Bộ GIÁOLời
DỤC
cảmVÀ
ơn!ĐÀO TẠO
TRƯỜNG ĐẠI HỌC su PHẠM HẢ NỘI 2
———* Ỷ- *———
Lời đầu tiên tôi xin bày tỏ lòng biết ơn chân thành và sâu sắc nhất tới
PGS.

TS.

Đinh Thị Kim Nhung - người đã hưóưg dẫn tận tình chỉ bảo, người đã cung cấp
LÊ THỊ HUỆ
cho
tôi
nhiều kiến thức quý báu, giúp đỡ tôi trong suốt quá trình tiến hành nghiên cứu.
Xin gửi lời cảm ơn sự giúp đỡ của các thầy, cô giáo trong tổ bộ môn Vi
sinh

NGHIÊN CỨU MỘT SỐ CHỦNG VI KHUẨN

khoa Sinh Trường ĐHSP Hà Nội 2 đã tạo mọi điều kiện về cơ sở vật chất, giúp
LÊN MEN KOMBUCHA TỪ TRÀ THÁI NGUYÊN
đỡ
tôi
trong quá trình học tập và nghiên cứu đề tài.
Đồng thời tôi cũng xin chân thành cảm ơn sự giúp đỡ của Ban Giám hiệu
CHUYÊN NGÀNH: SINH THÁI
Cuối cùng, tôi xin bày tỏ lòngHỌC
biết ơn chân thành tới nhũng người thân
MÃ SỐ: 60 42 01 20


NHỮNG TÙ VÀ THUẬT NGỮ VIẾT TẮT TRONG LUẬN VĂN
1. AD

P
2. ATP

:
3. cs

:
diphotphat
Adenozin

Colony Forming Unit (Đơn vị hình thành khuẩn
lạc)
:

U:

:

D
6. Glc

triphotphat

: cộng sự

4. CF

para

-

amino

Pyrroloquinoline

benzoic

acid

Quinone

: Hydroquinone
UA
15. vsv
: Symbiotic Colony of Bacteria and Yeast


MỤC LỤC
MỞ ĐẦU.......................................................................................................1

1. Lý do chọn đề tài............................................................................................1
2. Mục đích của đề tài........................................................................................2
3. Nội dung nghiên cứu......................................................................................2
4. Đối tượng và phạm vi nghiên cứu...................................................................2
5. Phương pháp nghiên cứu.................................................................................2
5.1. Phương pháp vi sinh........................................................................................2
5.2. Phương pháp hóa sinh.....................................................................................2

2.1. Vật liệu và thiết bị nghiên cứu.................................................................25
2.1.1. Đối tuợng.....................................................................................................25

2.1.2. Hóa chất và thiết bị.................................................................................25
2.1.3.1. Hóa chất..............................................................................................25
2.1.3.2. Thiết bị................................................................................................25
2.1.3. Môi trường................................................................................................26
2.2..................................................................... Phương pháp nghiên cứu
..................................................................................................................26

2.2.1. Phương pháp vi sinh................................................................................26
2.2.1.1. Phương pháp phân lập vi khuấn và quan sát hình thái tế bào
trên tiêu bản nhuộm Gram..................................................................................26
2.2.1.2.

Phuơng pháp xác định số lượng tế bào vi sinh vật bằng phương pháp

đếm .... 28
2.2.1.3. Bảo quản chủng giống...........................................................................29
2.2.1.4. Phương pháp hoạt hóa giống................................................................29

2.2.2. Phương pháp hoá sinh.............................................................................29
2.2.2.1. Phát hiện hoạt tính cataỉase..............................................................29
2.2.2.2. Phát hiện khả năng oxy hoá rượu êtylic thành acid acetic.... 29


CHƯƠNG 3. KẾT QUẢ NGHIÊN cửu VÀ THẢO LUẬN............................34

3.1.



sinh

trưởng

của

chủng

vi

khuấn

Acetobacter A2 và A15........................................................................................46

3.3.

