NGHIÊN CỨU CHUYỂN HÓA CHITIN/CHITOSAN BẰNG PHƯƠNG PHÁP
THỦY PHÂN ENZYME THANH VẬT LIỆU HẤP THỤ TRONG XỬ LÝ Ô
NHIỄM MÔI TRƯỜNG
Nguyễn Ngọc Lương, Nguyễn Thạc Hòa,
1
Trần Thị Quý Mai,
2
Nguyễn Thị Ninh,
3
Nguyễn Văn Thiết
Viện Chăn nuôi; ;
1
Sở Y tế Bắc Giang;
2
Sở Giáo dục và Đào tạo Hưng Yên;
3
Viện Công nghệ Sinh học
TÓM TẮT
Thủy phân chitin/chitosan b
ng phương pháp enzyme có nhi u ưu ñiểm hơn
các phương pháp hóa học. Trong nghiên cứu này, sử dụng enzyme bromelain thu
nhận từ phụ phẩm chế biến dứa ñể thủy phân chitin/chitosan thành vật liệu hấp phụ
sinh học kích thước nano rất có hiệu quả. Sau khi nghiên cứu ñộng học của phản ứng
thủy phân chitosan bằng enzyme bromelain, ñã xác ñịnh ñược các ñiều kiện tối ưu cơ
bản cho quá trình là: pH = 3,5; nhiệt ñộ = 60oC; tỉ lệ enzyme/cơ chất là 150 µl chế
phẩm enzyme cho 7,5 ml dung dịch cơ chất 0,2%. Ngoài ra còn xác ñịnh ñược ảnh
hưởng của n ng ñộ các muối NaCl và (NH4)2SO4 lên hoạt tính của bromelain. Dùng
bromelain thủy phân chitosan từ kích thước trung bình ban u là 2800 nm ñã tạo ra
ñược sản phẩm kích thước 645 nm, ñạt tiêu chuẩn kích thước nano.
1. Đặt vấn ñề
Cùng với sự phát triển nhanh về kinh tế, Việt Nam ñang phải ñối mặt với vấn ñề

và cs., 2001; Davila M G và cs., 1991;…). Do quá trình thủy phân ñể tạo kích thước
nano hiện nay chủ yếu là sử dụng phương pháp hóa học (acid HCl ñặc) và còn tồn tại
một số nhược ñiểm như cắt mạch không ñịnh hướng, có nhiều sản phẩm phụ, khó tinh
chế, chi phí tốn kém, hiệu suất thấp, gây ô nhiễm môi trường và sản phẩm có hoạt
tính không cao nên nghiên cứu thủy phân chitin/chitosan bằng phương pháp enzyme
là một hướng ñi có nhiều triển vọng vì ñiều kiện phản ứng mềm, dễ dàng ñiều khiển
ñược quá trình, sạch và thân thiện với môi trường. Dễ dàng thu nhận ñược từ phụ
phẩm chế biến dứa, bromelain ñược coi là một nguồn enzyme sẵn có tại Việt Nam với
giá thành rẻ hơn rất nhiều so với các enzyme ñặc hiệu thủy phân chitosan khác như
chitinase và chitosanase. Không dừng lại ở mục tiêu tạo ñược vật liệu có kích thước
nano từ chitin/chitosan, các nghiên cứu của chúng tôi sẽ góp phần sử dụng hiệu
quả/triệt ñể hơn nguồn phế phụ phẩm chế biến nông/ thủy hải sản (vỏ tôm, cua; ngọn
vỏ, bã dứa,…), giảm thiểu ô nhiễm môi trường sinh thái do các hoạt ñộng này gây ra.
Báo cáo này trình bày kết quả “Nghiên cứu chuyển hóa chitin/chitosan bằng phương
pháp thủy phân enzyme thành vật liệu hấp phụ trong xử lý ô nhiễm môi trường”.
2. Vật liệu và phương pháp nghiên cứu
2.1. Vật liệu
- Chitin/chitosan thành phẩm (từ vỏ tôm, cua,…)
- Enzyme Bromelain (từ vỏ dứa)
2.2. Hóa chất và thiết bị
Hóa chất
: Acid acetic, NaCl, KOH, (NH
4
)
2
SO
4

