Hội thảo Quốc gia về Khoa học Cây trồng lần thứ nhất
251
ỨNG DỤNG CÔNG NGHỆ SINH HỌC TRONG XÁC ĐỊNH
TÍNH ĐỒNG NHẤT, TÍNH KHÁC BIỆT VÀ TÍNH ỔN ĐỊNH
CỦA LÚA PHỤC VỤ CHO KHẢO NGHIỆM DUS
Lưu Minh Cúc, Lưu Thị Ngọc Huyền,
Lê Huy Hàm
Viện Di truyền Nông nghiệp

SUMMARY
(Application of biotechnology in identifying the distinctness, uniformity,
stability of rice varieties to aid for DUS testing)
This study aimed at developing procedures for identifying the distinctness, uniformity, stability of
rice varieties to aid for DUS testing. The collection of 261 lines/varieties, which are abundant about
sources, desease resistance, tolerance to biotic and abiotic stresses, were used in screening. Using the
information from published data about DUS testing on rice in country around the world like China, Brazil,
India , walk along 12 rice chromosomes, 557 markers were selected. The use of those markers to
screen with the large numbers of rice varieties were carried out. A strategy of upside down conical in
many steps of screening was applied. At last, a reference set of DNA markers were selected. This set was
including 30 markers. Procedures for identifying the distinctness, uniformity, stability of rice varieties to
aid for DUS testing were developed. These procedures are tightly suitable to current DUS testing
regulations. In addtion, a software namely DUS-DFP, with the DNA fingerprint data of 180 rice varieties
base on 30 reference markers, was developed for applying all the results of this study in DUS testing
purpose.
Keywords: biotechnology, distinctness, uniformity, stability, DUS testing, rice.

I. ĐẶT VẤN ĐỀ
*

Theo tiêu chuẩn của Hiệp hội Quốc tế về
Bảo vệ Giống cây trồng mới (International

chọn tạo ra những giống cây trồng mới mà còn
giúp phân biệt các đặc điểm di truyền của các bộ
giống
mới được chọn tạo hoặc giống nhập nội.
Cho đến nay, nhiều nước trên thế giới sử dụng
hệ thống khảo nghiệm DUS dựa trên cơ sở các
đặc điểm hình thái và hóa sinh. Tuy nhiên, một
số quốc gia đã bắt đầu áp dụng phương pháp
ADN dùng cho khảo nghiệm DUS (Navraj và
cs., 2009). Đối với công tác khảo nghiệm DUS
ở nước ta, việc xây dựng một qui trình giám
định giống c
hính xác ở mức độ phân tử là một
việc làm hết sức cần thiết. Góp phần vào công
tác khảo nghiệm DUS giống lúa nhằm xác định
tính đúng giống, cũng như để tránh khỏi những
tranh cãi, đồng thời bảo hộ bản quyền tác giả,
chúng tôi đã tiến hành nghiên cứu ứng dụng
công nghệ sinh học trong xác định tính đồng
nhất, tính ổn định và tính khác biệt của lúa phục
vụ cho khảo ng
hiệm DUS.
VIỆN KHOA HỌC NÔNG NGHIỆP VIỆT NAM
252
II. VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
2.1. Vật liệu
- Tập đoàn 261 giống lúa thu thập
- 40 giống lúa để đánh giá DUS
- 180 giống lúa để lập cơ sở dữ liệu
- 19 giống lúa điển hình của Trung tâm Khảo

Đề tài đã thu thập được tập đoàn 261
dòng/giống lúa để sử dụng trong đề tài nhằm
sàng lọc tìm kiếm các alen có thể có trên các
giống lúa đối với các chỉ thị được sử dụng trong
nghiên cứu.
Bước đầu tiên, nghiên cứu tiến hành khảo sát
261 giống lúa thu thập từ nhiều nguồn khác nhau
đối với 100 chỉ thị gồm
81 chỉ thị SSR rải rác
trên 12 NST có số lượng từ 3-8 alen và 19 chỉ thị
thiết kế khi nghiên cứu vùng bảo thủ của các
promoter tập trung vào các cis-element hay chính
là trình tự điều khiển để nhân tố phiên mã bám
vào và điều hòa biểu hiện gene và các EST ở lúa.
Mở rộng phạm vi tìm kiếm, bước tiếp theo
được tiến hành với 152 chỉ thị InDel marker
được thiết kế dựa trên sự so sánh trình tự hệ gen

