ĐẠI HỌC ĐÀ NẴNG
TRƯỜNG ĐẠI HỌC SƯ PHẠM
KHOA SINH – MÔI TRƯỜNG
NGUYỄN THỊ HỒNG TRINH

NGHIÊN CỨU TUYỂN CHỌN MỘT SỐ CHỦNG VI KHUẨN
CÓ KHẢ NĂNG PHÂN HỦY TINH BỘT VÀ THỬ NGHIỆM
XỬ LÝ NƯỚC THẢI HỒ NUÔI TRỒNG THỦY SẢN TẠI
QUẢNG NAM - ĐÀ NẴNG KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP
Đà nẵng, 2015
ĐẠI HỌC ĐÀ NẴNG
TRƯỜNG ĐẠI HỌC SƯ PHẠM
KHOA SINH – MÔI TRƯỜNG NGUYỄN THỊ HỒNG TRINH

NGHIÊN CỨU TUYỂN CHỌN MỘT SỐ CHỦNG VI KHUẨN
CÓ KHẢ NĂNG PHÂN HỦY TINH BỘT VÀ THỬ NGHIỆM
XỬ LÝ NƯỚC THẢI HỒ NUÔI TRỒNG THỦY SẢN TẠI
QUẢNG NAM - ĐÀ NẴNG


MỞ ĐẦU 1
1. Đặt vấn đề 1
2. Mục tiêu của đề tài 2
3. Ý nghĩa khoa học và thực tiễn của đề tài 2
Chương 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU 3
1.1. Sơ lược về VSV có khả năng sinh amylase và đặc điểm của enzyme 3
1.1.1. Các loại VSV sinh enzyme amylase 3
1.1.2. Đặt tính và cơ chế tác dụng của amylase 4
1.1.3. Sinh tổng hợp amylase ở VSV 5
1.2. Các yếu tố ảnh hưởng đến quá trình sinh trưởng và sinh tổng hợp amylase
của VSV 5
1.2.1. Ảnh hưởng của pH môi trường 5
1.2.2. Ảnh hưởng của nhiệt độ 6
1.2.3. Ảnh hưởng của thời gian nuôi cấy 6
1.3. Các nghiên cứu ứng dụng VSV trong xử lý nước thải NTTS 7
1.3.1. Nước thải NTTS và các vấn đề môi trường 7
1.3.2. Các ghiên cứu VSV để xử lý nước thải NTTS 8
1.3.3. Các ứng dụng VSV trong xử lý nước thải NTTS 10
Chương 2. ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 12
2.1. Đối tượng nghiên cứu 12
2.2. Địa điểm, phạm vi và thời gian nghiên cứu 12
2.2.1. Địa điểm nghiên cứu 12
2.2.2. Phạm vi nghiên cứu 12
2.3. Phương pháp nghiên cứu 12
2.3.1. Phương pháp lấy mẫu 12
2.3.2. Phương pháp phân lập và xác định VK có khả năng phân hủy tinh bột
mạnh 12
2.3.3. Phương pháp nhộm Gram 14
2.3.4. Phương pháp xác định các điều kiện ảnh hưởng đến sinh trưởng của
VK 14


DANH MỤC TỪ VIẾT TẮT
NTTS : nuôi trồng thủy sản
VK : vi khuẩn
VSV : vi sinh vật
EM : efective microorganis
CHC : chất hữu cơ
BOD : nhu cầu oxy sinh học
DANH MỤC BẢNG
TT
Tên bảng
Trang
1
Bảng 3.1. Khả năng phân giải tinh bột của các chủng vi
khuẩn phân lập
18

DANH MỤC BIỂU ĐỒ
TT
Tên biểu đồ
Trang
1
Biểu đồ 3.1. Quá trình sinh trưởng của VK T1, T3 và T5
trong 72 h nuôi cấy
21
2
Biểu đồ 3.2. Khả năng phân giải tinh bột của enzyme
amylase 3 chủng VK T1, T3, T5 trong 72 h nuôi cấy
22
3