Trong tất cả các thí nghiệm mẫu chitosan ñược pha trong dung dịch acid acetic
1% hoặc trong các dung dịch ñệm acetate có pH trong vùng từ 2 ñến 6 ñược chuẩn bị

phẩm theo thời gian);
- Nghiên cứu mối phụ thuộc tốc ñộ thủy phân (sự biến ñổi của thời gian chảy t
hay ñộ nhớt) vào nồng ñộ của cơ chất (ở ñây là chitosan), tương ñương với ñộng học
bão hòa enzyme bởi cơ chất (ñộng học P – [S]);
- Nghiên cứu mối phụ thuộc tốc ñộ quá trình thủy phân (hay thời gian chảy hoặc
sự biến ñổi ñộ nhớt) vào nồng ñộ của enzyme (ñộng học P – [E]);
- Nghiên cứu mối phụ thuộc của quá trình thủy phân vào pH (xác ñịnh giá trị pH
tối ưu), nhiệt ñộ, lực ion…
2.3.3. Phương pháp ño ñộ nhớt và xác ñịnh kích thước phân tử của các polymer
thẳng
Việc ño ñộ nhớt của một dung dịch ñược quy về ño thời gian chảy của nó trong
nhớt kế. Để ñạt ñược mục ñích này, cần chuẩn bị một seri dung dịch chitosan có nồng
ñộ nhỏ hơn 0,1% (trong vùng từ 0,005 ñến 0,1%) trong dung dịch acid acetic 1%, sau
ñó ño thời gian chảy của các dung dịch này (kí hiệu là t, s) và của dung môi (acid
acetic 1%, kí hiệu là t
0
, s). Từ các kết quả xác ñịnh thời gian chảy của các dung dịch
này sẽ tính ñược ñộ nhớt tương ñối (η
tñ
= t/t
0
), ñộ nhớt riêng (η
r
= (t – t
0
)/t
0
= η
tñ
– 1)

mẫu chitosan, áp dụng công thức Mark-Houwink-Sakurada xác ñịnh kích thước phân
tử ban ñầu của mẫu chitosan cơ chất;
- Nghiên cứu mối phụ thuộc tốc ñộ thủy phân vào nồng ñộ cơ chất: Chuẩn bị các
dung dịch chitosan nồng ñộ từ 0,1 ñến 0,5 % sau ñó cho thêm một lượng enzyme như
nhau (100µl) vào 7,5ml dịch cơ chất, lắc ñều và ño ngay thời gian chảy của hỗn hợp
phản ứng, tiếp theo cứ cách 5 phút lại ño 1 lần thời gian chảy của hỗn hợp phản ứng;
- Nghiên cứu mối phụ thuộc tốc ñộ thủy phân vào nồng ñộ enzyme: Phản ứng
thủy phân ñược tiến hành với dung dịch cơ chất nồng ñộ 0,2% và các lượng enzyme
khác nhau từ 25 ñến 200 µl chế phẩm enzyme cho 7,5ml dịch cơ chất. Cách ño thời
gian chảy của hỗn hợp phản ứng như trên;
- Trong các trường hợp: a) nghiên cứu ảnh hưởng của pH ñến tốc ñộ thủy phân,
chuẩn bị seri dịch chitosan 0,2% trong ñệm acetate pH từ 2,0 ñến 6,0; b) nghiên cứu
ảnh hưởng của lực ion lên quá trình thủy phân - chuẩn bị seri dung dịch chitosan 0,2%
trong acid acetic 1% chứa NaCl nồng ñộ từ 25 ñến 150 mM hoặc (NH
4
)
2
SO
4
từ 1,25
ñến 20 mM, sau ñó phản ứng thủy phân trong tất cả các trường hợp ñược tiến hành
với một lượng enzyme như nhau cho mỗi 7,5ml dung dịch cơ chất, ño thời gian chảy
của hỗn hợp phản ứng như trên;
- Nghiên cứu ảnh hưởng của nhiệt ñộ ñến khả năng thủy phân: Tiến hành phản
ứng thủy phân ở các nhiệt ñộ 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90
o
C với lượng enzyme như
nhau ở nồng ñộ chitosan 0,2%, sau 10 phút cho dừng phản ứng, ñể vào ngăn ñá tủ
lạnh. Trước khi ño thời gian chảy lấy ra cho cân bằng với nhiệt ñộ phòng;
2.3. Phương pháp xử lý số liệu