Khảo sát ảnh hưởng của một số yếu tố tói quá trình lên men

kombucha ..............................................................................................................48

3.3.1. Khảo sát ảnh hưởng của môi trường dinh dưỡng đến quá trình
lên men kombucha................................................................................................48

3.3.1.1. Khảo sát ảnh hưởng của (NH2)2S04...............................................48
3.3.1.2.

Khảo sát ảnh hưởng của MgS04.7H20...............................................49

3.3.1.3. Khảo sát ảnh hưỏng của KH2PƠ4 .................................................50


3.2. Chuyển hoá ethanol thành acid acetic.......................................................35
3.3. Khả năng oxy hoá acetate...........................................................................37
3.4. Hoạt tính catalase của Acetobacter.............................................................37
3.5. Kết quả thử hoạt tính cellulose của vi khuẩn Acetobacter nhóm 2.39
3.6. Hình thái tế bào vi khuẩn Acetobacter A2 và A15 trên kính hiển vi quang

học (x 1000 lần)..............................................................................................42
3.7. Khuân lạc của vi khuân Acetobacter A2 và A15 trên môi trường thạch

đĩa 43
3.8. Mầu vi khuấn Acetobacter A2 và A]5 trên môi trường thạch nghiêng. .43
3.9. Đồ thị biếu diễn động thái sinh trưởng của chủng Acetobacter A2

và
A,5..................................................................................................................47


KH2PC>4 1,0 và 1,5 (g/1)............................................................................. 50
3.14. Anh kombucha lên men từ chủng Acetobacter A2 với thời gian lên men

5,
7 và 9 ngày......................................................................................................53
3.15. Ảnh kombucha lên men từ chủng Acetobacter A]5 với giá trị pH ban

đầu
là 4 và 5...........................................................................................................55
3.16. Ảnh kombucha lên men từ chủng Acetobacter A2 ở nhiệt độ 20°c và

30°c.................................................................................................................57



3.8. Khảo sát ảnh hưởng của nhiệt độ đến hàm lượng acid tổng số sinh ra của 2

chủng Acetobacter A2 và Ai5.........................................................................56
3.9. Một số đặc điểm so sánh khi lên men kombucha ở các dụng cụ làm bằng

các
vật liệu inox, thủy tinh, nhựa..........................................................................59
3.10. Đánh giá chất lượng sản phấm kombucha bằng phương pháp cảm


MỞ ĐẦU

1. Lý do chọn đề tài
Ngày nay công nghệ sinh học đang trở thành một ngành kĩ thuật chủ
đạo của nhiều quốc gia trên thế giới. Gắn liền với nó là công nghệ vi sinh với
những thành tựu lớn, có ý nghĩa trong đời sống, trong các ngành công nghiệp,
trong y học... Khó có thế tìm ra một lĩnh vực nào của công nghệ sinh học mà
lại không liên quan tới vi sinh vật.
Công nghệ vi sinh được ứng dụng rộng rãi trong đời sống, đặc biệt là
trong công nghệ thực phấm như muối dưa, làm sữa chua, nem chua... và sản
xuất đồ uống như bia, rượu... Một trong những sản phấm được tạo ra từ công
nghệ vi sinh là trà " thủy sâm" đã xuất hiện từ rất lâu nhưng lại rất ít người
biết đến. Trà " thủy sâm", người Pháp gọi là Champignon De Longuc Vie
(nấm trường sinh), người Nhật gọi nó là kombucha, người Trung Quốc gọi là
thủy hoài sâm, Nga gọi là nấm trà. Đây là một loại nước uống được nhiều
người sử dụng và có lợi cho sức khỏe đối với tất cả mọi người đặc biệt với
người già và trẻ em. Kombucha là một cấu trúc có dạng như thạch màu xám,
thật ra là một hỗn họp phức tạp cộng sinh giữa nấm men và vi khuấn.

trên môi trường Hoyer; phương pháp xác định khả năng tổng họp acid bằng


3

chuấn độ với NaOH 0,1N có phenolphtalein 0,1% làm chỉ thị; phát hiện khả
năng tổng hợp cellulose.

5.3.

Phương pháp cảm quan

Đánh giá sản phẩm theo TCVN 3217-79

5.4.

Phương pháp toán học

6. Đóng góp của đề tài
Nghiên cứu sự đa dạng của một số chủng vi khuấn có khả năng lên men
kombucha từ trà Thái Nguyên; xây dựng quy trình lên men kombucha quy mô
phòng thí nghiệm.


