BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO
TRƢỜNG ĐẠI HỌC SƢ PHẠM HÀ NỘI 2

LÊ THỊ HUỆ

NGHIÊN CỨU MỘT SỐ CHỦNG VI KHUẨN
LÊN MEN KOMBUCHA TỪ TRÀ THÁI NGUYÊN

CHUYÊN NGÀNH: SINH THÁI HỌC
MÃ SỐ: 60 42 01 20

LUẬN VĂN THẠC SĨ SINH HỌC
Ngƣời hƣớng dẫn khoa học: PGS.TS. ĐINH THỊ KIM NHUNG

HÀ NỘI, 2013


Lời cảm ơn!
===***===
Lời đầu tiên tôi xin bày tỏ lòng biết ơn chân thành và sâu sắc nhất tới PGS. TS.
Đinh Thị Kim Nhung - ngƣời đã hƣớng dẫn tận tình chỉ bảo, ngƣời đã cung cấp cho tôi
nhiều kiến thức quý báu, giúp đỡ tôi trong suốt quá trình tiến hành nghiên cứu.
Xin gửi lời cảm ơn sự giúp đỡ của các thầy, cô giáo trong tổ bộ môn Vi sinh
khoa Sinh Trƣờng ĐHSP Hà Nội 2 đã tạo mọi điều kiện về cơ sở vật chất, giúp đỡ tôi
trong quá trình học tập và nghiên cứu đề tài.
Đồng thời tôi cũng xin chân thành cảm ơn sự giúp đỡ của Ban Giám hiệu
Trƣờng ĐHSP Hà Nội 2, Ban Chủ nhiệm khoa Sinh, các anh chị trong phòng Vi sinh
khoa Sinh, các em sinh viên K35, K36 đang làm đề tài tại phòng Vi sinh khoa Sinh
và Thƣ viện Trƣờng ĐHSP Hà Nội 2 đã tạo điều kiện tốt nhất để tôi hoàn thành đề tài
này.
Cuối cùng, tôi xin bày tỏ lòng biết ơn chân thành tới những ngƣời thân trong gia

: Colony Forming Unit (Đơn vị hình thành khuẩn lạc)

5. FAD

: Flavin adenine dinucleotide

6. GlcUA

: Glucuronic acid

7. MT

: Môi trƣờng

8. NADP

: Nicotiamide adenine

9. PABA

: para – amino benzoic acid

10. PQQ

: Pyrroloquinoline Quinone

11. PQQH2

: Hydroquinone


NỘI DUNG ....................................................................................................... 4
CHƢƠNG 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU ........................................................... 4
1.1. Tổng quan về kombucha ......................................................................... 4
1.1.1. Sơ lƣợc về kombucha ......................................................................... 4
1.1.2. Đặc điểm cấu tạo ................................................................................ 8
1.1.3. Hệ sinh vật trong kombucha ..................................................................................... 9
1.1.3.1. Vi khuẩn acetic ................................................................................................... 9
1.1.3.2. Nấm men ........................................................................................................... 11
1.1.3.3. Vi khuẩn lactic ................................................................................................. 12
1.1.4. Cơ sở khoa học của quá trình lên men .................................................................... 12
1.1.5. Thành phần hóa học và công dụng của kombucha ................................................. 16
1.1.5.1 Thành phần hóa học của kombucha ................................................................... 16
1.1.5.2 Công dụng của kombucha.................................................................................. 17
1.1.5.3 Một số lƣu ý khi sử dụng ................................................................................... 19
1.2. Một số đặc điểm về trà Thái Nguyên ............................................................................ 19

1.2.1. Phƣơng pháp sản xuất trà xanh...................................................... 20
1.2.3. Đặc điểm của trà xanh Thái Nguyên ...................................................................... 20


1.3. Tình hình nghiên cứu về kombucha ở Việt Nam và trên thế giới ..... 20
1.3.1. Trên thế giới...................................................................................... 20
1.3.2. Ở Việt Nam ....................................................................................... 22
CHƢƠNG 2. VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU .................. 25
2.1. Vật liệu và thiết bị nghiên cứu ...................................................................................... 25
2.1.1. Đối tƣợng ................................................................................................................ 25

2.1.2. Hóa chất và thiết bị .......................................................................... 25
2.1.3.1. Hóa chất ...................................................................................... 25
2.1.3.2. Thiết bị ........................................................................................ 25

3.2.3. Phân loại các chủng vi khuẩn đã tuyển chọn để lên men kombucha ................................. 42
3.2.3.1. Hình thái và tế bào học ........................................................................................ 42

