Khoá luận tốt nghiệp

Bùi Phạm Hong Hải

Lời cảm ơn

Với lòng kính trọng và biết ơn sâu sắc, em xin chân thành cảm ơn thầy
Nguyễn Khắc Thanh đã tận tình hớng dẫn và giúp đỡ em hoàn thành khoá
luận này.
Em xin chân thành cảm ơn các thầy cô giáo trong tổ bộ môn vi sinh vật
học cùng toàn thể các thầy cô giáo trong khoa đã tạo điều kiện và giúp đỡ em
hoàn thành khoá luận của mình.
Tôi xin cảm ơn gia đình cùng bạn bè đã luôn động viên và giúp đỡ tôi
trong suốt quá trình thực hiện khoá luận.
Xuân Hoà, tháng 5 năm 2009
Sinh viên
Bùi Phạm Hoàng Hải

Đại học s phạm H Nội 2

1

K31B Sinh


Khoá luận tốt nghiệp

Bùi Phạm Hong Hải

Mục lục
Trang


Khoá luận tốt nghiệp

Bùi Phạm Hong Hải

3.1.1. Nguyên liệu ..19
3.1.2. Hoá chất ...19
3.1.3. Máy móc và thiết bị nghiên cứu 19
3.1.4. Vi sinh vật kiểm định .. 19
3.2. Phơng pháp nghiên cứu .. 20
3.2.1. Phơng pháp lấy mẫu .. 20
3.2.2. Phơng pháp phân lập và đếm số lợng tế bào 20
3.2.3. Phơng pháp bảo quản và sử dụng giống 21
3.2.4. Phơng pháp quan sát hình thái xạ khuẩn 21
3.2.4.1. Phơng pháp xẻ rãnh thạch .21
3.2.4.2. Phơng pháp khối thạch . 21
3.2.5. Quan sát đặc điểm khuẩn lạc ... 21
3.2.6. Phơng pháp nghiên cứu các đặc điểm sinh lý, sinh hoá .21
3.2.6.1. Xác định axitamin đặc trng cho thành tế bào .. 22
3.2.6.2. Xác định hoạt tính enzim amylase, protease và cellulase .. 22
3.2.6.3. Xác định khả năng nitrit và nitrat hoá ... 23
3.3. Các môi trờng sử dụng trong nghiên cứu .22
3.3.1. Môi trờng giữ giống xạ khuẩn ........23
3.3.2. Môi trờng nuôi cấy vi sinh vật kiểm định 23
3.3.3. Môi trờng phân lập xạ khuẩn 24
3.3.4. Môi trờng xác định khả năng nitrit và nitrat hoá ..24
3.3.5. Môi trờng nuôi cấy để kiểm tra xạ khuẩn có khả năng phân giải
cellulose .25
Chơng 4: Kết quả và thảo luận ..26
4.1. Kết quả phân lập xạ khuẩn 26

VSV

: Vi sinh vật

MT

: Môi trờng

Đại học s phạm H Nội 2

4

K31B Sinh


Khoá luận tốt nghiệp

Bùi Phạm Hong Hải

Chơng 1

Phần mở đầu
Cellulose là thành phần cấu tạo chính của thực vật, nó có tính bền và
đàn hồi rất cao. Chính vì vậy cellulose là một hợp chất rất khó phân giải, điều
này đã gây ra rất nhiều hậu quả rất nghiêm trọng. Mỗi năm cả nớc ta có gần
382.500 tấn vỏ cà phê đợc thải ra, so với các chế phẩm nông nghiệp khác,
chất thải này phân huỷ lâu hơn gây ô nhiễm môi trờng. Cellulose cũng gặp
nhiều trong bã mía, nớc thải công nghiệp, gỗ công nghiệp, công nghiệp dệt và
các chất thải của ngành công nghiệp thực phẩm. Hàng năm công nghiệp chế
biến hoa quả nớc ta thải ra hàng trăm ngàn tấn bã thải. Lợng bã thải này

đề tài : Nghiên cứu một số chủng xạ khuẩn có khả năng phân giải cellulose
trong đất trồng trọt khu vực xuân hoà .
Đề tài của tôi nhằm giải quyết các vấn đề sau:
1. Phân lập và tuyển chọn các chủng xạ khuẩn có khả năng phân giải
cellulose trong đất trồng trọt khu vực Xuân Hoà.
2. Nghiên cứu đặc điểm hình thái và nuôi cấy của các chủng xạ khuẩn
nghiên cứu.
3. Kiểm tra hoạt tính enzim cellulose của các chủng xạ khuẩn phân lập
đợc.

