ĐẠI HỌC ĐÀ NẴNG
TRƯỜNG ĐẠI HỌC SƯ PHẠM
KHOA SINH – MÔI TRƯỜNG
LÊ THỊ CẨM
NGHIÊN CỨU TUYỂN CHỌN MỘT SỐ
CHỦNG VI KHUẨN CÓ KHẢ NĂNG PHÂN GIẢI
PROTEIN VÀ THỬ NGHIỆM XỬ LÝ NƯỚC THẢI
NUÔI TRỒNG THỦY SẢN TẠI
QUẢNG NAM - ĐÀ NẴNG
KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP
Đà Nẵng - 2015
ĐẠI HỌC ĐÀ NẴNG
TRƯỜNG ĐẠI HỌC SƯ PHẠM
KHOA SINH – MÔI TRƯỜNG
LÊ THỊ CẨM
NGHIÊN CỨU TUYỂN CHỌN MỘT SỐ
CHỦNG VI KHUẨN CÓ KHẢ NĂNG PHÂN GIẢI
PROTEIN VÀ THỬ NGHIỆM XỬ LÝ NƯỚC THẢI
NUÔI TRỒNG THỦY SẢN TẠI
QUẢNG NAM - ĐÀ NẴNG
Ngành: Quản lý Tài nguyên và Môi trường
Giảng viên hướng dẫn: TS. VÕ CHÂU TUẤN
Đà Nẵng - 2015
LỜI CAM ĐOAN
Tôi cam đoan đây là công trình nghiên cứu của tôi.
Các số liệu, kết quả trong khóa luận là trung thực và chưa từng công
bố trong bất kỳ công trình khác.
Tác giả
Lê Thị Cẩm
LỜI CẢM ƠN
Để hoàn thành đề tài khóa luận của mình (từ 4/2014 đến 03/2015), tôi

1.3.2. Các nghiên cứu tại Việt Nam 8
1.4. TỔNG QUAN VỀ THỰC TRẠNG Ô NHIỄM VÀ XỬ LÝ NƯỚC
NUÔI TRỒNG THỦY SẢN Ở VIỆT NAM 10
1.5. NGHIÊN CỨU ỨNG DỤNG VI SINH VẬT XỬ LÝ NƯỚC THẢI. 13
1.5.1. Ứng dụng vi sinh vật xử lý nước thải 13
1.5.2. Ứng dụng vi sinh vật xử lý nước thải nuôi trồng thủy sản 17
Chương 2 19
ĐỐI TƯỢNG, NỘI DUNG 19
VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 19
2.1. ĐỐI TƯỢNG NGHIÊN CỨU 19
2.2. NỘI DUNG NGHIÊN CỨU 19
2.3. ĐỊA ĐIỂM, PHẠM VI VÀ THỜI GIAN NGHIÊN CỨU 19
2.3.1. Địa điểm nghiên cứu 19
2.3.2. Phạm vi nghiên cứu 20
2.4. PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 20
2.4.1. Phương pháp thu mẫu ngoài thực địa 20
2.4.2. Phương pháp phân lập 20
2.4.3. Phương pháp giữ giống vi sinh vật 21
2.4.4. Phương pháp nghiên cứu khả năng sinh protease của vi khuẩn 21
2.4.5. Xác định thời gian sinh enzyme protease mạnh nhất của vi khuẩn 22
2.4.6. Phương pháp nhuộm Gram 22
2.4.7. Khảo sát các yếu tố ảnh hưởng đến sự sinh trưởng của vi khuẩn 23
2.4.8. Phương pháp xử lý nước thải thủy sản bằng vi khuẩn tuyển chọn
trong hệ thống bể sinh học hiếu khí 23
2.4.9. Xác định một số chỉ tiêu lý, hóa của nước 23
Chương 3 25
KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN 25
3.1. PHÂN LẬP CÁC CHỦNG VI KHUẨN CÓ KHẢ NĂNG PHÂN
GIẢI PROTEIN TỪ NƯỚC THẢI THỦY SẢN 25
3.2. TUYỂN CHỌN CÁC VI KHUẨN CÓ KHẢ NĂNG PHÂN GIẢI

Các chủng vi khuẩn có khả năng phân giải protein phân
lập từ nước thải nuôi trồng thủy sản ở Quảng Nam và
Đà Nẵng
25
3.2
Khả năng phân giải protein của các chủng vi khuẩn phân
lập
27
3.3
Đường kính vòng phân giải protein của 3 chủng vi
khuẩn
29