3.2.3.2. Sinh trƣởng trên môi trƣờng thạch đĩa ................................... 42
3.2.3.3. Đặc tính sinh hóa ........................................................................ 43
3.2.4. Nghiên cứu động thái sinh trƣởng của chủng vi khuẩn
Acetobacter A2 và A15 .................................................................................. 46
3.3. Khảo sát ảnh hƣởng của một số yếu tố tới quá trình lên men
kombucha ................................................................................................... 48
3.3.1. Khảo sát ảnh hƣởng của môi trƣờng dinh dƣỡng đến quá trình
lên men kombucha ..................................................................................... 48
3.3.1.1. Khảo sát ảnh hƣởng của (NH2)2SO4 ........................................ 48
3.3.1.2. Khảo sát ảnh hƣởng của MgSO4.7H2O............................................................. 49

3.3.1.3. Khảo sát ảnh hƣởng của KH2PO4 ........................................... 50
3.3.2. Khảo sát ảnh hƣởng của điều kiện môi trƣờng tới quá trình lên
men kombucha ............................................................................................ 51
3.3.2.1. Khảo sát ảnh hƣởng của thời gian lên men ............................ 51
3.3.2.2. Khảo sát ảnh hƣởng của hàm lƣợng giống bổ sung ban đầu. 53
3.3.2.3. Khảo sát ảnh hƣởng của độ pH ban đầu ........................................................... 55
3.3.2.4. Khảo sát ảnh hƣởng của nhiệt độ ............................................................................... 56

3.4. Xây dựng quy trình lên men kombucha .............................................. 57
3.4.1. Khảo sát về thiết bị lên men ............................................................... 57
3.4.2. Quy trình sản lên men kombucha quy mô phòng thí nghiệm ............................... 59
3.4.3. Kiểm tra, đánh giá chất lƣợng sản phẩm ................................................................ 64


3.4.3.1. Đánh giá sản phẩm kombucha bằng phƣơng pháp cảm quan ............................ 64
3.4.3.2. Kiểm tra chất lƣợng sản phẩm ........................................................................... 64

3.9. Đồ thị biểu diễn động thái sinh trƣởng của chủng Acetobacter A2 và
A15 ............................................................................................................................ 47
3.10. Biểu đồ biểu diễn ảnh hƣởng của (NH4)2SO4 đến hàm lƣợng acid
tổng số sinh ra của 2 chủng Acetobacter A2 và A15 ................................................. 48
3.11. Biểu đồ biểu diễn ảnh hƣởng của MgSO4. 7H2O đến hàm lƣợng acid tổng
số sinh ra của 2 chủng Acetobacter A2 và A15 ......................................................... 49
3.12. Biểu đồ biểu diễn ảnh hƣởng của KH2PO4 đến hàm lƣợng acid tổng số
sinh ra của 2 chủng Acetobacter A2 và A15 .............................................................. 50
3.13. Ảnh kombucha lên men từ chủng Acetobacter A2 bổ sung hàm lƣợng


KH2PO4 1,0 và 1,5 (g/l) .......................................................................................... 50
3.14. Ảnh kombucha lên men từ chủng Acetobacter A2 với thời gian lên men 5,
7 và 9 ngày ............................................................................................................... 53
3.15. Ảnh kombucha lên men từ chủng Acetobacter A15 với giá trị pH ban đầu
là 4 và 5 .................................................................................................................... 55
3.16. Ảnh kombucha lên men từ chủng Acetobacter A2 ở nhiệt độ 200C và
300C.......................................................................................................................... 57
3.17. Lên men kombucha trong cốc inox thƣờng 150ml, sau quá trình lên men
phần đáy cốc chứa môi trƣờng bị ăn mòn bởi acid acetic ........................................ 58
3.18. Lên men kombucha trong cốc thủy tinh 250ml .............................................. 58
3.19. Lên men kombucha trong hộp nhựa 500ml .................................................... 58
3.27. Quy trình lên men kombucha quy mô phòng thí nghiệm ............................... 61
3.28. Kết quả thử nghiệm đánh giá sản phẩm kombucha ........................................ 65

BẢNG
1.1. Thành phần hóa học trà kombucha ...................................................................... 17
2.1. Các chỉ tiêu đánh giá mức độ cảm quan của kombucha ......................................... 32
2.2. Hệ số quan trọng của từng chỉ tiêu............................................................................ 33
2.3. Bảng quy định đánh giá mức chất lƣợng sản phẩm.................................................. 33


từ các nguồn nguyên liệu khác nhau

nhƣ trà xanh, trà lipton… Trên

rất nhiều sản phẩm kombucha

nhập khẩu đƣợc bán tại các cửa hàng nhƣng chƣa có công trình nghiên cứu
hoàn chỉnh và đầy đủ về sản phẩm này, đặc biệt chƣa có nghiên cứu nào về
các chủng vi khuẩn lên men kombucha. Chính vì vậy tôi quyết
kombucha từ trà Thái Nguyên".