Đại học s phạm H Nội 2

6

K31B Sinh


Khoá luận tốt nghiệp

Bùi Phạm Hong Hải

Chơng 2
tổng quan ti liệu

2.1. Sơ lợc về xạ khuẩn:
2.1.1. Vị trí của xạ khuẩn trong hệ thống sinh giới
Xạ khuẩn (Actinomycetes) là một nhóm VSV lớn trong giới Bacteria.
Chúng thuộc nhóm VSV Gram (+). Theo Krassilnikov (1970) xạ khuẩn
(Actinomycetes) đợc tách thành một lớp riêng gồm có xạ khuẩn bậc cao (có
hệ sợi phát triển, có cơ quan sinh sản riêng) và nhóm xạ khuẩn bậc thấp (có hệ

Đại học s phạm H Nội 2

7

K31B Sinh


Khoá luận tốt nghiệp

Bùi Phạm Hong Hải

cam, vàng, nâu, tím, hồng, xám, khuẩn lạc xạ khuẩn thờng chắc, xù xì, có
dạng da, dạng nhung tơ, hay dạng màng dẻo và thờng có cấu trúc ba lớp: lớp
ngoài có cấu trúc các sợi bền chặt, lớp giữa có cấu trúc tổ ong và lớp trong có
cấu trúc tơng đối xốp. Cấu trúc khuẩn lạc xạ khuẩn với hớng sinh trởng
trong môi trờng tạo ra hệ sợi cơ chất (HSCC) và ngoài mặt môi trờng tạo ra
hệ sợi khí sinh (HSKS). Đờng kính hệ sợi xạ khuẩn thay đổi trong khoảng 0,2
- 1,0 m đến 2,0 - 3,0 m. Đa số các xạ khuẩn có hệ sợi phân nhánh mạnh,
không có vách ngăn. Màu sắc hệ sợi đa dạng, có thể gặp các màu trắng, vàng,
da cam, đỏ, nâu, lục, tím, đen, HSCC có thể sinh ra các sắc tố tan trong nớc
hoặc trong các dung môi hữu cơ. HSKS ở tận cùng thờng là các chuỗi bào tử
có dạng xoắn, lợn sóng, thẳng, vòng, Đây là một đặc điểm khá quan trọng
để phân loại xạ khuẩn. Các bào tử xạ khuẩn có thể có hình tròn, hình bầu dục,
hình que, hay hình trụ, cấu trúc bề mặt bào tử có thể là nhẵn (Smooth), có
gai (Spinny), khối u (Warty), nếp nhăn (Rugose) hay dạng tóc (Hair-like),
hình dạng, kích thớc, cấu trúc bề mặt bào tử cũng là một trong những chỉ tiêu
quan trọng để định loại xạ khuẩn.
Khi nuôi cấy xạ khuẩn trong môi trờng dịch thể, xạ khuẩn có thể mọc
thành dạng màng hay dạng vòng trên thành bình nuôi cấy, trên bề mặt môi
trờng hay thành dạng bọt hoặc kết tủa kiểu vi khuẩn. Khi nuôi cấy chìm trên

Nocardiopsis, Micronobispora,
Nhóm 4 (Type IV): Có chứa Meso - Diaminopimelic (Meso - DAP).
Gồm có Nocardia, Oerskovia, Promicromonospora, Pseudonocardia,
Rhodococcus, Mycrobacterium,
2.1.2.3. Đặc điểm sinh lý, sinh hoá của xạ khuẩn
Xạ khuẩn là một nhóm cơ thể dị dỡng, chúng sử dụng đờng, rợu,
axít hữu cơ, lipit, prôtêin và nhiều hợp chất khác để làm nguồn cacbon. Còn
nitrat, nitrit, muối amôn, urê, axit amin, pepton, cao men, cao thịt, để làm
nguồn nitơ. ở các loài khác nhau thì khả năng hấp thụ các hợp chất này là
khác nhau.
Phần lớn xạ khuẩn là VSV hiếu khí, a ẩm, nhiệt độ thích hợp cho sinh
trởng và phát triển là 25 - 300C. Đa số xạ khuẩn phát triển tốt trong môi
trờng có PH là 6,8 - 7, một số ít có khả năng phát triển tốt trong môi trờng
kiềm.
Xạ khuẩn là nhóm vi khuẩn Gram (+), đặc biệt khác với các sinh vật
khác của nhóm nhân sơ là có tỉ lệ G+X cao (>70%), trong khi đó vi khuẩn khá
thấp (25 - 45 %).
Đại học s phạm H Nội 2