0 0.02 0.04 0.06 0.08 0.1 0.12
C, %
ĐNRG

Hình 1. Đồ thị biểu diễn mối phụ thuộc của
η
rg
của mẫu chitosan vào nồng ñộ dung
dịch của nó
Trong thí nghiệm xác ñịnh khối lượng phân tử nhớt trung bình của mẫu cơ
chất chitosan ban ñầu, từ các số liệu ño thời gian chảy của các dung dịch nồng ñộ từ
0,01 ñến 0,1%, ñã tính ñược η
tñ
, η
r
, và η
rg
của nó (bảng 1). Từ ñồ thị biểu diễn mối
phụ thuộc của η
rg
và nồng ñộ dung dịch chitosan (hình 1) ñã xác ñịnh ñược ñộ nhớt
ñặc trưng [η] của mẫu chitosan cơ chất này là 23,069 (giá trị b của phương trình hồi
quy trên hình 1), t ng ứng với M
r
nhớt khoảng 820 kDa và chiều dài trung bình
mạch polysaccharide của mẫu cơ chất này là ~2800 nm.
Theo Dutta và cs (2004), M
r
của chitosan từ một ñến vài triệu dalton. Mẫu
chitosan chúng tôi sử dụng trong nghiên cứu có khối lượng phân tử nhỏ hơn giá trị

t, s
C = 0.5 C = 0.4
C = 0.3 C = 0.2
C = 0.1

(a)

0
100
200
300
400
500
0 5 10 15 20 25 30
T, min
∆
t, s
C = 0.5 C = 0.4 C = 0.3
C = 0.2 C = 0.1 (b) 0
100
200
300
400
500

nghĩa là ñể thủy phân một cách hiệu quả chitosan bằng chế phẩm bromelain cần phải
sử dụng không dưới 150 µl chế phẩm enzyme này cho 7,5 ml dung chitosan 0,2%.
0
20
40
60
80
100
0 5 10 15 20 25 30 35
T, min
t, s
0,025 ml 0,050 ml 0,100 ml
0,150 ml 0,200 ml

(a)

0
20
40
60
80
0 50 100 150 200 250
[E],
µ
l
∆
t, s
1 2 3

(b)


(a)
0
10
20
30
40
0 1 2 3 4 5 6 7
pH
∆
t, s

(b)
Hình 4. Mối phụ thuộc của phản ứng thủy phân chitosan do bromelain xúc tác vào
pH

3.2.4. Kết quả nghiên c u ảnh hưởng của nhiệt ñộ ñến phản ứng thủy phân
Theo quy luật của các phản ứng hóa học thông thường, vận tốc phản ứng
enzyme tăng khi tăng nhiệt ñộ, nhưng vì enzyme có bản chất là protein do ñó ñối với
mỗi enzyme thường tồn tại một nhiệt ñộ tối thích nhất ñịnh. Hình 5 biểu diễn mối phụ
thuộc quá trình thủy phân chitosan do bromelain xúc tác vào nhiệt ñộ.

0
20
40
60
80
100
20 30 40 50 60 70 80 90 100
T,

o
C) và hãng Sigma (55
o
C).
3.2.5. Kết quả nghiên c
u ảnh hưởng của lực ion ñến phản ứng thủy phân
Ngoài những yếu tố quan trọng kể trên ảnh hưởng tới hoạt ñộng của enzyme, thì
lực ion (nồng ñộ muối) cũng ảnh hưởng tới hoạt tính xúc tác của enzyme. Vì vậy
chúng tôi ñã nghiên cứu ảnh hưởng của nồng ñộ muối NaCl và (NH
4
)
2
SO
4
ñến phản
ứng thủy phân chitosan do bromelain xúc tác. Kết quả các nghiên cứu này ñược trình
bày trên hình 6 ñã cho thấy lực ion không chỉ làm giảm ñộ nhớt của dung dịch
chitosan, mà còn ảnh hưởng mạnh lên quá trình thủy phân của nó do bromelain xúc
tác: Các ñồ thị ∆t – T khi không có mặt các muối NaCl (ở nồng ñộ 25 – 150 mM) và
(NH
4
)
2
SO
4
(ở nồng ñộ 1,25 – 20 mM) nằm cao hơn rất nhiều so với khi có mặt muối
này trong hỗn hợp phản ứng (hình 6 a
c). Các ñồ thị trên hình 6b và 6d cũng cho
thấy thời gian chảy của dung dịch cơ chất trong hỗn hợp phản ứng (tương ứng với ts
thủy phân) giảm rất mạnh ngay cả ở các nồng ñộ muối rất thấp (1,25 mM ñối với