"

Nghiên cứu đánh giá sự đa dạng của một số chủng vi khuẩn lên men
kombucha. Khảo sát ảnh hƣởng của một số yếu tố tới quá trình lên men và
xây dựng quy trình lên men kombucha.
3.1. Phân lập, tuyển chọn các chủng vi khuẩn có khả năng lên men kombucha
3.2. Khảo sát ảnh hƣởng của một số yếu tố tới quá trình lên men kombucha
3.3. Xây dựng quy trình lên men kombucha
Chủng vi khuẩn có khả năng lên men kombucha từ trà Thái Nguyên
5. Phƣơng pháp nghiên cứu
5.1
Phƣơng pháp phân lập vi khuẩn và quan sát hình thái tế bào trên tiêu
bản nhuộm Gram; phƣơng pháp đếm số lƣợng tế bào vi sinh vật; phƣơng pháp
bảo quản chủng giống.
5
Phát hiện hoạt tính catalase; phát hiện khả năng oxy hoá acid acetic;
phát hiện khả năng chuyển hóa glycerol thành dihydroxyacetone; sinh trƣởng
trên môi trƣờng Hoyer;

thú hƣởng thụ tinh thần. Uống trà không chỉ để giải khát mà còn có khả năng
phòng trị bệnh tật, nâng cao sức khoẻ, kéo dài tuổi thọ cho con ngƣời. Trên
thị trƣờng đã có nhiều loại thức uống đƣợc chế biến từ trà nhƣng sản phẩm trà
lên men thì hầu nhƣ còn rất mới mẻ đối với thị trƣờng tiêu dùng Việt Nam.
Trà lên men kombucha là loại đồ uống thông dụng và phổ biến ở các nƣớc
Đông Âu và các nƣớc khác, nó đƣợc biết đến nhƣ một loại thực phẩm có lợi
cho sức khỏe. Ở nƣớc ta, loại trà lên men này đã đƣợc sản xuất nhỏ lẻ trong
một số hộ gia đình. Sản phẩm trà lên men kombucha đƣợc sử dụng ngay sau
khi lên men, hoặc bảo quản lạnh trƣớc khi dùng. Điều này gây hạn chế thời
gian, điều kiện bảo quản và khả năng tiêu thụ sản phẩm.
Hiểu biết hóa sinh đầy đủ của các thành phần chất chuyển hóa
kombucha vẫn còn bí ẩn và chƣa đƣợc làm sáng tỏ[39]. Các nghiên cứu về vi
sinh vật cộng sinh trong kombucha cho thấy: kombucha thực sự là một tập
hợp cộng sinh của nấm men và vi khuẩn acid acetic [27], [33], [44]. Các vi
khuẩn acetic chính đƣợc tìm thấy trong các loại nấm trà: Acetobacter xylinum
[15], Acetobacter aceti, Acetobacter pasteurianus [38], Gluconobacter


5

oxydans [24], [35]. Nhiều hợp chất quan trọng đối với việc bảo vệ sức khỏe
con ngƣời, đƣợc sản xuất trong quá trình lên men của kombucha cộng sinh:
một loạt các axit hữu cơ nhƣ glucuronic, gluconic, lactic, acetic, axit succinic,
butyric, axit malic và usnic; vitamin, đặc biệt là nhóm B và vitamin C, axit
amin tự do và các enzyme hoạt động khác nhau. GlcUA đƣợc coi là một trong
những hợp chất quan trọng đƣợc tìm thấy trong kombucha giải khát do tác
động giải độc của nó và ảnh hƣởng tới sức khỏe [29], [37], nó ngăn ngừa
bệnh tim mạch, các bệnh thoái hóa thần kinh mãn tính thoái hóa và ung thƣ
[22], [44].
Quá trình lên men đƣợc bắt đầu bằng con nấm giống hay chính là sự


Trà kombucha là một loại thức uống bổ dƣỡng xa xƣa của ngƣời dân
Trung Quốc đƣợc là trà nấm. Quá trình lên men sản sinh ra nhiều chất có lợi
cho sức khỏe nhƣ vitamin, khoáng chất, acid glucuronic, acid lactic, acid
acetic và vitamin B ( B1, B2, B3, B5, B6, B15…), các hợp chất hữu cơ khác
nhƣ PABA, acetamidophenol, cafein…