9

K31B Sinh


Khoá luận tốt nghiệp

Bùi Phạm Hong Hải

Một trong những đặc điểm đáng lu tâm của xạ khuẩn là chúng không
bền vững về mặt di truyền và thờng xảy ra sự sắp xếp lại trong phân tử ADN.

K31B Sinh


Khoá luận tốt nghiệp

Bùi Phạm Hong Hải

2.1.3. Phân bố của xạ khuẩn
Xạ khuẩn là nhóm vi sinh vật phân bố rộng rãi trong tự nhiên. Xạ khuẩn
có thể phân lập từ đất , nớc, không khí, bùn, rác Đặc biệt trong đất xạ
khuẩn chiếm số lợng rất lớn (Kuster, 1986).
Theo Waksman thì trong đất xạ khuẩn chiếm 9 % - 45 % tổng số các
VSV. Và trong một gam đất có chứa tới 29000 - 24.000.000 mầm xạ khuẩn.
Tuy nhiên tuỳ các vùng đất khác nhau trên thế giới mà có sự biến đổi
lớn về số lợng xạ khuẩn trong đất. Số lợng xạ khuẩn ở miền Nam bán cầu
bao giờ cũng cao hơn miền Bắc bán cầu. Ngoài ra số lợng xạ khuẩn trong đất
còn phụ thuộc vào mức độ canh tác, độ phì nhiêu của đất, mức độ che phủ của
thực vật, Đất giàu dinh dỡng, hữu cơ , khoáng thì có nhiều xạ khuẩn hơn
so với đất nghèo dinh dỡng. Trong một gam đất canh tác có thể phân lập đợc
5.000.000 CFU/g xạ khuẩn. Đất vùng sa mạc khô nóng, nghèo dinh dỡng có
số lợng xạ khuẩn ít hơn, dao động trong khoảng 10.000 - 100.000 CFU/g.
Xạ khuẩn là nhóm VSV a trung tính hay kiềm yếu, do đó sự phân bố
của xạ khuẩn trong đất còn phụ thuộc vào độ PH của đất. ở các đất có độ PH
trung tính hoặc hơi kiềm thì có mật độ xạ khuẩn cao hơn so với các vùng đất
có độ PH quá kiềm hoặc quá axit (chua).
Đồng thời số lợng xạ khuẩn còn phụ thuộc vào các thời điểm trong
năm. Do đó khi lấy mẫu đất nghiên cứu cần phải chú ý tới các điều kiện nh
thành phần lớp đất, sinh cảnh, thời điểm lấy mẫu, độ ẩm, nhiệt độ,
2.1.4. Vai trò của xạ khuẩn
Xạ khuẩn là một trong nhiều loại VSV có ý nghĩa quan trọng trong tự

phân biệt các loài khác nhau và sơ bộ phân loại 17 chủng thuộc chi
Actinomyces. Ông coi các đặc điểm sinh lý là mấu chốt trong nguyên tắc phân
loại.
Waksman và Curtis (1979) đã đề cập đến các dạng trung gian trong mô
tả phân loại của mình. Các ông coi đặc điểm hình thái của bào tử là đặc tính
quan trọng nhất của các cơ thể.
Năm 1926, Millard và Burr đã tìm ra 17 loài mới, Jensen (1930-1931)
tìm ra đợc 2 loài mới. Đến năm 1934, Dutche tìm ra 13 loài mới.
Baldacci và cộng sự nghiên cứu xạ khuẩn từ năm 1936- 1953 công bố
một khoá phân loại chi Streptomyces dựa trên cơ sở HSKS, HSCC và một số
đặc điểm trung gian khác.
Waksman và Henrici (1953) đã đa ra một hệ thống phân loại, đến năm
1961 đợc sửa đổi lại. Trong hệ thống phân loại này, xạ khuẩn đựơc xếp thành

