CHƯƠNG 5:
SẮC KÝ TRAO ĐỔI ION
I. NGUYÊN TẮC
Sắc ký trao đổi ion là quá trình trong đó dung dịch của một chất điện ly được cho tiếp
xúc với nhựa (resin) trao đổi ion và những ion hoạt động trên bề mặt của nhựa được thế
chỗ bằng những ion có cùng điện tích của dung dịch chất điện ly. Nhựa trao đổi ion là
những chất không tan trong nước, mang những nhóm chức có điện tích, các nhóm chức
này sẽ liên kết với các đối-ion (contre-ions) có trong dung dịch cần phân tích. Nếu nhựa
mang nhóm chức có điện tích dươn,g thì đối-ion sẽ có điện tích âm và sẽ trao đổi với các
ion âm, nhựa loại này được gọi là nhựa trao đổi anion. Ngược lại, nhựa mang các nhóm
chức có điện tích âm, đối-ion có điện tích dương, nhựa thực hiện trao đổi với các ion
dương, nên gọi là nhựa trao đổi cation.
II. PHÂN LOẠI
Nhựa trao đổi anion mang những nhóm chức phân cực amonium tam hoặc tứ cấp (-
CH
2
NR
2
hoặc –CH
2
-N
+
R
3
). Nhựa trao đổi anion thường được sản xuất ở dạng Clorur (Cl
-
)
hơn là dạng hydroxid (OH
-
) vì dạng Clorur bền hơn.
Nhựa trao đổi cation mang những nhóm chức phân cực có tính acid, thường là SO

dễ bị hư hại. Ngoài ra còn có loại nhựa Sepharose (là agarose nối mạng ngang) và
cellulose.
Gần đây trên thị trường có loại hạt nhựa tạo bởi silica. Ngược lại với những hạt nhựa
trên, hạt nhựa silica không trương nở theo thành phần dung môi sử dụng. Hạt nhựa có
nhược điểm là cần có sự ổn định về pH, nhựa bền trong khoảng pH=2-7,5.
II. ĐẶC ĐIỂM CỦA NHỰA TRAO ĐỔI ION
Trong sắc ký trao đổi ion, yếu tố quan trọng nhất là những nhóm chức (thực hiện sự
trao đổi) gắn trên nhựa. Việc trao đổi sẽ xảy ra một phần trên bề mặt dung môi tiếp xúc
với bề mặt hạt nhựa và một phần bên trong hạt nhựa. Người ta thấy rằng với những ion
nhỏ (ion kim loại, anion vô cơ có kích cỡ nhỏ, ion hữu cơ kích cỡ nhỏ) dễ dàng bị hấp thu
hết bởi những nhóm hoạt động của nhựa trao đổi ion. Nhựa có độ nối mạng ngang (cross-
linkage) lớn thì kích thuớc lỗ rỗng nhỏ, có tính lựa chọn cao đối với những ion nhỏ, còn
những ion lớn sẽ bị đuổi ra khỏi cột nhựa.
Nhựa được dùng làm sắc ký trao đổi ion cần có những đặc điểm sau:
- Độ nối mạng ngang 4-8%.
- Kích cỡ hạt càng nhỏ càng tốt.
- Các hạt phải đồng đều.
Trong quá trình trao đổi ion, việc gắn hoặc tách rời các hợp chất ra khỏi nhựa trao đổi
ion là một quá trình hấp phụ thuận nghịch, xảy ra chủ yếu theo lực Vander Walls, và có
tương tác lưỡng cực. Mỗi nhựa được xác định bởi khả năng trao đổi ion của nó. Khả năng
này được xác định bằng số các nhóm chức mang điện tích trên 1g resin khô. Thí dụ, nhựa
có khả năng trao đổi được ghi là 3 meq/g nghĩa là 1g nhựa khô có khả năng trao đổi ion
với 3 milimol loại phân tử đơn diện tích hoặc 1 milimol loại phân tử 3 điện tích.
Nhựa mạnh (acid mạnh, baz mạnh) được sử dụng nhiều hơn loại yếu nhờ thực hiện
việc trao đổi trong khoảng pH mạnh. Các loại nhựa acid yếu và baz yếu chỉ hiện diện ở
dạng ion khi nó ở dạng muối nên hoạt động trong khoảng pH giới hạn.
Nhựa loại baz yếu sẽ hấp phụ các chất có tính acid mạnh và ngược lại.
Những loại nhựa trao đổi ion cổ điển thường không thể tách được những phân tử sinh
học (có tính phân cực mạnh và có điện tích) ra khỏi hỗn hợp của chúng, bởi vì những
phân tử này không chui được vào trong hạt nhựa. Hiện nay, một số loại nhựa thương mại