của giống lúa Indica 93-11 và giống lúa Japonica
Nipponbare, có thể xác định được sự đa hình từ
các đột biến thêm/bớt (insertion/delection) trong
hệ gen lúa. Đây chính là những chỉ thị đa hình
cao và hoạt động tốt được sàng lọc từ 756 chỉ thị
STS nằm trên toàn bộ hệ gen lúa với khoảng cách
2-3 cM/chỉ thị phân bố tương đối đều trên 12
NST của lúa. Sản phẩm nhân bản của đoạn ADN

từ các chỉ thị này có thể chứa ít nhất 5% đoạn
chèn-xóa khác nhau của kích thước các băng
nhận được (trong khoảng từ 100-400bp). Những


xác định cá thể phải thoả mãn được một số yêu
cầu nhất định. Thứ nhất, các locus SSR đó phải
có mức độ đa hình cao (nhiều alen), điều này
giúp các nhà phân tích chỉ cần sử dụng số lượng
locus tối thiểu đã đạt được độ tin cậy cao trong
mỗi lần giám định. Thứ hai, các locus SSR đó
phải có độ dài trung bình từ 85 - 400 bp, để có
thể dễ dàng thực hiện phản ứng PCR và thao tác
nhuộm
phát hiện băng ADN trên gel
Hội thảo Quốc gia về Khoa học Cây trồng lần thứ nhất
253
polyacrylamide. Thứ ba, các locus SSR được sử
dụng để phân tích phải nằm trên các NST khác
nhau để đảm bảo cho tính độc lập của từng locus.
Thứ tư, các locus SSR nằm trên những vùng liên
quan đến hoạt động sống của cơ thể. Thứ năm,
các chỉ thị cho kết quả tốt, rõ nét, thuận lợi cho
sử dụng, dễ phân biệt trên gel polyacrylamide.
Bộ chỉ thị tham chiếu được chọn lựa khi hội tụ
đầy đủ các đặc điểm n
hư yêu cầu ở trên.
Cơ sở khoa học để tính toán sự khác biệt
trong việc xác định số lượng và chỉ thị cho bộ chỉ
thị tham chiếu: Mỗi kiểu gen (genotype) cây nhị
bội mang 2 alen đối với từng locus. Giả sử tần
suất xuất hiện tất cả các alen trong 1 quần thể
ngẫu nhiên là bằng nhau, đối với cây lúa là cây tự
thụ phấn (mỗi cặp al

13 RM333 10 6 170-175-178-180-189-200
14 RM3252 1 7 162-165-167-170-174-200-205
15 RM3843 4 4 165-170-175-182
16 RM7097 3 5 165-167-172-176-179
17 R4M13 4 4 172-188-200-218
18 MADS3 6 4 192-222-238-246
19 SO1160 1 4 170-175-187-210
20 S11033 11 6 162-165-170-175-178-180
C Bộ chỉ thị mở rộng: 10 chỉ thị
21 RM19 12 5 190-202-210-225-227
22 RM223 8 5 152-154-160-165-172
23 RM341 2 7 156-160-166-166-175-192-206
24 RM3486 5 6 215-221-225-230-250-253
25 RM5758 10 5 96-100-103-106-109
26 RM10825 1 4 82-87-92-100
27 RM17954 5 7 150-162-167-170-175-180-184-195-200
28 RM26063 11 6 112-122-130-134-138-143
29 MADS8 1 3 150-175-200
30 EST20 11 4 187-196-213-218
VIỆN KHOA HỌC NÔNG NGHIỆP VIỆT NAM
254
Tổng số các alen của chỉ thị tham chiếu
chính thức là 120 alen. Nếu sử dụng 20 chỉ thị
của bộ chỉ thị tham chiếu chính thức, ta sẽ phân
biệt được 1,32434  10
15
mẫu giống khác nhau
bởi ít nhất 1 cặp alen. Nếu tính thêm cả bộ chỉ thị
mở rộng ta sẽ có 172 alen, kích thước từ 80-253 bp.
Khi đó nếu sử dụng cả 30 chỉ thị trên thì sẽ phân

hợp với các tiêu chí của khảo nghiệm DUS bằng
hình thái và hóa sinh hiện hành, bao gồm đánh

