Hội thảo Quốc gia về Khoa học Cây trồng lần thứ nhất
839
NGHIÊN CỨU XÂY DỰNG VÀ PHÁT TRIỂN QUY TRÌNH
SẢN XUẤT GIỐNG MÍA SẠCH BỆNH THEO QUY MÔ CÔNG NGHIỆP
BẰNG CÔNG NGHỆ TẾ BÀO
TS. Hà Thị Thuý, ThS. Trần Thị Hạnh,
Vũ Anh Tuấn, GS.TS. Đỗ Năng Vịnh
Viện Di truyền Nông nghiệp
SUMMARY
Study on building and development of disease-free sugarcane propagation
processes by industrial methods using plant cell technology
Standardization of protocol for micropropagation of sugarcane was established through in vitro
culture using young meristem of sugarcane as an explant. The multiple shoot regenration at various
frequencies was observed by using different concentrations and combination of growth regulators. The
highest percentage of callus induction was observed in MS medium supplemented with 3mg/l 2,4D. The
best response in term of multiple shoot induction was observed on MS medium with BAP 1.5mg/l +
Kinetin 0.2mg/l + 15% coconut milk. MS medium containing 0.5mg/l NAA showed nearly 100% rooting
response of in vitro regenrated shoots within two week of inoculated. Best hardening response was
obtained in Sand + Soil humus + husk burn + ¼ biofertilizer.
Keywords: callus in vitro culture, new sugarcane cultivars, micropropagation sugarcane
I. ĐẶT VẤN ĐỀ
*

Tổng sản lượng mía cây trên toàn thế giới
năm 2008 là 1.743.092.995 tấn. Mười nước sản
xuất mía lớn nhất thế giới theo thứ tự là Brasil,
Ấn Độ, Trung Quốc, Thái Lan,
Mexico, Colombia, Australia, Argentina và Mỹ,
trong
đó, Brasil sản xuất 648.921.280 tấn, Ấn Độ
sản xuất 348.187.900 tấn; TQ sản xuất

2 phương thức cấy mô: Nuôi cấy đỉnh sinh
trưởng và tái sinh phôi vô tính từ tế bào mô sẹo
phiến lá non. Cây con tạo được đồng nhất về di
truyền và rất ít khi bị biến dị trừ trường hợp nuôi
cấy quá dài hoặc xử lý đột biến in vitro
(Tay
lor,1993; Kale
et al., 2004).
Ngày nay, kỹ thuật nuôi cấy chồi đỉnh để tạo
giống mía sạch bệnh đã được sử dụng rộng rãi
trong công nghiệp mía đường để nhân nhanh
giống sạch bệnh với khả năng làm tăng năng suất
mía lên 20 - 30 % sau 3-4 vụ thu hoạch so với
giống mía nhân bằng phương pháp truyền thống
(Gosal
et al., 1998; Chattha et al., 2001; Cheema
and Hussain, 2004).
Tóm lại, công nghệ tế bào đã được khẳng
định là rất hiệu quả đối với công nghiệp mía
đường trên toàn cầu. Mục tiêu ứng dụng của công
nghệ tế bào mía bao gồm:
- Loại trừ bệnh và nhân nhanh các giống mía
sạch bệnh
- Làm trẻ hóa và tăng năng suất giống, chống
thoái hóa do lão hóa sinh lý trong quá trình nhân
vô tính
VIỆN KHOA HỌC NÔNG NGHIỆP VIỆT NAM
840
- Rút ngắn quá trình tạo giống và đẩy mạnh
thương mại hóa giống mới, nhanh chóng thay