Đại học s phạm H Nội 2

12

K31B Sinh


Khoá luận tốt nghiệp

Bùi Phạm Hong Hải

nhóm gồm 3 họ, chia nhỏ thành 10 chi và mô tả chi tiết hơn 250 loài thuộc chi
Streptomyces.
Krassinilcov từ năm 1941 - 1949 đã phát hiện trên 38 loài mới. Năm
1970, ông công bố hệ thống phân loại nấm tia mới dựa vào hệ thống công bố
năm 1949, trong đó xạ khuẩn đợc phân thành 6 họ gồm 26 chi.


Khoá luận tốt nghiệp

Bùi Phạm Hong Hải

Nhóm 4: Gồm các xạ khuẩn có dạng tơng tự Corynebacterium và dạng
hình cầu. Tế bào có hình chữ V, T hoặc dạng cầu, thờng không có hệ sợi.
Theo tài liệu của ISP đợc nêu lên bởi Shirling và Gottlieb (1968, 1969
và 1972) và trong cuốn Bergeys Manual đợc xuất bản lần thứ 8, ngời ta
chia xạ khuẩn thành 6 kiểu (Section) căn cứ vào hình dạng cuống sinh bào tử:
Section S: Type Spira = chuỗi bào tử xoắn.
Section SRA: Type Spira Retinaculum Apertum = Chuỗi bào tử xoắn có
khoá, có móc.
Section SRF: Type Spira Rectus Flexbilis = Chuỗi bào tử xoắn, cong đến
thẳng.
Section RA: Type Retinaculum Apertum = Chuỗi bào tử có móc, có khoá.
Section RARF: Type Retinaculum Apertum Rectus Flexbilis = Chuỗi bào
tử có khoá, thẳng, lợn sóng.
Section RF : Type Rectus Flexbilis = Chuỗi bào tử thẳng đến lợn sóng.
Trớc đây, các đặc điểm hình thái và tính chất nuôi cấy đợc coi là dữ
liệu cơ bản dùng trong phân loại xạ khuẩn nhng do chính cùng một loài có
thể biểu hiện khác nhau về mặt hình thái do biến dị tự nhiên hay những loài
khác nhau có thể giống nhau về mặt hình thái. Vì vậy ngày nay trong phân loại
xạ khuẩn phải dùng thêm các chỉ tiêu bổ sung khác nh : Đặc điểm sinh lí,
sinh hoá, miễn dịch học, sinh học phân tử.
2.1.5.2.2. Đặc điểm hoá phân loại
Trong 20 năm trở lại đây việc sử dụng các thông tin về thành phần hoá
học của tế bào đã đợc ứng dụng rộng rãi để phân loại Procaryota hoá phân
loại.
Hoá phân loại chủ yếu dựa vào các đặc điểm sau:

tố sinh trởng, khả năng sinh các enzim dezoxyribonuclease, nitrat reductase,
phosphatase, catalase, amylase, protase, cellulase,; nhu cầu về ôxi, PH, nhiệt
độ tối u, khả năng chịu mặn, khả năng sinh chất kháng sinh,
Tuy nhiên, theo Hopwood và cộng sự (1975) thì hầu hết các đặc điểm
sinh lý, sinh hoá rất dễ biến dị do mức độ ổn định di truyền không cao. Vì vậy,
ngày nay để phát hiện những loài mới trên cơ sở khác nhau về đặc điểm sinh
lý, sinh hoá, ngời ta cũng sử dụng các phơng pháp nh: phơng pháp phân
loại số dựa trên sự giống nhau giữa các VSV theo một số lớn các đặc điểm,
chủ yếu là các đặc điểm hình thái, sinh lí hoá sinh; phơng pháp nghiên cứu
chủng loại phát sinh và phơng pháp sinh học phân tử nh lai axit nucleic
ADN và ARN, protein và đặc biệt là so sánh trình tự ARN 16S;
Phân loại số:

Đại học s phạm H Nội 2

15

K31B Sinh


Khoá luận tốt nghiệp

Bùi Phạm Hong Hải

Phơng pháp này dựa trên sự đánh giá về mức độ giống nhau giữa VSV
trong một số lớn các đặc điểm chủ yếu là đặc điểm hình thái, sinh lý, sinh
hoá để so sánh các chủng với nhau từng đôi một theo công thức sau:
SAB= S*100/(nS +nd)
Trong đó:
SAB: Mức độ giống nhau giữa hai cá thể.

