nuôi cấy lắc 200 vòng/ phút ở các khoảng thời gian: 6;
12; 18; 30; 36; 42; 48; 54 và 60h. Sau đó lọc thu sinh khối và xác định hoạt
độ enzyme.
+ Phương pháp xác định nhiệt độ nuôi cấy thích hợp
Nấm mốc được nuôi cấy trên môi trường bán rắn ở các nhiệt độ: 25; 30; 35;
40; 45; 50
o
C. Sau 36- 48h sấy ở nhiệt độ 50
o
C, đem nghiền mịn bằng máy nghiền
bi rồi cho vào đó một lượng nước gấp 4-5 lần khối lượng canh trường để hòa tan
protein- enzyme từ khối canh trường nấm sợi. Sau đó đem xác định hoạt độ
enzyme cellulase.
25