+
trong nước thải
NTTS qua 9 ngày xử lý
29
11
Biểu đồ 3.1. Sự thay đổi hàm lượng PO
4
3-
trong nước thải
NTTS qua 9 ngày xử lý
30

DANH MỤC HÌNH
TT
Tên hình
Trang
1
Hình 3.1. Khả năng phân giải tinh bột của các chủng vi
khuẩn phân lập
19
2
Hình 3.2. Hình thái khuẩn lạc 3 chủng VK T1, T3, T5 nuôi
cấy trên môi trường LB
20
3
Hình 3.3. Hình thái tế bào của 3 chủng VK T1, T3,T5
20
4
Hình 3.4. Vòng phân giải tinh bột của các chủng VK trong
thời gian tối ưu

dịch vụ thú y Tuy nhiên, việc phát triển mạnh diện tích nuôi trồng đã gây ảnh
hưởng xấu - làm suy thoái môi trường trên diện rộng, trong đó có tỉnh Quảng Nam
và Đà Nẵng. Tình trạng ô nhiễm môi trường đang xảy ra nghiêm trọng trong
NTTS do hàm lượng lớn các chất hữu cơ (CHC) cao phân tử chậm phân hủy
như tinh bột, pectin, protein, lipid, cellulose và một số chất khác [7] sinh ra từ
lượng thức ăn dư thừa, phân và các rác thải khác đọng lại dưới đáy ao nuôi.
Ngoài ra, còn các hóa chất, kháng sinh được sử dụng trong quá trình nuôi
trồng cũng dư đọng lại mà không được xử lý. Việc hình thành lớp bùn đáy do
tích tụ lâu ngày của các CHC, cặn bã là nơi sinh sống của các vi sinh vật
(VSV) gây thối, các VSV sinh các khí độc như NH
3
, NO
2
, H
2
S, CH
4
Các
VSV gây bệnh như: Vibrio, Aeromonas, E. coli, Pseudomonas, Proteus,
Staphylococcus nhiều loại nấm và nguyên sinh động vật làm phát sinh
2
nhiều loại dịch bệnh nguy hại, ảnh hưởng lâu dài đến đời sống và kinh tế
người dân. Bên cạnh đó, việc xả chất thải chưa qua xử lí ra môi trường đã và
đang hủy hoại môi trường sinh thái, làm cạn kiệt nguồn nước dùng cho sinh hoạt
và nuôi trồng.
Tại Quảng Nam và Đà Nẵng hiện nay vẫn chưa có công trình nghiên cứu
nào về việc xử lý nước thải hồ nuôi trồng thủy sản cũng như đưa ra các biện
pháp để giảm thiểu ô nhiễm. Như vậy, việc tìm ra giải pháp xử lý ô nhiễm
môi truờng, xử lý nuớc thải NTTS đang là một vấn đề mang tính thời sự, rất
cấp bách. Xuất phát từ những cơ sở trên đây, chúng tôi tiến hành thực hiện đề