DANH MỤC CÁC HÌNH
Số hiệu
Tên Hình
Trang
3.1
Các chủng vi khuẩn có hoạt tính phân giải protein phân
lập được từ nước thải nuôi trồng thủy hải sản
26
3.2
Hình thái khuẩn lạc của một số chủng vi khuẩn phân lập
27
3.3
Đường phân giải protein của 3 chủng có hoạt tính mạnh
nhất
28
3.4
Vòng phân giải của 3 chủng vi khuẩn sau 48h nuôi cấy
29

37
1
MỞ ĐẦU
1. Tính cấp thiết của đề tài
Việt Nam được xem là nước có tài nguyên biển khá đa dạng và
phong phú. Ngành đánh bắt, nuôi trồng và chế biến thuỷ hải sản chiếm tỷ
trọng khá lớn trong kim ngạch xuất khẩu của Việt Nam [1]. Trong những
năm gần đây, nhận thấy tầm quan trọng của nghề nuôi trồng thủy hải sản,
Chính phủ và Bộ Thuỷ sản đã dành sự ủng hộ mạnh mẽ cho phát triển bền
vững của nuôi trồng thủy hải sản. Chính vì thế ngành khai thác và nuôi
trồng thủy hải sản ở nước ta đã có những buớc tiến vượt bậc, đóng góp
quan trọng vào tổng kim ngạch xuất khẩu, giải quyết công ăn việc làm
cho hàng triệu lao động của nuớc ta [19].
Những năm gần đây, các tỉnh, thành phố duyên hải miền Trung đã tập
trung phát triển nuôi trồng thủy hải sản. Năm 2013, diện tích nuôi trồng toàn
vùng đạt xấp xỉ 34 nghìn ha. Sản lượng đạt hơn 180 nghìn tấn [1]. Hình thức
sản xuất trước đây chủ yếu theo hộ gia đình với quy mô nhỏ, song trong
những năm gần đây, ngành nuôi trồng thủy hải sản của vùng duyên hải miền
Trung đã và đang thu hút được nhiều nhiều nhà đầu tư sản xuất nuôi trồng,
kinh doanh thức ăn nuôi thủy sản và các dịch vụ thú y Tuy nhiên, việc phát
triển mạnh diện tích nuôi trồng đã gây ảnh hưởng xấu - làm suy thoái môi
trường trên diện rộng, trong đó có tỉnh Quảng Nam và Đà Nẵng. Tình trạng ô
nhiễm môi trường đang xảy ra nghiêm trọng trong nuôi trồng thủy sản do
phần lớn các chất hữu cơ dư thừa từ thức ăn, phân và các rác thải khác đọng
lại dưới đáy ao nuôi. Ngoài ra, còn các hóa chất, kháng sinh được sử dụng
trong quá trình nuôi trồng cũng dư đọng lại mà không được xử lý. Việc hình
thành lớp bùn đáy do tích tụ lâu ngày của các chất hữu cơ, cặn bã là nơi sinh
sống của các vi sinh vật gây thối, các vi sinh vật sinh các khí độc như NH
3
,

các chủng vi sinh vật phân giải protein; đồng thời cung cấp cơ sở khoa học về
khả năng xử lý nước thải thủy sản ở quy mô phòng thí nghiệm của các chủng
vi khuẩn.
3
3.2. Ý nghĩa thực tiễn
Kết quả nghiên cứu của đề tài là cơ sở tốt để thiết lập quy trình xử lý
nước thải nuôi trồng thủy sản bằng vi sinh vật; góp phần phát triển sản xuất
bền vững, giảm thiểu ô nhiễm nước, bảo vệ môi trường.