4

NỘI DƯNG
CHƯƠNG 1

TỎNG QUAN TÀI LIỆU


5

oxydans [24], [35]. Nhiều họp chất quan trọng đối với việc bảo vệ sức khỏe
con người, được sản xuất trong quá trình lên men của kombucha cộng sinh:
một loạt các axit hữu cơ như glucuronic, gluconic, lactic, acetic, axit sưccinic,
butyric, axit malic và usnic; vitamin, đặc biệt là nhóm B và vitamin c, axit
amin tự do và các enzyme hoạt động khác nhau. GlcUA được coi là một trong
nhũng họp chất quan trọng được tìm thấy trong kombucha giải khát do tác
động giải độc của nó và ảnh hưởng tới sức khỏe [29], [37], nó ngăn ngừa
bệnh tim mạch, các bệnh thoái hóa thần kinh mãn tính thoái hóa và ung thư
[22], [44].
Quá trình lên men được bắt đầu bằng con nấm giống hay chính là sự
lên men cộng sinh của vi khuấn và nấm men, “con nấm” này được các nhà
khoa học phân loại như là biofilm (màng sinh học - là một tố họp vi sinh vật
trong đó các tế bào kết dính lại với nhau thành một cấu trúc trên bề mặt và
sinh ra các ngoại cao phân tử EPS - Extracellular Polymeric substance). Con
nấm có hình dạng giống bình chứa nó, bề dày thì phụ thuộc vào thời gian nuôi
cấy và độ pH của môi trường.
Nồng độ acid và rưọu trong kombucha giúp chống nhiễm các nấm mốc
trong không khí và các bào tử vi khuẩn. Ket quả là kombucha có thể tương
đối dễ dàng lên men trong điều kiện thường. Các vi khuấn và nấm men trong
kombucha cũng sản xuất ra các kháng sinh [26].
Trong quá trình làm cấn thận đế tránh cho trà không bị nhiễm các loại
nấm mốc gây độc cho cơ thể. Các yếu tố đế đảm bảo an toàn cho việc lên
men: môi trường sạch sẽ, nhiệt độ thích họp, pH thấp.


6


V
V
V
V

pH
■
3
4
5
6
7
3

9
10

Sulíuric Acid (Battery
Acid)
(H2S04)
stomach Acid
Carbonated
kombucha! 15 - 2.5 Beverages
Orange Juice
Beer
Coffee
Pure Rain Egg yblks
Milk
Freshly Distilled Water, Salivá
Blood, Tears

D-glucuronic
acid
o
OH

COOH
'°v_
>=0

HO
ỒH
gluoorvol
C-OH
C-0

I1
H-Ộ-OH
I
HO-Ộ-H
o-glucarlc
ac»rJ

H-C-OH
HO-CỊĨ-H
H-C-OH
H-Ọ-OH
ChqOH
ỹiucomc
aciổ
Hình 1.3. Cấu trúc hóa học của một số họp chất trong trà kombucha

gluconicum...
Chính sự có mặt của các chủng Acetobacter (đặc biệt là Acetobacter
xylinum) đã hình thành nên cấu trúc của kombucha. Acetobacter xylinum có
khả năng tạo màng hemicelluĩose khá dày và chắc, tạo màu xanh với thuốc
nhuộm Iod và H2SO4. Nên kombucha trông giống một cái bánh dẹp, thường
được gọi là “con nấm” hay SCOBY.

Hình 1.4. “ Con nấm” (SCOBY)
Kombucha sinh trưởng tốt trong môi trường nước trà đưòng, thường
được sử dụng đê lên men dung dịch trà đường. Trong quá trình lên men,


9

kombucha sẽ tạo ra một lóp màng mỏng trên bề mặt dịch trà và dần dần tăng
bề dày, hình thành nên một lớp màng thứ hai (thường gọi là “nấm con”), tách
biệt với lớp màng ban đầu ( “nấm mẹ”).
Hình dạng và kích thước của “con nấm” phụ thuộc vào hình dạng tiết
diện của bình chứa.