khu trú ở một số địa phương.
Viện Di truyền nông n
ghiệp đã triển khai
nghiên cứu ứng dụng công nghệ nuôi cấy mô
phục vụ Chương trình mía đường từ rất sớm.
Viện đã công bố nhiều công trình nghiên cứu có
liên quan đến các khía cạnh khác nhau của công
nghệ nhân giống mía (Hà Thị Thúy và Cs,1998;
1999; 2000
a
).
II. VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
2.1. Vật liệu
- Các giống sản xuất đại trà ở khu vực miền
Bắc: QĐ11, QĐ15, QĐ17, QĐ 93-159, My55-14,
VĐ55, VĐ79-177, ROC16, ROC10, ROC22
- Các giống mới nhập nội.
2.2. Phương pháp nghiên cứu
- Phương pháp chọn giống ưu tú phục vụ
nhân nhanh thông qua các giống về năng suất, trữ
đường, khả năng thích ứng, mùa vụ thu hoạch,
vùng thích nghi, phản ứng sâu bệnh.
- Phương pháp chọn cá thể trội để nhân
nhanh: cao cây, dài lóng, đường kính thân,
khối lượng cây, số cây hữu hiệu/khóm, mức
độ sâu bệnh
- Phương pháp làm sạch bệnh và phục tráng
giống thông qua nuôi cấy đỉnh sinh trưởng chồi
ngọn và chồi nách.
- Phương pháp chẩn đoán bệnh bằng E

Kết quả điều tra đánh giá và chọn lọc các
giống tại một số khu vực trồng mía chính ở miền
Bắc chúng tôi nhận thấy, tại Nghệ An các giống
mía chủ yếu đang trồng là ROC10, My5514,
QĐ11, ROC16, VN84-4137, F156, trong đó các
giống ROC10, My5514 chiếm tỷ lệ đáng kể
(71,17%). Việc nghiên cứu phục tráng các giống
này là cần thiết. Tại Hòa Bình, chúng tôi đã xác
định được các giống mía HB1 (ROC23), HB2,
HB3 có năng suất cao, đạt năng suất trên 100 tấn
đến 170 tấn/
ha. Tại Thanh Hóa các giống trồng
Hội thảo Quốc gia về Khoa học Cây trồng lần thứ nhất
841
chủ yếu là QĐ 93-159, My55-14, VĐ55, VĐ79-
177, ROC10, QĐ 94, VL6, VĐ 00236, trong đó
giống ROC 10 vốn rất được ưa thích vì năng suất
cao trên 100 tấn/ha nhưng hiện tại được trồng với
diện tích ít do giống bị thoái hóa cây nhỏ, năng
suất thấp.
Từ các bộ giống đang được trồng đại trà ở các
vùng nguyên liệu mía này chúng tôi tiến hành
chọn các cá thể tốt, ưu việt trong quần thể để thu

thập, lấy mẫu đưa vào ống nghiệm. Danh sách các
giống được lấy mẫu đưa vào ống nghiệm gồm:
My5514; ROC 10; HB1 (ROC23); HB2; HB3;
QĐ 93-159; QĐ 94; VĐ 79; VĐ 55; VĐ 00326.
Ngoài thu thập các giống đang sản xuất đại trà
đề tài còn tiến hành thu thập thêm các giống mía

Sau đó tách lấy phần chồi nách, chồi đỉnh hoặc
lá non trắng nõn nằm sát đỉnh sinh trưởng làm vật
liệu nuôi cấy. Đối với cây mía, mắt mía non (chồi
ngủ) và chồi đỉnh thường được bao bọc trong nhiều
lớp bẹ lá, do vậy rất sạch
. Dựa vào những đặc tính
cơ bản đó mà chúng tôi đưa mẫu vào ống nghiệm
mà không sử dụng hoá chất khử trùng.
Kích thước mẫu nuôi cấy như sau:
- Chồi nách: Đường kính 1,0cm
 1,0cm.
- Chồi đỉnh: Bóc bỏ lá non, lấy chồi non
đường kính 1,5cm
 1,5cm.
3.2.1.2. Môi trường nuôi cấy
Môi trường cơ bản (MS): Muối đa lượng, vi
lượng, vitamin, axit amin theo Murashige and
Skoog (Murashige and Skoog, 1962).
Môi trường MS cải tiến (Modified MS -
mMS): Như MS (1962) nhưng tăng nồng độ
B1 lên: 1,0 mg/l + 30g/l đường + 6,0 g/l
thạch, pH = 5,8.
Môi trường tạo chồi cấp I: Môi trường mMS
+ 0,5mg/l BAP, pH = 5,8.
Môi trường nhân chồi: Môi trường giống
như môi trường tạo chồi cấp I, riêng nồng độ
BAP, Kinetin, nước dừa có sự thay đổi tuỳ theo
mục đích thí nghiệm.
3.2.1.3. Phản ứng của các giống mía khác
nhau trên môi trường khởi tạo