4
Chương 1
TỔNG QUAN TÀI LIỆU
1.1. TỔNG QUAN VỀ ENZYME PROTEASE
Protease là enzyme xúc tác thủy phân các mối liên kết peptide (CO-NH)
trong phân tử protein và các cơ chất tương tự. Nhiều protease có khả năng
liên kết este và vận chuyển acid amin. Nó được ứng dụng một cách rộng rãi
trong nhiều lĩnh vực khác nhau như công nghiệp chế biến thực phẩm, y học,
nông nghiệp, công nghiệp thuộc da, công nghiệp sản xuất xà phòng và
chiếm khoảng 60% thị truờng enzyme [10].
Chế phẩm enzyme protease có thể thu nhận từ nhiều nguồn khác nhau
như thực vật, động vật và vi sinh vật. Tuy nhiên, hiện nay trên thế giới, đa số
các chế phẩm enzyme này được thu nhận từ vi sinh vật do có nhiều ưu điểm
vuợt trội như chu kỳ phát triển ngắn, môi truờng nuôi cấy rẻ, dễ điều khiển….
Vì vậy, hai phần ba protease ứng dụng trong công nghiệp được sản xuất ra từ
vi sinh vật, đặc biệt là vi khuẩn. Quá trình thu nhận các chế phẩm protease
phụ thuộc rất nhiều yếu tố như tính chất nguyên liệu, tác nhân vi sinh vật,
điều kiện thu nhận Vì vậy, tùy từng truờng hợp cụ thể, cần nghiên cứu lựa
chọn điều kiện thích hợp để thu nhận các chế phẩm protease phù hợp với mục
đích sử dụng. [2]
Theo phân loại quốc tế, các enzyme thuộc nhóm này chia thành 4 phân
nhóm phụ :

Bacillus subtilis, B.mesentericus, B.thermorpoteoliticus và một số Clotridium.
Trong đó, B.subtilis có khả năng tổng hợp protease mạnh nhất. Các vi khuẩn
thường tổng hợp protease ở vùng pH trung tính và kiềm yếu là thích hợp nhất.
6
Các protease trung tính của vi khuẩn hoạt động trong khoảng pH hẹp (pH 5-8)
và có khả năng chịu nhiệt thấp. Các protease trung tính tạo ra dịch thủy phân
protein thực phẩm ít đắng hơn so với protease động vật và tăng giá trị dinh
dưỡng. Các protease trung tính có khả năng ái lực cao với các amino acid ưa
béo và thơm. Chúng được sinh ra nhiều bởi Bacillus subtilis, B.mesentericus,
B.thermorpoteoliticus và một số giống thuộc chi Clotridium [11].
1.2.2. Nấm
Nhiều loại nấm mốc có khả năng tổng hợp một lượng lớn protease được
ứng dụng trong công nghiệp thực phẩm như các chủng: Aspergillus,
A.terricola, A.saitoi… Các nấm mốc này có khả năng sinh cả ba loại protease:
acid, kiềm và trung tính. Nấm mốc đen tổng hợp chủ yếu là các protease acid,
có khả năng thủy phân protein ở pH 2.5-3. Một số nấm mốc như
A.candidatus, P.camerberti, P.roqueforti… cũng có khả năng tổng hợp
protease có khả năng đông tụ sữa sử dụng trong sản xuất phomat [22].
1.2.3. Xạ khuẩn
Về phương diện tổng hợp protease, xạ khuẩn được nghiên cứu ít hơn vi
khuẩn và nấm mốc. Tuy nhiên, người ta cũng tìm ra một số chủng có khả
năng tổng hợp protease cao như: Streptomyces grieus, S.fradiae,
S.terimosus,…[11].
1.3. TỔNG QUAN VỀ MỘT SỐ NGHIÊN CỨU VI KHUẨN PHÂN
GIẢI PROTEIN
1.3.1. Các nghiên cứu trên thế giới
Trong các protease, các enzyme của hệ tiêu hóa được nghiên cứu sớm
hơn cả. Năm 1857, Corvisart tách được tripxin từ dịch tụy, đó là protease đầu
tiên nhận được ở dạng chế phẩm. Năm 1861 Brucke cũng đã tách được
pepxin từ dịch dạ dày chó ở dạng tương đối tinh khiết. Ngoài các enzyme của

tổng doanh thu của enzyme toàn thế giới (Godfrey west, 1996). Hiện nay,
số lượng các enzyme được sản xuất hàng năm trên thế giới, ở các nước
phát triển nhất là châu Âu, Mỹ và Nhật Bản vào khoảng 300.000 tấn với
doanh thu từ sản xuất enzyme ước tính vào khoảng 500 triệu USD [10].