Hình 1.3. Cấu trúc hóa học của một số hợp chất trong trà kombucha
Trà kombucha đƣợc sử dụng rộng rãi ở một số nƣớc trên thế giới từ
cách đây khá lâu. Ở các nƣớc nhƣ Nhật, Nga và Pháp trà kombucha đƣợc xem
nhƣ một bí quyết để có một cuộc sống khỏe mạnh và đƣợc sử dụng trong
những bữa ăn hàng ngày. Riêng ở Việt Nam, việc sử dụng trà kombucha vẫn
còn khá mới mẻ nhƣng số lƣợng ngƣời dùng ngày càng gia tăng. Đối với lợi
ích của trà kombucha đã có nhiều báo cáo dựa trên quan sát cá nhân sử dụng
sản phẩm, tuy nhiên những nghiên cứu về đặc tính của trà kombucha vẫn còn
rất ít và khá mới mẻ với các nhà khoa học. Từ năm 1852, trà kombucha đã
đƣợc chú trọng nghiên cứu, chủ yếu là ở Châu Âu. Khoảng thời gian từ năm
1925 đến 1950, một số nghiên cứu y khoa đã xác nhận những tuyên bố truyền
thông về kombucha và báo cáo một số lợi ích của trà kombucha [22].


8

Trên thế giới đã có một số ít công trình nghiên cứu về trà kombucha,
phần lớn tập trung nghiên cứu liên quan đến việc xác định thành phần hệ vi
sinh vật, thành phần hóa học và phƣơng pháp lên men… nhƣng việc nghiên
cứu tác dụng, dƣợc tính của trà kombucha đối với sức khỏe con ngƣời vẫn
còn rất hạn chế. Bên cạnh đó, ở Việt Nam vẫn chƣa có một công trình nghiên
cứu cụ thể đầy đủ về thành phần và tác dụng của trà kombucha.
1.1.2 Đặc điểm cấu tạo

biệt với lớp màng ban đầu ( “nấm mẹ”).
Hình dạng và kích thƣớc của “con nấm” phụ thuộc vào hình dạng tiết
diện của bình chứa.

Hình 1.5. Kombucha được lên men trong các bình chứa có kích thước và
hình dạng khác nhau
Ngƣời ta có thể dùng trà xanh, trà đen, trà ô long, trà kukicha hoặc trà
lipton để làm môi trƣờng lên men kombucha. Cả trà xanh và trà đen đều có
thể đƣợc sử dụng để lên men, tạo ra mùi vị khác nhau, tuy nhiên, trong môi
trƣờng nƣớc trà xanh, kombucha tạo thành mỏng hơn, nhƣng tốc độ tăng
trƣởng nhanh hơn trong dịch trà đen.
1.1.3. Hệ vi sinh vật trong kombucha
1.1.3.1. Vi khuẩn acetic
Vi khuẩn acetic thuộc họ Acetobacteriaceae (hiếu khí bắt buộc). Chúng
phát triển tốt trên bề mặt môi trƣờng, phân bố rộng rãi, đa dạng, phong phú
trong tự nhiên: trong không khí, đất, gỗ, cây ăn trái, đặc biệt là các loại thực
phẩm, hoa trái, nƣớc trái cây và các sản phẩm lên men tự nhiên chứa ethanol
nhƣ rƣợu, bia, giấm tự nhiên… Bên cạnh những mặt có lợi trong lên men nhƣ
giấm, vi khuẩn acetic đƣợc xem là một trong những nguyên nhân quan trọng
gây hƣ hỏng thực phẩm tƣơi và thực phẩm lên men giàu cồn.
Họ vi khuẩn Acetobacteraceae ( Gillis và de ley, 1980) bao gồm:
Chi Acetobacter ( Beijerinck, 1898)