nguồn tự nhiên. VSV tạo amylase được dùng nhiều hơn cả là nấm sợi, giải
nấm men và VK, còn xạ khuẩn thì ít hơn. Để thu nhận amylase người ta
thường dùng các giống nấm sợi Aspergillus và Rhizopus
Nấm men và giả nấm men thuộc các giống Candida, Saccharomyces,
Endomycopsis, Endomyces cũng tạo amylas. Đặc biệt người ta đã tuyển chọn
được chủng Endomycopsis specise 20-9 có khả năng tổng hợp mạnh mẽ
glucoamylase, -amylase, glucoziltrans-ferase và invertase.
Nhiều VK cũng có khả năng tạo lượng lớn enzyme amylase như:
Phytomonas destructans, B.cassavanum, Clostridium acetobutylicum,
Pseudomonas saccharophila… Các VK ưa nhiệt có khả năng sinh trưởng
nhanh và phát triển tốt ở nhiệt độ cao nên khi nuôi chúng ít bị nhiễm VSV
khác. Đáng chú ý là B.diastaticus, B.tearothermo-philus, B.coagulans, B.
circulans, đặt biệt là B.circulans được phân lập từ đất sinh trưởng tốt ở 65-
70C và tạo amylase mạnh nhất ở 50C.
Trong nhóm xạ khuẩn thì rất hiếm gặp loài tạo amylase mạnh mẽ, tuy
nhiên, cũng có một số, chẳng hạn như xạ khuẩn ưa nhiệt. Micromonospora
vulgaris 42 có khả năng tạo một lượng nhỏ - amylase hoạt động ở 65
o
C
cùng với proteinase và các enzyme khác.
4
1.1.2. Đặc tính và cơ chế tác dụng của amylase [2]
Hiện nay người ta đã biết rõ có 6 loại enzyme amylase trong đó -
amylase, -amylase, gluco-amylase (-amylase) thủy phân liên kết -1,4-
glucoside của tinh bột và các polysaccharide, 3 amylase còn lại (dextrin-6-
glucanhidrolase, amilopectin-6-glucanhidrolase, oligoside-6-glucanhidrolase
hay dextrinase) thủy phân các liên kết -1,6-glucoside trong polysaccharide
và các dextrin cuối.
a.


-amylase xúc tác sự thủy phân các liên kết -1,4glucan trong tế
bào.

- amylase chỉ phổ biến trong giới thực vật. Vi khuẩn không có

-
amylase.
c. Glucoamylase
Glucoamylase thủy phân liên kết -1,4 glucan và -1,6 glucan trong
polysaccharide. Glucoamylase có khả năng xúc tác thủy phân phân hủy hoàn
toàn tinh bột, glucogen, amylopeptin, panose, isomantose và mantose tới
glucose. Đa số glucoamylase đều thuộc loại enzyme acid, thể hiện hoạt lực tối
đa ở vùng pH 3,5 – 5. Glucoamylase bền với acid nhưng lại kém bền với tác
dụng của rượi etylic, aceton.
1.1.3. Sinh tổng hợp amylase ở VSV
Khi nuôi VSV tạo amylase có hai quá trình liên kết mật thiết nhau: quá
trình tổng hợp sinh khối VSV và quá trình tích tụ enzyme trong tế bào hay
ngoài môi trường.
Amylase của Bacillus subtilis được tạo thành ở VK trong giai đoạn đã
hoặc đang kết thúc quá trình sinh trưởng. Cả trong môi trường nuôi cấy lẫn
trong bản thân tế bào VK “trẻ” đều không tìm thấy amylase. Amylase ngoại
bào được tổng hợp ở tế bào đang chuyển sang thời kỳ tự phân.
1.2. Các yếu tố ảnh hưởng đến quá trình sinh trưởng và sinh tổng hợp
amylase của VSV [9] [10] [2]
1.2.1. Ảnh hưởng của pH môi trường
Khi nuôi cấy VSV bằng phương pháp nuôi cấy bề mặt thì pH môi
trường ít bị thay đổi trong quá trình nuôi do môi trường có dung dịch đệm, độ
ẩm thấp. Tuy nhiên, pH ban đầu cũng ảnh hưởng không nhỏ đến sự phát triển
6
và hình thành enzyme của VSV. VSV ưa acid có pH sinh trưởng tốt nhất là