do các hợp chất phenolic.
VIỆN KHOA HỌC NÔNG NGHIỆP VIỆT NAM
842
Hiện tượng này là đặc điểm khá đặc thù ở
các giống và biểu hiện rõ nhất ở nhóm giống
QĐ 93-159, QĐ 94, chồi tiết ra các hợp chất
phenolic và các sản phẩm thứ cấp làm đen môi
trường. Phenol tiết ra bao bọc xung quanh chồi,
kìm hãm tế bào sinh sản và sinh trưởng. Chúng
tôi đã thử nhiều tổ hợp các môi trường khác
nhau, bổ sung thêm than hoạt tính vào môi
trường nuôi cấy và các chất chống oxy hoá như
axit ascorbic, antioxidant, để khử hiện tượng đen
do các hợp chất chứa phenol tiết ra. Kết quả cho
thấy p
hương pháp tốt nhất để loại trừ các hợp
chất chứa phenol vẫn là cấy chuyển thường
xuyên sang môi trường mới. Chồi đỉnh sau khi
cấy 1 tuần, tách bỏ phần mô và tế bào bị đen, rồi
chuyển chồi sang môi trường mới để loại trừ tác
dụng của các hợp chất phenolic. Heinz và cộng

sự (1997) cũng đã khắc phục hiện tượng hoá đen
bằng biện pháp tương tự.
So sánh khả năng tái sinh của hai loại chồi
khác nhau cho thấy ban đầu chồi nách có khả
năng tạo chồi phụ sớm hơn so với chồi đỉnh.
Nhưng đến tuần thứ 3, ở một số giống, tỷ lệ bật
chồi phụ của các chồi đỉnh lại vượt lên so với
chồi nách và đạt tỷ lệ 1

Embryogenic mô sẹo thường xốp, tế bào to và dài.
* Môi trường thí nghiệm:
- Môi trường tạo mô sẹo: Môi trường MS +
15% nước dừa + (0-5 mg/l) 2,4D thay đổi (0;
0,5mg/l; 1mg/l; 2mg/l; 3mg/l; 4mg/l; 5mg/l),
pH = 5,8.
- Môi trường nhân mô sẹo: Môi trường MS +
2,4D hàm lượng thấp hơn so với môi trường tạo
mô sẹo (0,5 - 1,5mg/l) + đường (20 - 30 g/l) +
15% nước dừa, pH = 5,8.
- Môi trường tái sinh (tạo chồi) từ mô sẹo:
Môi trường MS + (0 - 2,5mg/lBAP + 0,2
Kinetine + 15% nước dừa , pH = 5,8.
* Nghiên cứu ảnh hưởng của 2,4-D ở các
nồng độ khác nhau kết hợp với 0,1 mg/l IBA lên
quá trình phát sinh mô sẹo
Lát cắt lá non sau khi cắt thành từng
miếng vuông 0,5cm × 0,5cm cấy
vào môi trường:
mMS có bổ sung 2,4 -D với nồng độ thay đổi (0 -
5) mg/l. Mẫu lá đặt trên mặt thạch và nuôi trong
điều kiện tối để tạo mô sẹo. Kết quả nghiên cứu
được theo dõi sau 4 tuần, 8 tuần.
Bảng 1. Ảnh hưởng của 2,4 -D lên quá trình phát sinh mô sẹo ở hai giống mía ROC26 và HB1
(tính theo tỷ lệ %)
Sau 4 tuần nuôi cấy Sau 8 tuần nuôi cấy
MT
Nồng độ 2,4D
(mg/l)
Số mẫu cấy

