BỘ KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ
ĐỀ TÀI NGHIÊN CỨU CƠ BẢN TRONG KHOA HỌC TỰ NHIÊN BÁO CÁO TỔNG HỢP
KÉT QUẢ THỰC HIỆN CỦA ĐỀ TÀI
Tên đề tài: Nghiên cứu một số nhóm vi khuẩn đóng vai trò chủ đạo trong
chu trình Nitơ và Phospho nhằm mục đích ứng dụng để xử lý ô
nhiễm môi trường
Mã số: 621506
Lĩnh vực: Khoa học sự sống
Chủ nhiệm đề tài: TS. Đinh Thuý Hằng
Đơn vị chủ trì: Viện Vi sinh vật và Công nghệ sinh học
Đại học Quốc gia Hà nội

Hà nội, tháng 1 năm 2009

2
MỤC LỤC

I. THÔNG TIN CHUNG VỀ ĐỀ TÀI
1. Tên đề tài: Nghiên cứu một số nhóm vi khuẩn đóng vai trò chủ đạo trong chu
trình Nitơ và Phospho nhằm mục đích ứng dụng để xử lý ô nhiễm
môi trường
Mã số: 621506
Lĩnh vực: Khoa học sự sống Hướng: Vi sinh vật học
2. Chủ nhiệm đề tài: TS. Đinh Thúy Hằng
3. Đơn vị chủ trì: Viện Vi sinh vật và Công nghệ Sinh học - ĐHQGHN
Địa chỉ: E2, 144 Xuân thủy, Cầu giấy – Hà nội
Số điện thoại: 04 7547407
4. Danh sách cán bộ tham gia chính:
STT
Họ và tên
Học vị
Chức danh
Nơi công tác
1
Đinh Thúy Hằng
TS. sinh học
Chủ nhiệm ĐT
Viện VSV & CNSH
2
Nguyễn Minh Giảng
CN Công nghệ
môi trường
Thành viên
Viện VSV & CNSH
3
Thái Mạnh Hùng
KS Công nghệ

3
tế bào/ml và
mẫu dịch từ bể xử lý kỵ khí nước thải nhà máy bia Thanh hóa hoàn toàn không có AOB.
Như vậy số lượng AOB tỷ lệ nghịch với nồng độ chất hữu cơ, hay nói cách khác số lượng
AOB phụ thuộc rõ ràng vào nồng độ ôxy hòa tan trong các mẫu (Bảng 1).
Bảng 1. Số lượng vi khuẩn AOB và NRB trong các mẫu nghiên cứu
Mẫu nghiên cứu
Số lượng AOB
(tế bào/ml)
Số lượng NRB (tế bào/ml)
Na-Lactat
Na-Acetat
Na-Benzoat
Hồ Ba Mẫu tầng mặt
2,1 x 10
9

KXĐ Hồ Ba Mẫu tầng đáy
KXĐ
2,4 x 10
82,4 x 10
8

Đầm tôm Quảng ninh

4
+

1
AOB 3
Khuẩn lạc tròn, lõm, riềm trơn, màu
trắng đục, mỏng, kích thước 3 mm.
++
2
AOB 10
Khuẩn lạc tròn, mỏng, riềm nhăn-ướt,
màu trắng, kích thước 2 - 4 mm
++
3
AOB 12
Khuẩn lạc tròn, mỏng, riềm nhăn, kích
thước 1-5 mm có 2 phần lồi, phần ngoài
lồi tạo thành vòng tròn và phần giữa ướt,
màu trắng
++
4
AOB 13
Khuẩn lạc tròn, mỏng, riềm nhăn, kích
thước 1-5 mm, màu trắng, có 2 phần lồi,
phần ngoài lồi tạo thành vòng tròn và
phần giữa ướt màu sẫm
+

5
5


Hình 1. Khả năng chuyển hóa ammonium của các chủng AOB đại diện.
Như vậy hoạt tính sinh học của các chủng AOB cũng rất khác nhau. Hai chủng có
hoạt tính cao là AOB3 và AOB15 được lựa chọn để tiến hành nghiên cứu về các đặc điểm
sinh lý, sinh hóa và phân loại dựa trên phân tích trình tự 16S rADN.
Quan sát hình thái dưới kính hiển vi quang học, chủng AOB3 gồm các tế bào trực
khuẩn ngắn (kích thước 1 2-3 m), trong khi đó chủng AOB15 gồm các tế bào trực
khuẩn dài (kích thước 13-5 m) có xu hướng kết nối với nhau tạo chuỗi ở giai đoạn sau
của quá trình nuôi cấy (Hình 2).