Bùi Phạm Hong Hải

(microfibrin). Các vi sợi có cấu trúc không đồng nhất tạo nên cấu trúc mixen
của Cellulose. Cellulose dạng mixen gồm hai vùng:
Vùng kết tinh (Crystolline regions) : Có các sợi chặt chẽ, đậm đặc ngăn
cản sự hấp thụ nớc và ít chịu tác động phân giải. Vùng này chiếm 3/4 cấu
trúc Cellulose.
Vùng vô định hình (Amorphous regions) : Có cấu trúc kém chặt chẽ, dễ bị
trơng lên và dễ bị phân giải.
Trong tự nhiên Cellulose khá bền vững, không tan và bị trơng lên khi
hấp thụ nớc. Cellulose bị thuỷ phân khi đun nóng với axit hay kiềm ở
nồng độ khá cao, hoặc bị phân giải bởi các Cellulase sinh ra từ nhiều loại
sinh vật.

Hình 2: Cấu trúc không gian
lập thể của cellulose

Hình 1:Mô hình cấu trúc không
gian lập thể của cellulose

Đại học s phạm H Nội 2

17

K31B Sinh


Khoá luận tốt nghiệp

Bùi Phạm Hong Hải

18

K31B Sinh


Khoá luận tốt nghiệp

Bùi Phạm Hong Hải

Chơng 3
vật liệu và phơng pháp
3.1. Vật liệu
31.1. Nguyên liệu:
Các mẫu đất lấy từ đất trồng trọt thuộc khu vực Xuân Hoà - Thị xã Phúc
Yên - Tỉnh Vĩnh Phúc.
3.1.2. Hoá chất
Các hoá chất: KH2P04, MgSO4. 7H20, NH4Cl, KN03, NaN03,
(NH4)2SO4, NH4NO3, NaCl, NaOH, HCl, FeSO4. 7H20, CaC03,
Tinh bột tan, cao nấm men, pepton, thạch, Cazein, CMC (Cacboxyl
Methyl Cellulose), cao thịt,
3.1.3. Máy móc và thiết bị nghiên cứu
- Tủ ấm vi sinh (Heaeus - Đức).
- Tủ sấy (Heaeus - Đức).
- Nồi hấp (TOMY Nhật).
- Máy li tâm (Shorwall super T21 Mỹ).
- Máy đo PH (MP200R Thụy Sĩ).
- Cân điện tử (Precisa XT 320M Thụy Sĩ).
- Giấy sắc kí loại chạy chậm của hãng Whatsman.
- Kính hiển vi quang học
3.1.4. Vi sinh vật kiểm định

lần.
Dùng pipet vô trùng hút 0,2 ml dịch huyền phù ở độ pha loãng 103 lần
nhỏ lên bề mặt môi trờng Gause I, Czapek tinh bột tan, đã chuẩn bị trong
các hộp petri. Trang đều dịch đất lên mặt môi trờng, nuôi trong tủ ấm 280C300C. Sau 7 - 14 ngày mang các hộp petri ra quan sát, đếm số lợng khuẩn lạc
xạ khuẩn.
Từ đó tính số lợng xạ khuẩn trong 1gam đất theo công thức:

M = ( X + 2X ) ì b / V (CFU )
Trong đó :
M : Tổng số xạ khuẩn trong 1gam đất.

X : Số khuẩn lạc mọc lên từ độ pha loãng này

2X : Độ lệch bình phơng trung bình.
b: Độ pha loãng nuôi cấy.
V: Thể tích dịch huyền phù dùng để phân lập.
CFU: Đơn vị hình thành khuẩn lạc (Colony Forming Unit).