số mô sẹo bị chết đen trong môi trường.
Các mô sẹo hình thành trên các môi trường
này hầu hết là mô sẹo dạng cứng sau khi nuôi cấy
khoảng 8 tuần đa số các mô sẹo tái sinh thành cây.
Chúng tôi tiến hành thử nuôi cấy nuôi cấy
mẫu lá trên các môi trường có 2,4D có bổ sung
một số chất phụ gia khác như Malt extract hoặc
thay đổi agar bằng
chất nền khác như phytagel.
Kết quả quan sát bước đầu chúng tôi nhận thấy
các mô sẹo hình thành có dạng khối hạt tròn
trắng dạng mô sẹo phôi hóa. Các kết quả nghiên
cứu đang được tiếp tục theo dõi và nghiên cứu.
3.3. Tái sinh chồi, nhân nhanh chồi mía và tạo
cây hoàn chỉnh in vitro
3.3.1. Nghiên cứu tái sinh và nhân nhanh chồi
mía in vitro
BAP đã được xác định là có vai trò rất lớn
trong quá trình tái sinh chồi của mía (Hà Thị
Thúy
và cs., 2000). Tuy nhiên đối với các giống
khác nhau, tác động của BAP có sự khác nhau.
Davenpoort và cộng sự đã chứng minh được khi
thí nghiệm Kinetin trên các loại thực vật khác
nhau thì đều cho kết quả tái sinh chồi tốt hơn ở
nồng độ 0,2 mg/l MT. Do vậy chúng tôi quyết
định nghiên cứu thí nghiệm với nồng độ Kinetin
không thay đổi trong suốt quá trình thí nghiệm là
0,2mg/l MT, BAP thay đổi nồng độ từ 0 -
2,5mg/l MT.

mg/l thi chúng tôi nhận thấy ảnh hưởng của BAP
lên hệ số nhân chồi là tương đối rõ rệt. Hệ số
nhân tăng lên trung bình là 4,5 ở giống ROC26
và 5,4 ở giống
BH1.
Nồng độ của BAP lên tới 1,5 mg/l MT cho
hệ số nhân chồi cao nhất đạt 6,5 ở giống ROC26
và 6,7 ở giống HB1, chất lượng chồi cũng rất tốt,
chồi mập, xanh hơn và có chiều cao 5 - 8cm. Một
ưu điểm nữa của vi nhân giống mía in vitro là
cho hệ số nhân khá cao, điều này có ý nghĩa rất
lớn trong việc tạo ra được hàng loạt các cây có
đặc điểm
sinh trưởng, phát triển giống nhau.
Tuy nhiên khi tăng nồng độ BAP từ 2mg/l
MT đến 2,5 mg/l MT hệ số nhân chồi lại không
tăng mà giảm xuống chỉ còn trung bình là 4,3 ở
giống ROC26 và 5,5 ở giống BH1. Nguyên nhân
của hiện tượng này là do nồng độ BAP cao đã
làm ức chế tới khả năng nhân chồi của hai giống
VIỆN KHOA HỌC NÔNG NGHIỆP VIỆT NAM
844
mía. Nồng độ BAP cao còn làm cho cụm chồi
của hai giống mía có các biểu hiện như sùi to và
không rõ chồi non.
Vì vậy với nồng độ BAP là 1,5 kết hợp với
0,2mg/l MT Kinetin thì cho hệ số nhân chồi cao
nhất đạt 6,5 với giống ROC26 và 6,7 với giống
BH1.
Ngoài sự ảnh hưởng của các chất điều hòa

