ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI
TRƢỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN
 Ngô Thị Hà

TÁCH DÒNG VÀ BIỂU HIỆN CECROPIN
TRONG CÁC HỆ VECTOR KHÁC NHAU Chuyên ngành: Sinh học thực nghiệm
Mã số: 60.42.30 LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC Cán bộ hƣớng dẫn: PGS. TS. Võ Thị Thƣơng Lan
Hà Nội - 2011
 20
1.3. Sản xuất cecropin theo con đường tái tổ hợp 21
1.3.1. Lựa chọn hệ thống tê
́
ba
̀
o biê
̉
u hiê
̣
n 21
1.3.2. Lựa chọn hệ thống vector biểu hiện 22
1.3.3. Tối ƣu hóa điều kiện biểu hiện 25
1.3.4. Tinh sạch cecropin tái tổ hợp 25
CHƢƠNG 2 - NGUYÊN LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 28
2.1. Nguyên liệu 28
2.1.1. Các hệ vector 28
2.1.2. Các chủng vi khuẩn 28
2.1.3. Các cặp mồi 29
2.1.4. Gel sắc ký ái lực Glutathione Sepharose 4B, Ni-NTA agarose 29
2.1.5. Các hóa chất và thiết bị 30
2.2. Phương pháp 31
2.2.1. Sơ đồ nghiên cứu 31
2.2.1.1. Tách dòng (subclone) các gen cecropin từ các vector nhân dòng sang
vector biểu hiện 32
Luận văn thạc sĩ khoa học 2009-2011
 
3
2.2.1.2. Biểu hiện các cecropin dưới dạng protein dung hợp 33
2.2.1.3. Tinh sạch các cecropin dung hợp 34

KIẾN NGHỊ 73
TÀI LIỆU THAM KHẢO 74
Luận văn thạc sĩ khoa học 2009-2011
 
5
DANH MỤC CÁC BẢNG
Trang
Bảng 1.  9
Bảng 2. 
 10
Bảng 3.  12
Bảng 4.   25
Bảng 5. T  29
Bảng 6.  







 



Hình 10.  33
Hình 11.  34
Hình 12.        cecH  cecN  -cecH 
pJET1.2-cecN  40
Luận văn thạc sĩ khoa học 2009-2011
 
7
Hình 13. cecH, cecN 
XbaXhoI 41
Hình 14. -cecH 
pBS-cecN 
enzyme Xba 41
Hình 15. cecH, cecN -cecH, pBS-cecN (A);
cecT -cecT  43
Hình 16.  -cecropin


(A) 

cecropin  44
Hình 17.              -28a-
cecropin  45
Hình 18. cecH, cecN cecT 
-NcoEcoRI 46
Hình 19.              -32b-
cecropin 

 1% (A, B, C) 



Hình 31-
E. coli 
-PAGE 10% 58
Luận văn thạc sĩ khoa học 2009-2011
 
9
Hình 32-
E. coli E. coli 
  -PAGE
10% 59
Hình 33-cecH (A)
-E. coli -PAGE 12%
60
Hình 34-
E. coli -PAGE 12% 60
Hình 35-n gel SDS-PAGE 10%
62
Hình 36-cecH sau
 -PAGE 12%
63
MỞ ĐẦU
     i 7/4/2011, t           
  
. 
Luận văn thạc sĩ khoa học 2009-2011
 
10

 
 
T
    n  i 7/4/2011   
                 
 



Alexander Fleming (1881-1955) [72, 75]. 

Staphylococcus aureus 
penic    methicillin [7]. Ng nay,  
   tr th 
 v s kho nhn lo. 
 cao Klebsiella (15.1%), E. coli (13.3%), P. aeruginosa
(13.3%), Acinetobacter spp (9.9%)  S. aureus (9.3%). N
          -83%        
fluoroquinolon  
58 
Luận văn thạc sĩ khoa học 2009-2011
 
12
50, 
  [79].                
 80]. 

   [1              
carbapenem (NDM- 
e NDM-1 


  
      -        [1].
 v m 
 (WHO, 2008).


sinh.
1.1.2. Nguyên nhân và giải pháp cho tình trạng kháng kháng sinh


[79]:
Th nh, k  
   
 . 
  ang 


Tuy nhin, 4 nguyn nh l xu ph ch y t ph con ng.  ch l
g h l; c; cng t p
Luận văn thạc sĩ khoa học 2009-2011
 
14
 v thi   
  g ph khng nh d  t tr kh kh sinh hi
nay. V

  
c . 
 

 
.  u
 
[30, 57]   
 tham gia  [20, 28]. 
 . 
  
AMPs 
 [22, 45, 70].

1.2.1.1. Hoạt tính sinh học của AMPs
AMPs  20,
28, 37, 48 
Luận văn thạc sĩ khoa học 2009-2011
 
16


28, 30].
1.2.1.2. Sự đa dạng của AMPs
AMPs 
 [28, 60, 
  
800  37]. D
  , AMPs 
4, 9]:
 
ra do 
  
 

phát triển
Sử dụng trong y học
AM-Pharma
(Phn Lan)
hLF-1-11 (petide nh 
ngun gc t lactoferrin
i)
Phase II
   
 n c  y

Ceragenix
(Denver)
CSA-13 ( 

peptide thuc h thng
bo v )
Tin th nghim

Chng nhim khun
Helix
Biomedix
(USA)
HB-50 (peptide tng hp
t   c
cecropin)
HB-107 (  
axit amin ca cecropin B)
Tin th nghim


(Anh)
Mersaxitin (bacteriocin)
Tin th nghim

  n Gram

Novozymes
A/S
(ch)
Plectasin
(defensin ca nm)
Tin th nghim

i vi khun
  c bit
 ng hp nhim
ph cu khu  khun
u
Pacgen
(Canada)
PAC113 (d  n
ho ng ca histatin 5-
protein c  thy
c bt ca i)
n
 i thuc mi
u
Thuc u u tr
ch  y do nm
   o, rut,

gc t da ch


phase III
Micrologix Biotech
(Vancouver, BC, Canada)
n 12 axit amin 1 loi CAMPs ca
ng v  ng
nhim khu
Phase II
XOMA Corporation
(Santa Monica, CA)
 Neisseria
meningitidis
Phase III
  
                 , -defensin,
 -37, cecropin, magainin

22].
1.2.2.2. Peptide kháng khuẩn cecropin
C
]. Cecropin    Hyalophora
cecropia  [55]
Luận văn thạc sĩ khoa học 2009-2011
 
20
     
 [14, 55]. 
  

GNFFKDLEKMGQRVRDAVISAAPAVDTLAKAKALGQ
Luận văn thạc sĩ khoa học 2009-2011
 
21
 -64 axit amin. Trong
20- 
            
 k-5
- 2ng
  28].  cecropin
A  -terminal
 
--Pro
[23]cropin A  2.

Hình 2. Hyalophora cecropia ch 
23].
1.2.2.2.2a cecropin


Cecropin có phổ hoạt tính kháng khuẩn rộng: 
  k
 14, 26, 32, 36, 60, 61, 66]. , 

-Pro
Luận văn thạc sĩ khoa học 2009-2011
 
22
57]. 


[12]. ,

  3 [28].

Hình 3.  in  
  
   ; ; 
;   [28].
Luận văn thạc sĩ khoa học 2009-2011
 
24
  (A), 
   mixen             (B),
cecropin   

(C), cecropin                
 (D), cecropin 
Do   
m.

 .    
 Pennsylvania 
 .
 mang 
 [24]  
  A. 
              
HIV-1
 virus HIV [61]. 
  cecropin . Cecropin 