1.3. Các nghiên cứu ứng dụng VSV trong xử lý nước thải NTTS
1.3.1. Nước thải NTTS và các vấn đề môi trường
Ở Việt Nam hoạt động NTTS thực sự khởi sắc từ năm 1990 và đến năm
2000 – 2002 thì bùng phát cả về diện tích lẫn đối tượng nuôi. Việc mở rộng
diện tích NTTS được tiến hành chủ yếu trên các vùng đất ngập nước ven biển
miền Trung và một phần diện tích canh tác nông nghiệp kém hiệu quả đã
được chuyển sang NTTS [4].
Sự suy giảm chất lượng môi trường nước tăng tỷ lệ thuận với diện tích
và sản lượng NTTS. Tại một số khu vực nuôi tôm tập trung (trong đó có cả
nuôi trên cát), do việc xả thải các CHC phú dưỡng, chất độc VSV (cả mầm
bệnh) và các chất sinh hoạt bừa bãi làm cho môi trường suy thoái, bùng nổ
dịch bệnh (bệnh tôm năm 1993 – 1994) và gây thiệt hại đáng kể về kinh tế
cũng như về điều kiện môi trường sinh thái [4].
Hiện nay, có rất nhiều loại sản phẩm thuốc, hóa chất và chế phẩm sinh
học được dùng rộng rãi trong NTTS trên thế giới. Hóa chất được dùng trong
NTTS trên thế giới thường ở các dạng sau: thuốc diệt nấm (antifoulants),
thuốc khử trùng (disinfectants), thuốc diệt tảo (algicides), thuốc trừ cỏ
(herbicides), thuốc trừ sâu (pesticides), thuốc diệt ký sinh trùng (parasiticides)
và thuốc diệt khuẩn (antibacterials) và chất kháng sinh được sử dụng đáng kể
trong NTTS hoặc để chữa các bệnh lây nhiễm hoặc phòng bệnh [5].
Những hóa chất trên có vai trò quan trọng trong việc bảo vệ sức khỏe
động vật thủy sản nếu như sử dụng đúng, nhưng khi lạm dụng dẫn đến những
hậu quả khôn lường, gây rủi ro cho người lao động, làm giảm giá trị thương
phẩm và còn tạo các chủng VK kháng thuốc làm giảm hiệu quả trong điều trị
bệnh.
8
Phần lớn lớp bùn trong các đầm, ao NTTS chủ yếu là các CHC như
protein, lipit, axit béo với công thức chung CH
3
(CH

Các chủng VK và nấm mốc là những VSV được nghiên cứu nhiều nhất
để xử lý nước thải trong nhiều thập kỷ qua. Theo nhiều nghiên cứu cho thấy
thành phần và cấu trúc các chủng VK trong ao nuôi tôm thâm canh và rừng
ngập mặn rất khác nhau nguyên nhân là do nguồn thức ăn đầu vào cung cấp
cho các ao nuôi, do đó các chủng VK này có khả năng xử lý nguồn chất thải
hữu cơ trong ao nuôi với hiệu xuất cao hơn các chủng phân lập từ các nơi
khác [21].
Một nghiên cứu về quản lý sức khỏe ao nuôi tôm sú nhờ chế phẩm sinh
học của M.K. ABU HENA và cs đã chỉ ra rằng sau khi sử dụng các chủng VK
có lợi xử lý nước thải nuôi tôm các thông số ô nhiễm hữu cơ giảm xuống
9
đáng kể, các thông số như oxy hòa tan, pH, nhiệt độ, độ mặn, tổng chất rắn lơ
lửng, NO
3
-
và PO
4
3-
đều nằm trong khoảng thích hợp cho tôm phát triển [18].
Nghiên cứu về sự ảnh hưởng của các yếu tố lý hóa lên VK trong ao nuôi cá
của Jun và cs (năm 2000) chỉ ra rằng sự sinh trưởng và sinh enzyme của VK
chịu ảnh hưởng nhiều bởi các yếu tố lý hóa trong ao nuôi và nghiên cứu cũng
chỉ ra rằng từ bề mặt lớp bùn đáy xuống 1,5 cm là nơi diễn ra quá trình phân
hủy CHC mạnh nhất [22].
1.3.2.2. Nghiên cứu trong nước
Trong nước đã có nhiều công trình khoa học nghiên cứu sử dụng VSV
phân giải tinh bột. Nghiên cứu tuyển chọn các VK có tiềm năng phân hủy tinh
bột và protein để ứng dụng trong xử lý nước thải chế biến lương thực và thủy
sản, Nguyễn Hoàng Mỹ và cs (năm 2011) đã tuyển chọn được 12 chủng VK
khác nhau bao gồm 6 chủng có khả năng phân giải tinh bột mạnh nhất và 6