Để cây có thể đưa ra ngoài đồng ruộng trồng
được nhanh thích ứng với môi trường mới thì cây
phải đảm bảo bộ rễ hoàn chỉnh. Trong số các chất
điều hóa kích thích sinh trưởng NAA được biết
đến là chất kích thích sự hình thành rễ. Tuy nhiên
các chồi mía sau khi đã nhân nhanh với chất kích
thích sinh trưởng BAP rất khó ra rễ do BAP kìm
hãm quá trình hình thành rễ của cây. Do đó trước
khi ra rễ chúng tôi nuôi cấy mía trên môi trường
tiền ra rễ: MS + 15% nước dừa + 3% đường +
0,6g/l Agar. Môi trường này
không bổ sung BAP
có tác dụng kéo dài chồi đồng thời loại bỏ lượng
BAP còn dư tích lũy bên trong và bám trên thân
cây (Hà Thị Thúy, Lê Huy Hàm, Đỗ Năng Vịnh
và cs, 1988). Sau đó các chồi được tách rời và
cấy vào môi trường thí nghiệm: MS + 15% nước
dừa + 6% đường + (0 - 1,5)mg/l NAA không bổ
sung agar. Việc sử dụng NAA cho việc tạo rễ với
nồng độ quá cao hay quá thấp thì bộ rễ không đủ
để đảm bảo cho cây phát triển bình thường. Để
xác định được nồng độ thích hợp của NAA
bổ
sung vào môi trường chúng tôi tiến hành nghiên
cứu ảnh hưởng của NAA đến quá trình hình
thành rễ của hai giống mía ROC26 và BH1.
Bảng 3. Nghiên cứu ảnh hưởng của nồng độ NAA đến quá trình hình thành rễ sau 2 tuần nuôi cấy
(tính theo tỷ lệ %)
ROC26 ROC26
Nồng độ

rễ ra trên 1 cây là ít, chiều dài rễ ngắn, rễ gầy
Khi bổ sung NAA với nồng độ bằng 0,5 mg/l thì
tỷ lệ % tạo rễ của cả ha
i giống là cao nhất. 94,5%
ở giống ROC26 và 97,3% ở giống BH1. Với nồng
độ này thì gần như toàn bộ cây đưa vào đều có bộ
rễ hoàn chỉnh, chiều dài rễ đạt trung bình 3cm, số
lá/cây trung bình đạt 4 lá/cây. Tiếp tục tăng nồng
độ của NAA lên từ 1,0 mg/l đến 1,5 mg/l thì tỷ lệ
mọc rễ vẫn tương đối cao nhưng không cao hơn ở
nồng độ NAA bằng 0,5mg/l. Do vậy, việc bổ sung
thêm NAA vừa tốn hó
a chất mà còn gây ức chế lại
quá trình ra rễ.
Vậy nồng độ NAA thích hợp nhất cho quá
trình hình thành rễ là 0,5mg/l khi đó tỷ lệ rễ tạo
thành là 94,5% ở giống ROC26 và 97,3% ở
giống BH1.
Hội thảo Quốc gia về Khoa học Cây trồng lần thứ nhất
845
3.4. Nghiên cứu hoàn thiện công nghệ vườn
ươm đối với các cây cấy mô
Cây sau khi đã phát triển hoàn thiện đạt các
chỉ tiêu về số lượng lá, rễ, chiều cao thì được
chuyển ra vườn ươm trước khi đưa cây ra trồng
đồng loạt ngoài đồng ruộng. Chất nền là yếu tố
quyết định sự sống sót của cây khi đưa cây ra
vườn ươm. Chúng tôi tiến hành nghiên cứu tìm
hiểu ảnh hưởng của các giá thể khác nhau đối với
ra cây trên vườn ươm.

Kết quả thu được cho thấy công thức V là tốt
nhất. Thời gian đầu tỷ lệ cây sống sót 96% nhưng
số cây trên khóm còn ít (5 cây/khóm), tuy nhiên
sau khi ra ngôi 30 ngày cây vươn nhanh đồng
thời đẻ nhánh, đạt 9 cây/khóm, chiều cao cây đạt
5cm, có 4 lá/cây.
IV. KẾT LUẬN
Đề tài mới bắt đầu triển khai nghiên cứu từ
cuối năm 2011 do vậy mới chỉ thu được một số
kết quả nghiên cứu ban đầu.
1. Đề tài đã tiến hành đánh giá và thu thập
được 10 giống đang được trồng đại trà ở các
vùng nguyên liệu mía của miền Bắc: My5514;
ROC 10; HB1 (ROC23); HB2 (); HB3 (); QĐ 93-
159; QĐ 94; VĐ 79; VĐ 55; VĐ 00326.
- Đề tài thu thập được 3 giống của Brazil:
Brazil 7515 (Br7515); Brazil 2 (Br2); Brazil 3280
(Br3280), 3 giống của Trung Quốc: Quảng Tâ
y
02-208; Quảng Tây 60; Liễu Thành 03-1137.
2. Kết quả nghiên cứu tạo vật liệu sạch bệnh
bằng nuôi cấy đỉnh sinh trưởng và mô sẹo phôi
hóa ở các giống mía nghiên cứu: đã nuôi cấy đỉnh
sinh trưởng thành công ở các giống My5514;
ROC 10; HB1 (ROC23); HB2 (Viên Lâm 6);
HB3 (); QĐ 93-159; QĐ 94; Brazil 7515
(Br7515); Brazil 2 (Br2); Brazil 3280 (Br3280).
- Tỷ lệ mô sẹo tạo thành cao nhất trên môi
trường có 2,4D ở nồng độ 3mg/l đạt tới 86,6%
sau 8 tuần nuôi cấy ở giống HB1 và 63,1% ở