Hình 1.5. Kombucha được lên men trong các bình chứa có kích thước và
hình dạng khác nhau
Người ta có thế dùng trà xanh, trà đen, trà ô long, trà kukicha hoặc trà
lipton đế làm môi trường lên men kombucha. Cả trà xanh và trà đen đều có
thế được sử dụng đế lên men, tạo ra mùi vị khác nhau, tuy nhiên, trong môi
trường nước trà xanh, kombucha tạo thành mỏng hơn, nhưng tốc độ tăng
trưởng nhanh hơn trong dịch trà đen.

1.1.3.


chủ yếu dựa vào các đặc điểm kiểu hình bao gồm các đặc điểm hình thái, sinh
lý, dinh dưỡng và đặc điếm sinh thái.

a. Đặc điểm hình thái
Các đặc điếm hình thái thường được khảo sát gồm màu sắc, hình dạng
khuấn lạc, trạng thái nhuộm Gram, cách sắp xếp, hình dạng và kích thước tế
bào. Ngoài ra, số lượng và cách sắp xếp roi trên tế bào cũng có vai trò trong
định danh vi khuấn acetic.

b. Đặc điếm sinh thái
Đặc điếm phân bố của vi khuấn acetic thường gắn liền với các nguồn
dinh dưỡng chứa đường hay alcohol như các loại hoa, quả, bia, rượu và các
nơi sản xuất giấm. Tuy nhiên trong một số trường hợp, đặc điểm sinh thái
được đánh giá là đặc điểm điển hình của giống hay loài. Cụ thể như
Acidomonas chỉ có thể phân lập được trong bùn hoạt tính có methanol;
Granulỉbacter được tìm thấy trong cơ thế người bị u hạch; một số loài có khả
năng cố định đạm thuộc hai giống Acetobacter và Gỉuconacetobacter sống
cộng sinh trong rễ cây họ đậu.


11

c. Đặc điếm sinh lý, sinh hóa
Các đơn vị phân loại thuộc nhóm vi khuẩn sinh acetic acid đuợc phân
biệt bởi các đặc điểm sinh lý, sinh hóa sau: Oxy hóa acetate tạo C02 và H2Ơ;
phát triến ở các khoảng nhiệt độ, áp suất thấm thấu và pH khác nhau; phát
triển sinh khối trong các môi truờng chứa D- glucose 30%; acetic acid 0,35%;
KNƠ3 1%; methanol; glutamate và malnitol; sinh acetic acid tù’ ethanol; tạo
sắc tố hòa tan trong nước; đồng hóa ammonia trong môi trường chứa Dglucose, D-malnitol hay ethanol; tạo dyhidroxyaceton từ glcerol; phát triển
trong môi trường không có nicotinic acid; phát triển sinh khối và tạo acid

khuấn, cầu khuấn không tạo bào tử và hầu hết không di động, hô hấp tùy tiện.
Chúng có khả năng lên men nhiều loại đường đơn và đường đôi nhưng không
có khả năng lên men các loại glucid phức tạp và tinh bột. Sự phát triến của nó
cần có sự có mặt của pepton, acid amin hay muối amon. Chúng có yêu cầu
đặc biệt về chất dinh dưỡng là giàu vitamin, acid amin và khoáng chất. Quá
trình lên men xảy ra tốt nhất trong môi trường acid pH từ 5,5 -ĩ- 6. Nhiệt độ
thích hợp cho quá trình lên men từ 15 -ỉ- 50°c. Tuy nhiên, mỗi loài có khoảng
nhiệt độ thích hợp khác nhau, nếu nhiệt độ lớn hơn 80°c vi khuẩn lactic bị
tiêu diệt hoàn toàn.

1.1.4.