giá tính đồng nhất, tính khác biệt và tính ổn định.
Đối với quy phạm khảo nghiệm DUS hiện hành,
phương pháp chủ yếu đánh giá tính đồng nhất
căn cứ vào tỷ lệ cây khác dạng của tất cả cây trên
ô thí nghiệm.
Căn cứ vào báo cáo kết quả khảo nghiệm
DUS tại Trung tâm Khảo Kiểm nghiệm, giống
khảo nghiệm được xem là đồng nhất nếu có từ 1-
3 cây khác dạng trong số 1000 cây
thí nghiệm.
Như vậy khi phân tích 300-500 cây của một
giống đối với bộ chỉ thị tham chiếu, nếu chỉ phát
hiện thấy từ 1-2 sự khác biệt về alen thì có nghĩa
là biến động về alen trong cùng một giống tương
đương với biến động kiểu hình.
Để kiểm chứng và hài hòa giữa phân tích
ADN và phân tích các tính trạng hình thái, chỉ
tiêu sinh hóa, trong quá trình lập quy trình, đề tài
đã tiến hành khảo sát các nhóm giống bao gồm:
nhóm giống có trên 3 cây khác dạng/
1000 cây,
nhóm giống có từ 2-3 cây khác dạng/1000 cây;
nhóm giống không có cây khác dạng nào.
Mỗi nhóm giống tiến hành phân tích sự khác
biệt về alen đối với các chỉ thị của bộ chỉ thị tham
chiếu. Khảo sát từ 2-5 giống trong mỗi nhóm,
mỗi giống phân tích 480 cây khác nhau để kiểm

cây trong đánh giá các tính trạng hình thái
Nếp Nhiệt đới 15
Nếp Lang Liêu 3
NH92 5
TB2 3
Thảo dược Vĩnh Hòa 2
Nhóm 3: Giống không có cây khác dạng/1000
cây trong đánh giá các tính trạng hình thái
RS 0
Hội thảo Quốc gia về Khoa học Cây trồng lần thứ nhất
255

Hình 1. Đánh giá các cây lúa của giống Nếp Nhiệt đới đối với chỉ thị RM3412, có 10 cây cho alen
khác biệt với những cây khác
A. Cây số 1-96; B. Cây số 97-192; C. Cây số 193-288; D. Cây số 289-384. E. Cây số 385-480.
Kết quả phân tích 480 cây của từng giống
trong nhóm giống có từ 2-3 cây khác dạng/1000
cây cho thấy có sự sai khác về alen của 10-15 cây
đối với 3-7 chỉ thị. Nhóm giống không có cây
khác dạng nào cũng vẫn có từ 1-5 cây có sự sai
khác về alen đối với 1-3 chỉ thị trong bộ chỉ thị
đem phân tích. Như vậy là biến động về alen chỉ
thị phân tử lớn hơn biến động kiểu hình của
giống. Điều
này có thể được giải thích như sau:
Các chỉ thị ADN là trung tính, không nhất thiết
liên quan đến biểu hiện kiểu hình, vì thế biến
động alen trong cùng 1 giống lớn hơn biến động
kiểu hình.
Từ những kết quả trên, để phù hợp với tiêu

Quy trình này áp dụng cho các giống lúa
thuần nhằm hỗ trợ cho công tác khảo nghiệm
DUS một cách chính
xác và hiệu quả hơn.
* Các bước của quy trình
Bước 1: Xác định độ đồng nhất của giống
1. Tách chiết ADN tổng số của 50 cây/giống
2. Làm phản ứng PCR với 5 chỉ thị của bộ
chỉ thị đánh giá sơ bộ RM11, RM21, RM163,
RM481, RM3412.
3. Điện di sản phẩm của phản ứng PCR trên
gel polyacrylamide 4,5% hoặc 6% - 10% với
ladder 25bp hoặc 50bp kèm theo
4. Ghi nhận kết quả.
5. Phân tích kết quả: Giống đồng
nhất khi
các cá thể có sự đồng nhất về alen đối với cả 5
chỉ thị nghiên cứu.
Bước 2. Kiểm tra độ khác biệt bên trong của
giống
1. Khi giống không đồng nhất về alen ở bước 1,
chia mẫu thành các nhóm có các thành phần alen
khác nhau.
VIỆN KHOA HỌC NÔNG NGHIỆP VIỆT NAM
256
2. Phân tích ADN của một mẫu đối với từng
nhóm, sử dụng 15 chỉ thị còn lại của bộ chỉ thị
tham chiếu (RM1, RM5, RM6, RM17, RM25,
RM206, RM215, RM333, RM3252, RM3843,
RM7097, R4M13, MADS3, SO1160, S11033).