cơ. Tiêu biểu là việc sử dụng hệ VSV để phân hủy các chất ô nhiễm hữu cơ từ
chất thải. Có thể nêu lên một số phương pháp sau:
 Probiotic trong xử lý môi trường
Trong NTTS, probiotic còn là chế phẩm xử lý môi trường. Thay cho mục
đích chủ yếu là tiêu diệt các bào tử VK, chế phẩm sinh học được sản xuất với
mục đích chủ yếu là kích thích sự gia tăng của các VSV có lợi trong ao nuôi.
Một thành phần khác cũng được tìm thấy trong chế phẩm probiotic đó là
tập hợp các enzyme có nguồn gốc VSV như: amylase, proteose, lipase,
cellulose, chitinase, một số vitamin thiết yếu hoặc axit amin và chất
khoáng,… nhằm kích thích hoạt tính ban đầu của VSV của chế phẩm và xúc
tác cho sự hoạt động của enzyme trong môi trường.
 Men vi sinh trong NTTS
Khi đưa men vi sinh vào môi trường nước ao, các VK có lợi sẽ sinh sôi và
phát triển nhanh. Hoạt động của các VK có lợi sẽ có tác dụng cho các ao nuôi
tôm như phân hủy các CHC trong nước, phân hủy xác tảo chết và làm giảm
sự gia tăng của lớp bùn đáy ao, giảm các độc tố trong nước (NH
3
, H
2
S,
NO
2
…), nâng cao khả năng miễn dịch của tôm, ức chế hoạt động và phát
triển của VSV có hại,… [15]
 Chế phẩm EM trong NTTS
11
Việc ứng dụng chế phẩm sinh học vào quá trình quản lý môi trường ao
nuôi tôm là một tiến bộ trong ứng dụng VSV xử lý môi trường và loại chế
phẩm sinh học được sử dụng có hiệu quả nhất là EM. Qua một thời gian sử
dụng cho thấy chế phẩm EM có khả năng phân giải tốt các chất thải hữu cơ

- Nước thải hồ NTTS
2.2. Địa điểm, phạm vi và thời gian nghiên cứu
2.2.1. Địa điểm nghiên cứu
Quá trình thu thập mẫu nước để phân lập và xác định các chủng VK
được thực hiện tại các hồ NTTS ở khu vực Quảng Nam – Đà Nẵng.
Quá trình phân lập, xác định hoạt tính, nghiên cứu đặc điểm sinh học,
sử dụng VK để xử lý nước thải NTTS và phân tích các chỉ số được tiến hành
ở các phòng thí nghiệm khoa Sinh – Môi trường, trường Đại học Sư phạm Đà
Nẵng: Phòng thí nghiệm Sinh lý – Hóa sinh – Vi sinh, Công nghệ sinh học và
phân tích môi trường.
2.2.2. Phạm vi nghiên cứu
Các thí nghiệm trong nghiên cứu được tiến hành ở quy mô phòng thí
nghiệm được thực hiện từ 8/2014 – 4/2015.
2.3. Phương pháp nghiên cứu
2.3.1. Phương pháp lấy mẫu
Mẫu nước thải và bùn được lấy từ các ao nuôi tôm tại Quảng Nam – Đà
Nẵng. Tiến hành lấy 6 mẫu bùn trong 2 đợt lấy mẫu tại 2 địa điểm nuôi tôm
thuộc Hội An – Quảng Nam và Nam Ô – TP Đà Nẵng.
2.3.2. Phương pháp phân lập và xác định VK có khả năng phân hủy tinh
bột mạnh
2.3.2.1. Phương pháp phân lập
Phân lập các mẫu dựa trên phương pháp phân lập của Egorow [1], [16].
13
Môi trường nuôi cấy LB Broth:
Cao nấm men: 5 g
Trypton: 10 g
NaCl: 10 g
Agar : 8 - 10 g
Pha trong 1 lít nước cất, hấp khử trùng ở 121C trong 20 phút.
Dùng pipet vô trùng hút dịch pha loãng ở nồng độ từ 10