Cơ sở khoa học của quá trình lên men kombucha

Theo kết quả nghiên cứu về thành phần cấu tạo của kombucha thì quá
trình lên men dịch trà có thể xảy ra các quá trình sau:
* Lên men ethanol


13

ị

Glucose

Glucose — 6 — phosphat
ị Photphoglucoza
isomeraza
Fructose — 6 — phosphat
I izomeraza


Ethanol
C2H5
OH

CH3COOH ị

„ CH3COOH
14
15

o2 -

môi

Tế bào
Mòi trường
CH3CH0
+ vào
H20trong->tế bào
CH3CH(OH)2
(Hydratđượcacetaldehyde)
khi được
vận chuyển
chất, đường hexose
chuyển hóa
CH3CH(OH)2
02 CH3COOH
+ H20acid pyruvic. Tiếp theo acid pyruvic
theo chu


Phưong trình tống quát của quá trình lên men trong môi trường pH
7
^
02
2HjO
C6H1206 + 2ADP +2Pi 2C2H5OH + 2C02 + 2ATP
Sự chuyến hóa đưòng hexose thành ethanol và khí C02 diễn ra trong tế

bào chất của nấm men. Đây là quá trình trao đồi năng lượng của nấm men
trong điều kiện kỵ khí. Ethanol và C02 trong tế bào chất sẽ được nấm men
thải vào môi trường lên men. Ngoài ra tế bào nấm men còn tổng hợp và thải
vào dịch lên men hàng trăm sản phấm phụ và sản phấm lên men khác, những
họp chất này được tìm thấy với hàm lượng rất nhỏ, chúng được chia thành 4
nhóm: glyxerol cùng rượu bậc cao, aldehyde, acid hữu cơ và este. Trong quá
trình lên men ethanol, nhiều acid hũư cơ được tạo thành (The Moll, 1990).
Một số acid hữu cơ được sinh tống hợp từ chu trình Krebs, nếu như quá trình
lên men không diễn ra trong điều kiện kỵ khí nghiêm ngặt, các acid hữu cơ
chiếm hàm lượng cao nhất trong dịch lên men là: acid citric, malic, acetic,
lactic...
* Lên men acetic:
Lên men acid acetic là quá trình oxy hóa rượu thành acid acetic dưới
tác dụng của vi khuẩn.
C2H5OH + o2

CH3CHO (Acetaldehyde) + H20


Thành phần



0,065
g/1
Bảng
Thành
kombucha
biến đối
hóa1.1.lý
khác. phần
Bản hóa
chấthọc
là trà
quá
trình chuyến hóa đường thành acid
Vitamin BI
0,74
g/1
lactic nhờ vi sinh vật.
Vitamin B6
0,52
g/1
Phương trình phản ứng:
Vitamin B12
0,84
g/1
C6H1206
CH3CHOHCOOH
+
94kcal
Vitamin c

cứu qua
trong
suốt
phấm phụ đã
tạođược
thànhnghiên
hoàn toàn
phụ nhiều
thuộc tài
vàoliệu
giống
vi sinh
thế
trà dinh
kombucha
(trà kiện
kvass)ngoại
và dạng
vật, kỷ
vàoqua.
môiDạng
trường
dưỡng lỏng
và điều
cảnh,đặc
nói (zoogloea)
chung thì cũng
acid
được
và kết

và phần
đã được
sử dụng
chodụng
mục của
đíchkombucha
điều trị trong thuốc thú y
Thành
hóa học
và công
* Lên men lactic:
và thuốc
Đầu
thếuống
kỷ XX,
những
nghiên
y học của
Đâycholà người.
một loại
thức
đượcchủ
lên yếu
menlàtrong
dung
dịch cứu
trà đường
bởi
Lên men
lactic

trong
trình
chuyển
hóa
cơ dễ
chất
được
vilên
khuẩn
giữ
lại
hưởng
tốt dụng
đến
năng
nói
chung
co thế,
nhưng
cũng
cómen
hiệu
không
sử
được
tràquá
thảo
mộc
vì của
kombucha

tinh
Loạitrường
trà cho
như
Earl
Grey
cóđối
chứa
dầu
thơm
Bergamot,
có sinh
thể
vấn
đề
túi các
mật,sản
tiểu
đường,
cholesterol,
cao xấu.
huyết
xơkhuấn
cứng
động
vật. Ngược
lại,
như
ethanol,
co được

môi
gần
giữa
thập
kỷ,làm
giám
“Họctrường
viện vàhóa
(“Academy of
ỉ.
1.5.1.Vào
Thành
phân
hóa
học
của
kombucha
trường
lên
men
ngày
càng
tăng,
giảmđốc
pH môi
kéohọc”
theo những
Chemists”)
Braunschweig
cấpand