10

Chi Gluconobacter ( Asai, 1935)
Chi Acidomonas ( Urakami et al., 1989)
Chi Gluconacetobacter ( Yamada et al., 1998)
Chi Asaia ( Yamada et ai., 2000)

phát triển ở các khoảng nhiệt độ, áp suất thẩm thấu và pH khác nhau; phát
triển sinh khối trong các môi trƣờng chứa D- glucose 30%; acetic acid 0,35%;
KNO3 1%; methanol; glutamate và malnitol; sinh acetic acid từ ethanol; tạo
sắc tố hòa tan trong nƣớc; đồng hóa ammonia trong môi trƣờng chứa Dglucose, D-malnitol hay ethanol; tạo dyhidroxyaceton từ glcerol; phát triển
trong môi trƣờng không có nicotinic acid; phát triển sinh khối và tạo acid
trong các môi trƣờng có nguồn carbon duy nhất là: D- glucose, D- mamnose,
D-galactose, D- fructose, L- sorbose, D- xylose, arabinose, L- arabinose, Dmalnitol, D- sorbitol, glycerol, maltose, lactose, melibiose, sucrose, raffinose
và ethanol [31], [49].
1.1.3.2. Nấm men
Tế bào nấm men thƣờng có dạng hình cầu, ovan, elip, hình trụ…,
thƣờng có kích thƣớc rất lớn gấp từ 5 – 10 lần tế bào vi khuẩn. Kích thƣớc
trung bình: chiều dài: 9 – 10  m, chiều rộng: 2 – 7  m. Hình dạng và kích
thƣớc tế bào thay đổi, không đồng đều ở các loài khác nhau, ở các lứa tuổi
khác nhau và điều kiện nuôi cấy khác nhau. Nấm men là sinh vật đơn bào
nhân chuẩn, tế bào nấm men cũng nhƣ nhiều loại tế bào khác đƣợc cấu tạo
chủ yếu từ các phần cơ bản nhƣ sau: thành tế bào, màng sinh chất, chất
nguyên sinh, nhân tế bào và những thành phần khác: không bào, ty thể,
riboxom,…[4]
Nấm men có một số hình thức sinh sản sau: Sinh sản bằng cách nảy
chồi, phân đôi, sinh sản bằng bào tử và sự hình thành bào tử.
Phân loại: nấm men chủ yếu có hai lớp: nấm men thật (Ascomyces) và
nấm men giả (Fungi imperfecti). Lớp nấm men thật phần lớn dùng trong công


12

nghiệp thuộc lớp Ascomyces, đa số thuộc giống Saccharomyces. Lớp nấm
men giả bao gồm giống Crytococus, Mycoderma, Eandida, Geotrichum,
Rhodotorula.
1.1.3.3. Vi khuẩn lactic

khi đƣợc vận chuyển vào trong tế bào chất, đƣờng hexose đƣợc chuyển hóa
theo chu trình đƣờng phân để tạo thành acid pyruvic. Tiếp theo acid pyruvic
sẽ đƣợc chuyển hoá thành acetaldehyde rồi thành ethanol. Dihydroxyacetone
phosphat là một sản phẩm trung gian trong chu trình đƣờng phân, hợp chất
này có thể chuyển hoá thành glyxerol. Trong môi trƣờng pH acid, glycerol chỉ
đƣợc tạo ra với hàm lƣợng nhỏ. Ngƣợc lại, trong môi trƣờng pH kiềm lƣợng
glycerol sinh ra sẽ tăng lên rất nhiều và glycerol sẽ trở thành một trong những
sản phẩm chủ yếu của quá trình lên men.
Phƣơng trình tổng quát của quá trình lên men trong môi trƣờng pH
acid:
C6H12O6 + 2ADP +2Pi → 2C2H5OH + 2CO2 + 2ATP
Sự chuyển hóa đƣờng hexose thành ethanol và khí CO2 diễn ra trong tế
bào chất của nấm men. Đây là quá trình trao đổi năng lƣợng của nấm men
trong điều kiện kỵ khí. Ethanol và CO2 trong tế bào chất sẽ đƣợc nấm men
thải vào môi trƣờng lên men. Ngoài ra tế bào nấm men còn tổng hợp và thải
vào dịch lên men hàng trăm sản phẩm phụ và sản phẩm lên men khác, những
hợp chất này đƣợc tìm thấy với hàm lƣợng rất nhỏ, chúng đƣợc chia thành 4
nhóm: glyxerol cùng rƣợu bậc cao, aldehyde, acid hữu cơ và este. Trong quá
trình lên men ethanol, nhiều acid hữu cơ đƣợc tạo thành (The Moll, 1990).
Một số acid hữu cơ đƣợc sinh tổng hợp từ chu trình Krebs, nếu nhƣ quá trình
lên men không diễn ra trong điều kiện kỵ khí nghiêm ngặt, các acid hữu cơ
chiếm hàm lƣợng cao nhất trong dịch lên men là: acid citric, malic, acetic,
lactic...
* Lên men acetic:
Lên men acid acetic là quá trình oxy hóa rƣợu thành acid acetic dƣới
tác dụng của vi khuẩn.
C2H5OH + O2 → CH3CHO (Acetaldehyde) + H2O