Nông nghiệp &
CNTP, số 9, 418.
4. Hà Thị Thúy, Lê Huy Hàm, Đỗ Năng Vịnh (2000).
Nghiên cứu nhân nhanh một số giống mía mới bằng
nuôi cấy mô callus lá non, Tạp chí Nông nghiệp &
CNTP, số 10. 456.
5. Hà Thị Thúy, Lê Huy Hàm, Đỗ Năng Vịnh (2000).
Nghiên cứu phản ứng của các giống mía trong điều
kiện nuôi cấy mô và bảo quản tập đoàn quỹ gen in
vitro. Tạp chí Nông nghiệp & CNTP. 8. 341-342.
6. Hà Thị Thúy, Lê Huy Hàm, Đỗ Năng Vịnh (1999).
Nhân nhanh các giống mía cao sản bằng cô
ng nghệ
vi nhân giống in vitro. Kỷ yếu Hội nghị CNSH toàn
quốc. 1080. 1999.
VIỆN KHOA HỌC NÔNG NGHIỆP VIỆT NAM
846
7. Ahloowalia, B. S. and A. Maretzki (1983). Plant
regenration via somatic embryogensis in sugarcane.
Pl- ant Cell Reports, 2: 21—25.
8. Chattha, M.A., M.I. Imran, A. Abida, I. Muhammad
and A. Akhtar (2001). Micropropagation of sugarcane
(Saccharum sp.) Pakistan Sugar J. 16: 2-6
9. Cheema KL and Hussain M (2004).
Micropropagation of sugarcane through apical bud
and axillary bud. Int. J. Agric. Biol. 2: 257-259.
10. FAO: Food And Agricultural Organization of
United Nati
ons: Economic And Social Department:
The Statistical Division

Bud and Axillary Bud. INTERNATIONAL
JOURNAL OF AGRICULTURE & BIOLOGY. 06.
2; 257-259
18. Kale VP, Bruno TV, Bhagade SV (2004). Studies on
callus initiation and plantlet regenration in sugarcane
(Saccharum spp.) Indian J. Genet, 64(20); 165-166.
19. Lal, J., H.P. Pande, S. Kawasthi (1996). A genral
micropropagation protocol for sugarcane varieties.
New Botanist, 23: 1-19
20. Li Yang - Rui and Yuan- An Wei (2006). Sugar
Industry in China : R & D and Policy Initiatives to
Meet Sugar and Biofuel Demand of Future.
SugarTech, 8(04), 2 006) : 203-216
21. Lorenzo JC, Ojeda E, Espinosa A, Borroto C (2001).
Field performance of temporary immersion
bioreactor derived sugarcane plantys. In vitro cell
Dev. Biol., Plant, 37: 803-806.
22. Murashige, T. and F. Skoog (1962). A revised
medium for rapid growth and bioassay with tobacco
cultures. Physiol. Plant. 15: 473-97
23. Taylor PWJ, Dukie S (1993). Development of an in
vitro culture technique for conservation of Saccharum
Sp. Plant cell Tissue Organ Cult. 34: 217-222.
MỘT SỐ HÌNH ẢNH VỀ KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU Hội thảo Quốc gia về Khoa học Cây trồng lần thứ nhất
847