Trong đó khoảng 600 tấn protease tinh khiết được sản xuất từ vi sinh vật
bao gồm khoảng 500 tấn từ vi khuẩn và 100 tấn từ nấm mốc. Những nước
có công nghệ sản xuất và ứng dụng protease tiên tiến trên thế giới là: Đan
Mạch, Nhật Bản, Mỹ, Anh, Pháp, Hà Lan, Trung Quốc, Đức, Áo. Các nước
này đã đầu tư thích đáng cho công tác nghiên cứu, sản xuất và ứng dụng
protease từ vi sinh vật. Chính vì thế nhịp độ sản xuất protease ở quy mô
công nghiệp tại các nước phát triển hàng năm tăng vào khoảng 5% - 10%.
Ngày nay người ta có thể sản xuất các enzyme cố định trên các chất mang
không tan cho phép có thể tái sử dụng enzyme nhiều lần. Vì vậy mà việc
ứng dụng protease ngày càng gia tăng [18].
1.3.2. Các nghiên cứu tại Việt Nam
Từ nước thải một số nhà máy thủy sản, Trương Thị Mỹ Khanh và Vũ
Thị Hương Lan (2012) đã phân lập được 6 chủng vi khuẩn có khả năng phân
giải protein. Bước đầu ứng dụng vào việc xử lý nước thải thủy sản đã mang
lại hiệu quả cao, nước thải sau khi xử lý đều đạt tiêu chuẩn xả thải loại B theo
QCVN 24: 2009/BTNMT [20]. Phạm Bích Hiên và cộng sự (2012) đã phân
lập được 17 chủng vi sinh vật có khả năng phân giải xenluloza, 12 chủng
phân giải tinh bột và 6 chủng phân giải protein từ các mẫu phân ủ, thức ăn và
chất thải chăn nuôi, phân ủ từ rác thải, phế phụ phẩm nông nghiệp, bã nấm
Sàng lọc được 15 chủng sinh trưởng mạnh, hoạt tính sinh học ổn định và đa
hoạt tính, trong đó chủng vi khuẩn B15 có hoạt tính phân giải protein mạnh
nhất, từ đó chủng vi sinh vật này được sử dụng để tạo chế phẩm sinh học xử
lý chất thải rắn chăn nuôi [14].
9
Võ Hồng Thi và cộng sự (2012) đã tuyển chọn 10 chủng Bacillus có khả
năng phân giải protein tốt. Kết quả khảo sát cho thấy, sau thời gian 72 giờ

dịch acid protein (da cá tra ngâm acid acetic trong 24 giờ) ứng với thời gian
thuỷ phân là 50 phút với thể tích dung dịch enzyme là 1ml protein, pH dung
dịch là 3,2 và nhiệt độ thuỷ phân là 45°C. Kết quả đã chỉ ra rằng, enzyme
protease có nguồn gốc từ Aspergillus oryzae được nuôi cấy trên môi trường
bán rắn có khả năng sử dụng tốt trong việc thủy phân dung dịch protein [6].
10
Nhìn chung, các công trình nghiên cứu trên đã mang lại nền tảng cơ bản
cho việc phân lập và tuyển chọn các chủng vi sinh vật có hoạt tính protease,
tuy nhiên các nghiên cứu này tập trung nhiều vào việc thu nhận enzyme
protease để ứng dụng trong sản xuất thực phẩm hay các chế phẩm phục vụ
nông nghiệp, ngư nghiệp…Những nghiên cứu ứng dụng vi sinh vật phân giải
protein vào xử lý nước thải nuôi trồng thủy hải sản còn khá hạn chế, mặc dù
tiềm năng của vi sinh vật này là rất lớn, chưa được khai thác ở nước ta.