chúng có mang điện tích trái dấu với điện tích của nhựa. Nếu hợp chất khảo sát chỉ mang
một loại điện tích (điện tích dương hoặc điện tích âm) thì việc chọn nhựa trao đổi ion đơn
giản. Nếu hợp chất khảo sát mang cả 2 loại điện tích thì điện tích toàn phần của hợp chất
sẽ phụ thuộc vào pH. Ở pH nhỏ, hợp chất có điện tích toàn phần là điện tích dương; ở pH
lớn, hợp chất có điện tích toàn phần âm, ở pH=pI (pI là điểm đẳng điện của hợp chất) thì
hợp chất sẽ có điện tích toàn phần là zero, hợp chất sẽ không gắn vào nhựa.
Các protein là hợp chất luỡng cực nên tùy thuộc vào pH mà protein có khả năng gắn
vào nhựa trao đổi anion hay nhựa trao đổi cation.
- Tại pH>pI: phân tử protein ở dạng anion (H
2
N-CR
2
-COO
-
) và chúng sẽ được tách
bởi nhựa trao đổi anion.
- Tại pH<pI: phân tử protein ở dạng canion (H
3
N
+
-CR
2
-COOH) và chúng sẽ được
tách bởi nhựa trao đổi canion.
Tuy nhiên do mỗi loại protein chỉ bền trong một khoảng pH nhất định, vì thế khi chọn
loại nhựa trao đổi ion nào phải xem xét đến khoảng pH ổn định của protein đó.
- Nếu protein không bị hư ở khoảng pH>pI, có thể dùng nhựa trao đổi anion như
DEAE hoặc QAE.
- Nếu protein không bị hư ở khoảng pH<pI, có thể dùng nhựa trao đổi cation như
CM hoặc SP.

IV. DUNG DỊCH ĐỆM VÀ pH
Dung dịch đệm được lụa chọn theo nguyên tắc: dung dịch đệm cation sử dụng cho
nhựa trao đổi anion và ngược lại.
Lựa chọn pH và nồng độ của dung dịch đệm sao cho hợp chất cần khảo sát phải gắn
vào nhựa trao đổi. Các điều kiện về pH và nồng độ của dung dịch không khác biệt nhiều
khi gắn hợp chất vào nhựa cũng như trong quá trình giải ly ra khỏi cột.
pH của dung dịch đệm được chọn sao cho khi ở trong dung dịch đệm đó, hợp chất
khảo sát sẽ có điện tích toàn phần trái dấu với điện tích của nhựa trao đổi.
Dung dịch đệm phải có pH lớn hơn một đơn vị so với điểm đẳng điện của nhựa trao
đổi anion và nhỏ hơn một đơn vị pH so với điểm đẳng điện của nhựa trao đổi cation .
Bảng 13: Các dung dịch đệm thông dụng
Dung dịch đệm Giá trị
Acid citric - Citrat natri 2,0-6,0
Acid acetic - Acetat natri 4,2-5,4
Tris-acid phosphoric 5,0-10,0
Hydrogen phosphat natri 5,0-7,4
Acid boric - borax 6,8-10,0
Tris-acid chlohidric 7,5-9,5
Amoniac - clorur amonium 8,2-10,2
Borax - hydroxid natri 10,6-11,6
Bicarbonat natri - hydroxid natri 9,0-12,0
Triethanolamin 6,7-8,7

V. SẮC KÝ CỘT TRAO ĐỔI ION
V.1. Chuẩn bị nhựa
Muốn cho kết quả tốt cần phải chuẩn bị tốt việc cân bằng nhựa. Nhựa cần phải trương
nở hòan toàn ở pH sẽ sử dụng trong quá trình sắc ký cột.
Nhựa được làm trương nở bằng cách ngâm trong dung dịch đệm thích hợp trong
khoảng 48 tiếng, ở nhiệt độ phòng. Không được khuấy trộn nhựa quá mạnh vì có thể làm
hư hạt nhựa.