4
0,2 g
KCl 0,2 g
FeSO
4
0,004 g
Agar 8 g
Tinh bột 2 g
Bước 1: Kiểm tra và khẳng định khả năng phân hủy tinh bột. Sau khi có
các khuẩn lạc thuần khiết, tiến hành cấy chấm điểm các khuẩn lạc vào môi
trường thử hoạt tính, ủ 37C. Sau 24 giờ, nhỏ dung dịch thuốc thử lugol vào
14
các khuẩn lạc. Các chủng có khả năng phân hủy tinh bột sẽ xuất hiện vòng tan
trong suốt xung quanh khuẩn lạc, phần môi trường còn lại trên đĩa có màu
xanh dương. Chủng nào không có khả năng phân hủy tinh bột thì xung quanh
bắt màu xanh dương và không có vòng tan trong suốt.
Bước 2: Từ những chủng xác định có khả năng phân hủy tinh bột, tiến
hành cấy ria khuẩn lạc vào môi trường thử hoạt tính, ủ 37C. Sau 24 giờ, nhỏ
dung dịch lugol vào các đĩa thạch. So sánh vòng phân giải, chọn các chủng có
khả năng sinh enzyme amylase mạnh để nghiên cứu điều kiện sinh trưởng và
sinh enzyme đồng thời thử nghiệm xử lý nước thải NTTS trong bể hiếu khí
quy mô phòng thí nghiệm.
2.3.3. Phương pháp nhộm Gram
Dùng que cấy lấy nước vô trùng để làm 3 vết bôi trên 3 phiến kính.
Dùng que cấy lấy một chút khuẩn lạc của chúng làm vết bôi. Để khô vết bôi
trong không khí hoặc cố định nhẹ trên lửa đèn cồn. Đặt 3 miếng giấy lọc trên
3 vết bôi. Nhuộm tiêu bản bằng thuốc nhuộm tím kết tinh qua giấy lọc trong
1 phút. Nhuộm lugol trong 1 phút, rửa nước, tẩy bằng cồn trong 30 giây, để
nghiêng tiêu bản, nhỏ từ từ từng giọt cồn cho đến khi tan hết màu. Rửa nước,
nhuộm bổ sung fuchsin hay safranin trong 1 phút, rửa nước và làm khô và soi

Tiến hành tương tự như thí nghiệm khảo sát thời gian sinh trưởng mạnh
nhất của các chủng VK. Sau các khoảng thời gian 24, 36, 48, 60, 72 giờ, ly
tâm dịch huyền phù và thu dịch enzyme amylase thô. Dùng ống nghiệm có
đường kính 1,5 cm đã được khử trùng để đục lỗ trên bề mặt thạch đĩa. Cho 70
l dịch enzyme thô vào các giếng trên đĩa petri, đặt đĩa vào trong tủ ấm ở
nhiệt độ 35C. Sau 48 giờ, nhuộm bằng thuốc thử và đo vòng phân giải.
2.3.5.2. Ảnh hưởng của pH
Tiến hành tương tự như thí nghiệm khảo sát ảnh hưởng của pH lên sinh
trưởng của VK. Sau các khoảng pH khảo sát, thu enzyme và cho khoảng 70