1.4. TỔNG QUAN VỀ THỰC TRẠNG Ô NHIỄM VÀ XỬ LÝ NƯỚC
NUÔI TRỒNG THỦY SẢN Ở VIỆT NAM
Trong khi tỷ trọng đóng góp của khối nông, lâm nghiệp và thủy sản vào
tổng GDP cả nước liên tục giảm từ 24,5% năm 2000 xuống khoảng 21% năm
2009, tỷ trọng của riêng lĩnh vực nuôi trồng thủy sản vẫn tăng dần, từ 2,7%
năm 2000 lên gần 5% năm 2009. Sự tăng trưởng của nuôi trồng thủy sản chủ
yếu là nhờ vào những tiến bộ về kỹ thuật nuôi, sự công nghiệp hóa quá trình
nuôi để cho năng suất nuôi cao hơn. Tuy nhiên, đồng hành với sự tăng trưởng
lại là những cảnh báo ngày càng gia tăng về tác động xấu đến môi trường do
sự phát triển quá nóng, thiếu quy hoạch, thiếu bền vững của nuôi trồng thủy
sản. Ví dụ, loại hình nuôi tôm trên cát cho lợi nhuận rất cao, nhưng đang gây
ra hai vấn đề môi trường đáng lo ngại cho vùng ven biển miền Trung là khai
thác nước ngầm quá mức (do nhu cầu nuớc ngọt dùng để pha với nước biển
làm nước nuôi rất lớn, ước khoảng 16.000 – 27.000 m
3
/ha/vụ nuôi) và nước
thải gây ô nhiễm cho môi trường xung quanh. Hậu quả lâu dài sẽ làm cạn kiệt

(CH
2
)
n
COOH , photpholipids, Sterol - vitamin D3, các hoocmon,
carbohydrate, chất khoáng và vitamin, vỏ tôm lột xác, Lớp bùn này luôn ở
trong tình trạng ngập nước, yếm khí, các vi sinh vật yếm khí phát triển mạnh,
phân huỷ các hợp chất trên tạo thành các sản phẩm là khí H
2
S, NH
3
, CH
4
,
rất có hại cho thủy sinh vật, ví dụ nồng độ 1,3 ppm của H
2
S có thể gây sốc, tê
12
liệt và thậm chí gây chết tôm. Khí NH
3
cũng được sinh ra từ quá trình phân
huỷ yếm khí thức ăn tồn dư gây độc trực tiếp cho tôm, làm ảnh hưởng đến độ
pH của nước và kìm hãm sự phát triển của thực vật phù du (Hassanai
Kongkeo, 1990). Tóm lại, các chất ô nhiễm chủ yếu trong nuớc thải nuôi
trồng thuỷ sản bao gồm:
- Các bon hữu cơ (gồm thức ăn, phân bón, chế phẩm sinh học )
- Nitơ được phân huỷ từ các protein
- Photpho phân huỷ từ các protein
Có rất nhiều phương pháp sinh học đã và đang được ứng dụng rộng rãi
trong xử lý ô nhiễm môi trường, đặc biệt là các chất thải hữu cơ. Tiêu biểu là

ngày xử lý. Hàm lượng TIP trong nền đáy của nhóm ao có xử lý là thấp hơn
(P<0.05) so với nhóm ao không xử lý vào ngày 20, 40 và 80. Việc cung cấp
các vi sinh vật hữu ích đã làm giảm đi rõ rệt lượng TN và TOC (P<0.05)
trong nhóm ao có xử lý sau ngày thứ 20. Số liệu thu được cũng chứng minh
rằng việc sử dụng men vi sinh sẽ làm giảm đi sự ô nhiễm N và P trong nền
đáy ao nuôi.