5. Phân tích kết quả:
- So sánh thành phần alen của giống mới với
các giống đã có trong phần mềm DUS-DFP. Nếu
giống mới có nhận dạng ADN (DNA fingerprint)
không tương đồng với bất kỳ một giống nào đã
có trong thư viện quá 95%
có thể xem đó là
giống mới.
- Nếu giống có nhận dạng ADN tương đồng
với bất kỳ một giống nào đã có trong thư viện
quá 95% cần phải so sánh hai giống đó với nhau
sử dụng cả 30 chỉ thị của bộ chỉ thị chính thức và
mở rộng (RM19, RM223, RM341, RM3486,
RM5758, RM10825, RM17954, RM26063,
MADS8, EST20). Giống mới là giống có phổ
ADN khác hoàn toàn với các giống đã được lưu
giữ trong thư viện bởi í
t nhất một trong số các chỉ
thị của bộ chỉ thị tham chiếu chính thức và một
trong số các chỉ thị của bộ chỉ thị mở rộng.
Bước 5. Kết luận chung
Giống mới được công nhận khi đạt tất cả các
yêu cầu trong các bước kiểm tra nêu ở trên. Kết
luận cuối cùng phải đi kèm với kết quả đánh giá
so sánh về mặt hình thái (65 tính trạng)
theo quy
định của Nhà nước.
* Trường hợp đặc biệt:
A - Đánh giá từ 2 giống giống nhau về các
chỉ tiêu DUS hình thái

kiểu gen thông qua chỉ thị phân tử đặc thù cho
tính trạng mới.
5. Phân tích kết quả: Giống mới được công
nhận khi có sự khác biệt cả về kiểu gen lẫn kiểu
hình đối với tính trạng mới.
3.4. Lập ngân hàng dữ liệu cho các giống lúa
trồng phổ biến và giống địa phương
Phiên bản phần mềm DU
S-DFP để quản lý
ngân hàng dữ liệu sinh học phân tử và phân biệt
giống cây trồng dưới dạng ký hiệu hiển thị ở kích
thước alen đối với mỗi locus của chỉ thị/giống đã
Hội thảo Quốc gia về Khoa học Cây trồng lần thứ nhất
257
được xây dựng. Khi phân tích ADN của một
giống mới, dữ liệu về ADN truy vấn sẽ được
nhập vào thư viện cơ sở dữ liệu ADN đã lập sẵn
của 180 giống lúa với tất cả các chỉ thị trong bộ
chỉ thị tham chiếu có sẵn trong phần mềm DUS-
DFP. Phương pháp thống kê đa chiều sẽ được sử
dụng trong phần mềm để phân tích cho ra ma trận
khoảng cách di truyền hoặc độ tương đồng giữa
các giống.
Đề tài đã sử dụng bộ chỉ thị tham chiếu để
lập cơ sở dữ liệu của 180 giống lúa. Cơ sở dữ liệu
đã được ký hiệu hóa và nhập vào phần mềm
DUS-DFP để sử dụng.

Hình 2. Ảnh điện di trên gel polyacrylamide 8% của 48 giống lúa với locus RM6
(L): ladder chuẩn 25bp; trên ảnh là các băng tương ứng kích thước 150bp, 175bp và 200bp

(DNA fingerprinting), phân tích và hỗ trợ trong
khảo nghiệm DUS.
- Đã lập cơ sở dữ liệu của 180
giống lúa đối
với các chỉ thị của bộ chỉ thị tham chiếu.
4.2. Đề nghị
“Quy trình xác định giống lúa thuần bằng
sinh học phân tử hỗ trợ cho khảo nghiệm DUS”
với mục đích cung cấp phương tiện để phục vụ
cho công tác quản lý giống trong thực tại hiện
nay. Đề nghị đưa quy trình vào áp dụng như một
bước trong cho công tác khảo nghiệm giống lúa ở
Việt Nam.
TÀI LIỆU THAM KHẢO
1. Bonow S., Von Pinho E.V.R., Vieira M.G.C.,
Vosman B. (2009). Microsatellite markers in and
around rice genes: applications in variety
identification and DUS testing. Crop Sci., vol. 49,
pp.880-886.
2. Сиволап Ю.М., Волкодав В.В., Бальвинская
М.С., Кожухова Н.Е., Солоденко А.С. (2004).
Идентификация и регистрация генотипов мягкой
пшеницы (Triticum aestivum L.), ячменя (Ноrdеum
vulgаrе L.), кукурузы (Zеа mауs L.),
подсолнечника (Неlіапthus аnnuus L.) с помощью
анализа микросателитных маркepов.
Методические рекомендации - Pешения Ученых
Советов Южн
ого биотехнологического центра в
растениеводстве УААН и МОНУ; Селекционно-