H
4
+
NH(C
2
H
5
)
2
-Cl ) với dung dịch đệm acetat
amonium. Đầu tiên nhựa được cho trương nở trong dung dịch acetat amonium hoặc
acetat natri. Các ion Cl
–
của nhựa DEAE sẽ được thay thế bằng ion acetat. Lọc thu lấy
nhựa. Tiếp theo, nhựa DEAE sẽ được cho cân bằng nhiều lần trong dung dịch acetat
amonium có nồng độ bằng nồng độ khi áp dụng cho sắc ký cột.
Nếu biết số lượng hợp chất cần được khảo sát, dựa vào lực của nhựa do nhà sản xuất
cung cấp, có thể biết được số nhựa cần dùng. Thông thường, tỷ lệ giữa thể tích nhựa và
thể tích hợp chất cần sắc ký vào khoảng 10:1 đến 20:1.
V.2. Nhồi cột và nạp mẫu
Thường thì kích thước của cột sắc ký trao đổi ion không quan trọng như quá trình sắc
ký cột hấp phụ. Có thể dùng cột ngắn và có đường kính lớn hơn cột sắc ký hấp phụ. Trên
thị trường có bán sẵn loại cột dùng cho sắc ký cột trao đổi ion, thường dài từ 20-30 cm.
Khi nhồi cột, giữ cột thẳng đứng trên giá. Khóa vòi ở bên dưới cột. Nhựa trao đổi ion
được pha loãng trong dung dịch đệm (pha loãng sao cho có thể rót nhựa vào cột một cách
nhẹ nhàng;. nếu quá đậm đặc, giữa các hạt nhựa có nhiều bọt khí) Để yên từ 5-10 phút
cho hạt nhựa lắng xuống, sau đó rót thêm dung dịch đệm vào cột, mở vòi cho dung dịch
đệm chảy ra giúp cho hạt nhựa đều và ổn định.
Trước khi bắt đầu sắc ký, cần phải cân bằng cột với dung dịch đệm bằng cách cho
dung dịch đệm chảy qua cột (với thể tích dung dịch đệm bằng 2 lần thể tích cột). Cuối

ion. Khi tăng nồng độ dung dịch đệm (thường người ta gia tăng lực ion của dung
dịch đệm bằng cách dùng NaCl cho cả loại nhựa anion và nhựa cation), thì ion của
dung dịch đệm sẽ cạnh tranh với hỗn hợp mẫu, để lấy những nhóm chức hoạt động
mang điện tích của nhựa trao đổi ion. Như thế chất cần sắc ký sẽ tách rời khỏi
nhựa và được giải ly ra khỏi cột.
Nồng độ dung dịch đệm có thể được tăng dần theo 2 cách:
• Nồng độ tăng dần theo tuyến tính: thực hiện bằng cách trộn lẫn 2 dung dịch
đệm có nồng độ khác nhau (cho dung dịch đệm có nồng độ lớn từ từ vào
dung dịch đệm có nồng độ nhỏ).
• Nồng độ tăng bậc thang: dung dịch đệm được pha với những nồng độ khác
nhau. Kỹ thuật này đơn giản, dễ thực hiện. Trong kỹ thuật này, người ta
thường dùng những dung môi hữu cơ để giảm bớt những tương tác với chất
nền, là tương tác xảy ra giữa phần có tính ái nước của phân tử cần sắc ký
với phần ái nước của nhựa trao đổi ion. Hiện tượng này thường gặp khi
phân tử cần sắc ký là hợp chất thơm và nhựa trao đổi ion là polystyren. Sử
dụng hỗn hợp dung môi-muối là để loại bỏ tương tác này. Ngoài ra, dung
môi hỗn hợp cũng tránh được trường hợp phân tử sắc ký trở nên trung tính.
(do điều chỉnh pH) tính ái nước sẽ giảm, không bám vào nhựa nữa mà sẽ kết
tủa. Lúc này dung môi hữu cơ là methanol, acetonitryl là dung môi có thể
hòa tan trong nước, giúp hòa tan chất.
- Vận tốc giải ly được tính theo thể tích dung dịch giải ly ml/giờ. Vận tốc trung bình
khoảng 5-10 ml/phút. Vận tốc này tùy thuộc vào :
• Chiều cao và đường kính cột: cột càng cao thì vận tốc càng giảm. Khi giải
ly bằng cách tăng nồng độ NaCl trong dung dịch đệm: càng tăng nồng độ
NaCl thì chiều cao cột nhựa càng giảm, gây nên việc gia tăng vận tốc. Muốn
tránh điều này thì nên sử dụng một bơm đẩy để bơm dung dịch đệm vào đầu
cột thay vì để dung môi giải ly ra khỏi cột bằng trọng lực.
• Độ nhớt của dung dịch mẫu: độ nhớt của dung dịch mẫu chất giảm thì vận
tốc giải ly sẽ tăng.
• Loại nhựa: các nhựa trao đổi A-25 và C-25 là những hạt rắn chắc, nên