Angela D. Schulze và cộng sự (2006) đã tiến hành nghiên cứu về sự
đa dạng các dòng vi khuẩn trong các trại sản xuất giống cá biển và nhuyễn
thể được xác định ở Bristish Columbia bởi vì khả năng duy trì sự cân
bằng thích hợp của các nhóm vi sinh này có thể là chìa khoá thành công
trong việc quản lý môi trường nuôi. Trong tổng số 589 dòng phân lập
được, có 172 ngành đã được định danh bằng phương pháp định týp 16S
ribosomal DGGE. 60% của các dòng trên đã được giải trình tự cho thấy
chúng thuộc 112 dòng/chủng vi khuẩn khác nhau. 20% trong những dòng
được định danh thường xuyên xuất hiện trong các trại giống và trong môi
trường nước mặn có khoảng hơn 3 loài.
1.5. NGHIÊN CỨU ỨNG DỤNG VI SINH VẬT XỬ LÝ NƯỚC THẢI
1.5.1. Ứng dụng vi sinh vật xử lý nước thải
Có một số loài vi sinh vật mà chủ yếu là vi khuẩn dị dưỡng hoại sinh có
trong nước thải có khả năng sử dụng các chất hữu cơ và một số chất khoáng
làm nguồn dinh dưỡng và tạo năng lượng, sinh trưởng [7].
14
Phương pháp này dựa trên cơ sở là hoạt động của vi sinh vật vì vậy điều
kiện đầu tiên và vô cùng quan trọng là nước thải phải là môi trường sống của
quần thể vi sinh vật phân hủy các chất hữu cơ có trong nước thải [7].
Từ yêu cầu trên mà nước thải phải thỏa mãn những yêu cầu sau:
+ Không có chất độc làm chết hay ức chế hoàn toàn hệ vi sinh vật trong
nước thải. Trong số các chất độc phải chú ý đến hàm lượng kim loại nặng [7].
+ Chất hữu cơ có trong nước thải phải là cơ sở chất dinh dưỡng nguồn
cacbon và năng lượng cho vi sinh vật. Những chất dinh dưỡng đó thường là

đồng tưới và bãi lọc chỉ xây dựng ở những nơi có mực nước nguồn thấp hơn
so với mặt đất [19].
c. Xử lý nước thải dựa trên cơ sở sinh trưởng lơ lửng của vi sinh vật
Trong nước thải luôn có những hạt chất rắn lơ lửng và khó lắng, đây
là những giá thể giúp cho vi sinh vật có thể bám vào phát triển thành
những bông cặn có khả năng phân hủy chất hữu cơ trong nước thải. Người
ta có thể ứng dụng sinh trưởng lơ lửng để xử lý nước thải kỵ khí hay hiếu
khí [19].
Những công trình xử lý nước thải hiếu khí ứng dụng sinh trưởng lơ lửng
với vi khuẩn hiếu khí như aeroten, mương oxy hóa, bể arotank, …Những
công trình xử lý nước thải kỵ khí ứng dụng sinh trưởng lơ lửng với vi khuẩn
kỵ khí bắt buộc như xử lý bằng tiếp xúc kỵ khí ANALIFT, xử lý nước thải ở
lớp bùn kỵ khí và dòng nước hướng lên UASB hay còn gọi là lên men ở lớp
bùn ANAPULSE. Phương pháp này có thể loại bỏ BOD
5
80 – 95%, COD từ
65 – 90% với những nước thải bị ô nhiễm nặng [19].
16
d. Xử lý nước thải dựa trên cơ sở sinh trưởng bám dính của vi sinh vật
Trong dòng nước thải có những vật rắn làm giá mang, giá mang là nơi
các vi sinh vật dính bám. Trong số những vi sinh vật thì có những loài có khả
năng sinh ra chất dẻo hay polymer sinh học, chất này có khả năng sính nhờ
vậy có càng nhiều vi khuẩn và ngày càng dày lên gọi là màng sinh học. Màng
này có khả năng kết dính những động vật nguyên sinh, trứng giun sán,… làm
cho nước thải được làm sạch [5].
Những công trình hiếu khí xử lý nước thải ứng dụng màng sinh học như
lọc sinh học, đĩa quay sinh học, BIOFOR, NITRAZUR, OIUR,
BIODROP…[5].
Những công trình kỵ khí xử lý nước thải ứng dụng màng sinh học như
lọc kỵ hí với sinh trưởng gắn kết trên giá mang hữu cơ (ANAFIZ), lọc kỵ khí