Đại học s phạm H Nội 2

20

K31B Sinh


Khoá luận tốt nghiệp

Bùi Phạm Hong Hải

3.2.3.Phơng pháp bảo quản và sử dụng giống

21

K31B Sinh


Khoá luận tốt nghiệp

Bùi Phạm Hong Hải

3.2.6.1. Xác định axit amin đặc trng cho thành tế bào
Nuôi cấy xạ khuẩn trong môi trờng dịch thể Gause I và Gause II, trong
7 ngày ở nhiệt độ 280 -300C trên máy lắc với tốc độ 200 - 220 vòng/phút. Li
tâm thu sinh khối và sấy khô trong 2 giờ ở nhiệt độ 400C. Rửa sạch sinh khối
bằng nớc cất và cồn rồi làm khô ở nhiệt độ 280 C.
Cân 10 mg sinh khối sấy khô, bổ sung 1ml dung dịch HCl 1N nút kín và
thuỷ phân ở nhiệt độ 600C trong vòng 4 giờ.
Dịch đợc đun cách thuỷ để loại HCl và bổ sung thêm nớc cất đến khi
PH đạt tới 5,6 6,0.
Chấm 20 m dịch lên giấy sắc kí chạy trong hệ dung môi mêtanol: H20:
HCl 6N: Pirimidin = 40:13:2:5 trong 17giờ. Để giấy khô tự nhiên và hiện hình
bằng dung dịch ninhydrin 0,5% trong aceton, sấy khô ở 800C.
Dạng LL - DAP có vệt màu vàng chanh còn dạng m - DAP có vệt màu
xanh lá cây và chạy chậm hơn LL - DAP.
3.2.6.2. Xác định hoạt tính enzim amylase, protease và cellulase
Cấy chấm điểm xạ khuẩn trên môi trờng thạch đĩa có các cơ chất tơng
ứng. Sau 7 ngày thử hoạt tính enzim bằng thuốc thử đặc trng và đo vòng phân
giải (D-d,mm) với D: vòng phân giải cơ chất, d: đờng kính xạ khuẩn.
Xác đinh hoạt tính enzim protease bằng môi trờng thạch chứa 1% tinh
bột tan hoặc tinh bột sắn. Thuốc thử lugol.
Xác định hoạt tính enzim protease bằng môi trờng chứa 5% bột sữa

Môi trờng (MT) Gause I:
Tinh bột tan: 20g

FeSO4: 0,01g

K2HPO4: 0,5g

Thạch: 20g

MgSO4: 0,5g

Nớc cất: 1lit

KNO3: 0,5g

PH: 6.5

MT Gause II:
Cao thịt: 3g

Thạch: 20g

Pepton: 5g

Nớc cất: 1lit

Glucose: 10g

PH : 6,5


Khoá luận tốt nghiệp

Bùi Phạm Hong Hải

KH2PO4: 0,5g

Thạch: 20g

KCl: 0,5g

Nớc cất: 1lít

MT nuôi cấy nấm men: MT Hanxen
Glucose: 5g

Thạch: 12-20g

Pepton: 5g

Nớc cất: 1lít

KH2PO4: 3g

PH: 6,5

MgSO4.7H2O: 2g
3.3.3. Môi trờng phân lập xạ khuẩn
MT Czapeck-tinh bột:
Tinh bột tan: 20g



MgSO4.7H2O: 0.5g

PH: 7.0

NaNO3: 3g
K2HPO4: 1g
Nguồn cacbon: Glucose, saccharose, innositol, malnitol, malnose, maltose,
lactose, cellulose. Thanh trùng bằng đèn cực tím trong 30 phút hoặc lọc qua
phễu lọc vi khuẩn rồi bổ sung vào môi trờng lúc còn nóng.
3.3.4. Môi trờng xác định khả năng nitrit và nitrat hoá
MT nitrit hoá:
(NH4)2SO4: 2g

FeSO4: 0.1g

K2HPO4: 1g

CaCO3: 1g

Đại học s phạm H Nội 2

24

K31B Sinh


Khoá luận tốt nghiệp

Bùi Phạm Hong Hải


Nớc cất: 1000ml

Cao thịt bò: 3g

PH: 6.8-7.0

NaCl: 5g
Thạch: 20g
Môi trờng 2:
Glucoza: 1g

Nớc chiết đất: 100ml

K2HPO4: 0.5g

Nớc cất: 900ml

Thạch: 20g

PH: 6.5-7.0

(Chuẩn bị nớc chiết đất:
1Kg đất + 1 lít nớc sạch
Hấp khử trùng 30 phút trong nồi hấp
Bổ sung thêm 1g CaCO3 rồi lọc lấy nớc trong)

Đại học s phạm H Nội 2

25