DEAE Sephadex C-25 Pharmacia Dietilaminoetil Cl
-
Dextran 50 2-12 100-400
40-120
Amberlite IRA-35 Rohm và Haas Dietilaminoetil Baz tự do Acrylic DVB 110 0-9 16-50
500-1000
Amberlite IRA-68 Rohm và Haas Dietilaminoetil Baz tự do Acrylic DVB 160 0-7 16-50
500-1000
Amberlite A-21 Rohm và Haas Dietilaminoetil Cl
-
Styren DVB 260 0-9 500
Diaion WA-10 Mitsubishi Dietilaminoetil Baz-tự do Poliacrylat 120 0-9 40-60
350-550
Diaion WA-20 Mitsubishi Poliamin Baz-tự do Polistyren 250 0-9 40-60
350-550
TSKgel DEAE-5PW TosoHaas Dietilaminoetil Cl
-
Metacrylat có
lỗ rỗng
>10 2-12 >400
10
TSKgel DEAE-2SW TosoHaas Dietilaminoetil Cl
-
Silica >30 2-7,5 >400
5
Bảng 15: Nhựa trao đổi anion mạnh
Tên thương mại Hãng sản xuất Nhóm chức Đối-
ion
Chất mang Khả năng
trao đổi

Diaion SA10A Mitsubishi Trimetilbenzyl
hidroxietil
amonium
Cl
-
Polistyren 130 0-14 40-60
350-550
Amberlite IRA-
900
Rohm và Haas Trimetilbenzyl
Amonium
Cl
-
Polistyren có lỗ rỗng 100 0-14 16-50
500-1000
Daion PA-312 Mitsubishi Trimetilbenzyl
amonium
Cl
-
Polistyren có lỗ rỗng
nối mạng 6%
120 0-14 16-50
500-1000
QAE-Sephadex
A-25
Pharmacia Aminoetil tứ cấp Cl
-
Dextran 50 2-12 100-400
40-120
TSKgel SAX TosoHaas Aminoetil tứ cấp Cl

Dianion WK10 Mitsubishi Acid
carboxilic
H
+
Polimetacrylat 250 5-14 40-60
350-550
Duolite C-433 Rohm và
Haas
Acid
carboxilic
H
+
Polistyren 420 5-14 16-50
500-1000
Dianion CR 10 Mitsubishi Acid
carboxilic
Na
+
Polistyren 50 1-5 40-60
350-550
Cellex CM Bio Rad Carboximetil H
+
Cellulose 70 5-12 200-400
TSKgel CM-3SW TosoHaas Carboximetil Na
+
Silica >30 2-7,5 >400
10
Bảng 17: Nhựa trao đổi Cation mạnh
Tên thương mại Hãng sản
xuất

8%
170 0-14 50-100
Diaion SK1B Mitsubishi Acidsulfoni
c
Na
+
Polistyren 190 0-14 40-60
400-600
Amberlite IR-I22 Rohm & Haas Acidsulfoni
c
Na
+
Polistyren nối
10%
210 0-14 16-50
500-1000
Diaion SK122 Mitsubishi Acidsulfoni
c
Na
+
Polistyren nối
12%
210 0-9 16-50
500-1000
TSKgel Sp-5PW TosoHaas Acidsulfoni
c
Na
+
Metacrylat >10 2-12 >400
10