6

Hình 2. Hình thái tế bào của hai chủng vi khuẩn AOB3 và AOB15 quan sát dưới
kính hiển vi quang học.
Điều kiện sinh trưởng tối ưu của hai chủng vi khuẩn này cũng được tiến hành
nghiên cứu, kết quả được tổng hợp trong bảng 3.
Bảng 3. Điều kiện sinh trưởng tối ưu của hai chủng vi khuẩn AOB3 và AOB15
STT
Yếu tố sinh trưởng
Chủng vi khuẩn
AOB3
AOB15
1
Nhiệt độ (C)
20 – 37
25 – 28
2
pH môi trường
6 – 9
5 – 9

là Thermomonas sp.
1.1.1.2 Vi khuẩn khử nitrat (NRB)
Khác với vi khuẩn AOB, vi khuẩn khử nitrat (NRB) có mặt với số lượng tương đối cao ở
các mẫu phân tích, đặc biệt là mẫu bùn từ hồ Ba Mẫu và đầm tôm ở Quảng ninh (Hình 3).
Mẫu lấy từ bể xử lý kỵ khí có số lượng NRB thấp hơn 100 lần, có thể giải thích bằng sự
cạnh tranh cao của các nhóm vi sinh vật kỵ khí khác như sinh metan hay khử sulfat trong
dạng môi trường này.
AOB3
AOB15

7 0
100
200
300
Hồ Ba Mẫu Bể xử lý nước
thải
Đầm tôm Quảng
ninh
Triệu TB/ml
Na-lactat
Na-benzoat

Hình 3. Số lượng NRB trong các mẫu thu thập từ các môi trường sinh thái khác nhau
Thông qua phương pháp làm dãy pha loãng trên môi trường kỵ khí thạch bán lỏng,
hiện tại chúng tôi đã phân lập được 22 chủng vi khuẩn kỵ khí khử nitrat trên các nguồn cơ
chất khác nhau (Bảng 4).
Bảng 4. NRB phân lập được trên các nguồn cơ chất khác nhau

Hình 4. Phổ điện di 16S rADN của 12 chủng NRB sau khi xử lý bằng enzym giới hạn MspI và
HaeIII trong phân tích RFLP

Hình 5.Phổ băng điện di biến tính (DGGE) của các mẫu nuôi tích lũy và các chủng đơn NRB.
(A) Na-lactat: L0-L2 là kí hiệu các mẫu nuôi tích lũy; LF1, LF3, LF4, N1, N2, N3, LB2,
LB4 là kí hiệu các chủng đơn. (B) Na-benzoat: B0-B2 là kí hiệu các mẫu nuôi tích lũy;
BF1, BF3, BB2, BB3 là kí hiệu các chủng đơn. 1-18: tên các băng điện di.
Kết quả thu được cho thấy một số nhóm vi khuẩn đã được tích luỹ trong quá trình
làm giàu (được thể hiện bằng các băng điện di ở lần làm giàu cuối cùng). Hai chủng LF1
(băng điện di số 8) và BB3 (băng điện di số 14) đại diện cho các nhóm vi khuẩn đã được
làm giàu trên hai nguồn cơ chất khác nhau là Na-lactat và Na-benzoat được lựa chọn để
tiến hành nghiên cứu sâu về khả năng ứng dụng.
Xác định hoạt tính khử nitrat của hai chủng này theo thời gian (với nguồn cơ chất
tương ứng là Na-lactat và Na-benzoat) (Hình 6) cho thấy tốc độ khử ở chủng LF1 cao hơn
rõ rệt so với chủng BB3. Tuy nhiên điều này có thể do sự khác nhau về cơ chất dẫn đến,
benzoat là hợp chất có vòng thơm, khó bị ôxy hoá hơn so với lactat. Ở cả hai chủng, hoạt
tính khử nitrat cao nhất trong 5 ngày đầu nuôi cấy. Cả hai chủng đều có tiềm năng ứng
dụng trong việc xử lý nguồn thải nhiễm nitrat cao.
LF1 LF3 LF4 N1 N2 N3 LB2 LB4 BF1 BF3 BB2 BB3 M