[NaCl], mM
∆
t, s

(b)
0
20
40
60
80
100
0 2 4 6 8 10
T, min
∆
t, s
0 1.25 2.5
5 10 15
20

(c)
0
20
40
60
80
100
0 3 6 9 12 15 18 21
[(NH
4
)

rg

0.01 12,733 1,213 0,213 21,270
0.02 17,233 1,641 0,641 32,063
0.03 23,733 2,260 1,260 42,011
0.04 33,867 3,225 2,225 55,635
0.05 47,667 4,540 3,540 70,794

y = 1227.9x + 7.6073
0
10
20
30
40
50
60
70
80
0 0.01 0.02 0.03 0.04 0.05 0.06
[S], %

η
rg

Hình 7. Đồ thị biểu diễn mối phụ thuộc của
η
rg
của mẫu sản phẩm thủy phân
chitosan vào nồng ñộ dung dịch của nó
Mẫu sản phẩm thủy phân chitosan này có ñộ nhớt ñặc trưng [η] = 7,6073, tương

1. Nguy
n Thạc Hòa, Nguyễn Ngọc Lương, Bùi Huy Hi n và cs (2009). Kết quả ñánh
giá khả năng sử dụng chế phẩm vi sinh vật trong xử lý nhanh phế thải rắn và nước
thải sau biogas tại cơ sở chăn nuôi lợn, gà quy mô tập trung. (Báo cáo nghiệm thu
ñề tài trọng ñiểm cấp Bộ: Nghiên cứu chế phẩm vi sinh vật xử lý nhanh phế thải
chăn nuôi – 2010);
2. Vũ Công Phong (2009). Những ñặc ñiểm của chitin, chitosan và dẫn xuất.
www.hoahocvietnam.com;
3. Trịnh Quang Tuyên, Nguyễn Quế Côi và cs (2009). Kết quả sử dụng dung dịch
anolit ñể giảm thiểu mùi hôi và cải thiện môi trường chuồng nuôi tại Trạm nghiên
cứu nuôi giữ giống lợn hạt nhân Tam Điệp. Báo cáo khoa học năm 2008 - Viện
Chăn nuôi 2009.
4. Allan G G, Peyron M (1995). Molecular weight manipulation of chitosan. I:
Kinetics of depolymerization by nitrous acid. Carbohydr. Res., Vol 277 No 2, pp.
257-272;
5. Alves M N, Mano J F (2008). Chitosan derivatives obtained by chemical
modification for bio medical and environmental applications. International Journal
of biological macromolecules. Vol 43, pp. 401-414;
6. avila M G, Pena J P, Casiano J M (1991). Lindane adsorption-desorption on
chitin in seawater. Intern J Enviro Anal Chem. Vol 46, pp. 175-186;
7. Dutta P K, Dutta J and Tripathi V S (2004). Chitin and chitosan: chemistry,
properties and applications. Journal of scientific
industrial research. Vol. 63, pp.
20-31;
8. Kim S H, Song H, Nisola M G, Ahn J, Galera M M, Lee C H, ChungW J (2006).
Adsorption of lead(II) ions using surface-modified chitins. J. Ind. Eng. Chem.,
Vol 12 No3, pp. 469-475;
9. Kumar A B V, Varadaraj M C, Gowda L R, Tharanathan R N (2005).
Characterization of chito-oligosaccharides prepared by chitosanolysis with the aid
papain and pronase, and their bactericidal action against Baccillus cereus and

chitosan membranes kinetics and equilibrium studies. Progress on chemistry and
application of chitin and its. Vol 15, pp. 73-78.