HaeIII
M LF1 LF3 LF4 N1 N2 N3 LB2 LB4 BF1 BF3 BB2 BB3

MspI
1000
bp
1500
500
100
L0 L1 L2 LF1 LF3 LF4 N1 N2 N3 LB2 LB4

14
14

9
0.000
0.700
1.400
2.100
2.800
3.500
4.200
0 24 48 72 96 120 144 168 192 216
Thời gian (h)
Nồng độ nitrat (mM/l)
LF1
BB3

Hình 6. Khả năng khử nitrat của hai chủng LF1 và BB3
So sánh trình tự 16S rADN cho phép đặt tên chủng LF1 là Ochrobactrum sp. (loài
gần nhất là Ochrobactrum cytisi, 99% tương đồng) và chủng BB3 là Paracoccus sp. (loài
gần nhất là Paracoccus sp. KS-11, 96% tương đồng). Cả hai chi Ochrobactrum và
Paracoccus đều thuộc lớp α - Proteobacteria và được biết đến với nhiều loài có khả năng
hô hấp với nitrat trong điều kiện không có ôxy.
1.1.1.3 Vi khuẩn cố định nitơ
Trong khuôn khổ đề tài này chúng tôi tiến hành nghiên cứu sự đa dạng của vi khuẩn cố
định nitơ trong môi trường rừng ngập mặn, là môi trường còn ít được nghiên cứu về nhóm
vi sinh vật này. Mẫu trầm tích để nghiên cứu được thu thập tại rừng phòng hộ Cần Giờ,
Tp HCM. Để đánh giá mức đa dạng của vi khuẩn cố định nitơ chúng tôi đã sử dụng
phương pháp thiết lập và đánh giá thư viện gen nifH mã cho dinitrogenase reductase của
phức hợp enzyme nitrognase. Phương pháp này cho phép đánh giá sự đa dạng không qua

tinh sạch. Khả năng tích lũy phosphat của các chủng được đánh giá một cách định tính
thông qua phương pháp nhuộm tế bào bằng dung dịch toluidin xanh, cho phép phát hiện
các hạt dự trữ poly P phân biệt với các cấu trúc khác của tế bào dưới kính hiển vi quang
học (Hình 8). Các chủng có tỷ lệ tế bào chứa hạt polyphosphat cao sau 48 h nuôi cấy được
0%
10%
20%
30%
40%
0%
10%
20%
30%
40%
Geobacter sp.
Desulfovibrio sp. sp.
Vibrio sp.
Spirochaete sp.
Wolinella sp.
Dechloromonas sp.
Methylomonas sp.
VK cố định nitơ
chưa phân lập được
0 – 5 cm
Desulfovibrio sp. sp.
Wolinella sp.
Vibrio sp.
Pseudomonas sp.
VK cố định nitơ
chưa phân lập được

Đặc biệt trong trường hợp chủng FW-Pp2, nồng độ phosphat giảm tới trên 90% sau 2
ngày nuôi cấy. Đây là những kết quả trong phòng thí nghiệm cho thấy khả năng ứng dụng
các chủng vi khuẩn đang nghiên cứu vào việc loại phosphat từ nguồn ô nhiễm bên ngoài.
Bên cạnh đó, điều kiện sinh trưởng tối ưu của hai chủng FW-Pp2 và FW-Pp4 cũng
được xác định để làm cơ sở cho việc kiểm soát hoạt động của chúng khi được đưa ra môi
trường (Bảng 5). Kết quả cho thấy cả hai chủng đều có khả năng sinh trưởng trong điều
kiện nhiệt độ, độ pH và nồng độ muối thay đổi trong biên độ lớn, đây là một trong những
yếu tố thuận lợi tạo điều kiện sống sót và cạnh tranh cao của chúng khi được đưa ra môi
trường bên ngoài.
Bảng 5. Điều kiện sinh trưởng tối ưu của hai chủng vi khuẩn FW-Pp2 và FW-Pp4
STT
Yếu tố sinh trưởng
Chủng vi khuẩn
FW-Pp2
FW-Pp4
1
Nhiệt độ (C)
28 – 37
28 – 37
2
pH môi trường
6 – 8
6 – 8
3
Nồng độ muối (%)
0 – 8
0 – 3
4
Mối tương quan với ôxy
Hiếu khí

Song song với vi khuẩn hiếu khí, vi khuẩn polyP kỵ khí khử nitrat cũng được nuôi
tích tũy trong môi trường khoáng chứa nitrat làm chất nhận điện tử, sau đó phân lập trên
ống môi trường thạch bán lỏng. Bằng các phương pháp này, 4 chủng polyP kỵ khí khử
nitrat đã được phân lập, trong đó hai chủng có nguồn gốc từ môi trường nước ngọt (FW-
PN2 và FW-PN7) và hai chủng có nguồn gốc tư môi trường nước lợ (BW-PN2 và BW-
PN9). Tuy nhiên thí nghiệm xác định khả năng tích luỹ phosphat định tính thông qua
phép nhuộm toluidin blue đối với cả 4 chủng này chưa cho kết quả dương tính.
1.2. Ý nghĩa khoa hoc của kết quả nghiên cứu
Trong đề tài này chúng tôi đã tiến hành nghiên cứu các nhóm vi khuẩn chính tham gia hai
chu trình nitơ và phospho ở 3 dạng môi trường đại diện là nước ngọt, nước lợ và nước
nhiễm hữu cơ cao. Kết quả thu được của đề tài đã thể hiện một số điểm mới so với các
nghiên cứu đã tiến hành trước đây như sau:
- Áp dụng một số phương pháp sinh học phân tử (như RFLP, DGGE, thiết lập và
phân tích thư viện gen) để nghiên cứu tính đa dạng của vi sinh vật mà không thông qua
bước phân lập.
- Xác định được tính đa dạng cao của các nhóm tham gia chu trình nitơ, đặc biệt là
vi khuẩn khử nitrat và vi khuẩn cố định nitơ. Bên cạnh đó cũng xác định được các nhóm
chiếm ưu thế đối với mỗi nhóm chức năng.
- Bằng phương pháp vi sinh truyền thống đã phân lập và tuyển chọn được các
chủng vi khuẩn ôxy hoá ammonium, khử nitrat và tích luỹ phosphat đại diện.
- Đã xác định được hoạt tính sinh học, nghiên cứu điều kiện sinh trưởng cũng như
đặc điểm phân loại của các chủng vi khuẩn đã phân lập nhằm đánh giá khả năng ứng dụng
của chúng trong việc xử lý ô nhiễm môi trường.
1.3. Ý nghĩa thực tiễn và khả năng ứng dụng kết quả khoa học
Nitơ và phospho là hai yếu tố hoá học quan trọng đối với mỗi quá trình xử lý ô nhiễm.
Việc làm cân bằn hai yếu tố này cùng với các yếu tố xử lý khác như nguồn cacbon,
ôxy, quyết định thành công của quá trình xử lý. Trên cơ sở đó, những kết quả thu được
trong nghiên cứu này có một số ý nghĩa quan trong sau:

14

2
Hội nghị KH quốc tế
Không
Không
3
Tạp chí KH quốc gia
2
2
4
Hội nghị KH quốc gia
Không
Không
5
Sách chuyên khảo
Không
Không
3. Kết quả tham gia đào tạo sau đại học
Học viên cao học đăng ký thực hiện đề tài không tiếp tục vì kỹ thuật kỵ khí và kỹ thuật
sinh học phân tử phức tạp (đã xin rút trong báo cáo trung gian năm 2007). 15
III. TÌNH HÌNH TỔ CHỨC THỰC HIỆN ĐỀ TÀI (tính đến thời điểm lập báo cáo)
1. Tổ chức thực hiện: tương đối thuận lợi
2. Sử dụng kinh phí: theo kế hoạch dự trù thực hiện đề tài (năm 2006 và 2007)
STT
Nội dung chi
Kinh phí
được duyệt
(triệu đồng)

IV. ĐÁNH GIÁ, KIẾN NGHỊ
1. Đánh giá về việc thực hiện đề tài
Đề tài được thực hiện theo đúng tiến độ, đảm bảo đầy đủ các nội dung nghiên cứu đa đưa
ra trong bản thuyết minh.
2. Về nội dung nghiên cứu tiếp của đề tài
Theo nhu cầu thực tế về giải quyết ô nhiễm môi trường, chúng tôi kiến nghị xin được tiếp
tục nghiên cứu ứng dụng nguồn vi sinh vật có được trong đề tài này để xây dựng và thử
nghiệm chế phẩm sinh học phục vụ cho xử lý nước thải có hàm lượng nitơ cao
3. Kiến nghị về quản lý, tổ chức thực hiện ở các cấp

Hà nội ngày 12 tháng 01 năm 2009

Xác nhận của cơ quan chủ trì Chủ nhiệm đề tài
(Ký tên và đóng dấu) Đinh Thúy Hằng