ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI
TRƢỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN
Lê Hiền Giang NGHIÊN CỨU RỐI LOẠN ENZYME α-GALACTOSIDASE A
VÀ PHÂN TÍCH TRÌNH TỰ GEN GLA TRÊN
BỆNH NHÂN PHÌ ĐẠI CƠ TIM
LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC
Hà Nội – 2014 ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI
TRƢỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN Lê Hiền Giang
ĐH Y Hải Phòng; Trung tâm nghiên cứu và điều trị bệnh hiếm gặp, Bệnh viện đa
khoa Cựu chiến binh Đài Bắc, những người đã tận tình hướng dẫn kỹ thuật, giúp đỡ
vật chất và tinh thần cho tôi thực hiện đề tài.
Tôi xin cảm ơn các thầy cô trong bộ môn Sinh học di truyền, trường ĐH
KHTN Hà Nội, các anh chị và các bạn cao học khoá 2012 – 2014 đã nhiệt tình giúp
đỡ và cổ vũ tinh thần để tôi hoàn thành đề tài của mình.
Cuối cùng tôi cũng xin gửi lời cảm ơn từ đáy lòng tới gia đình, bạn bè tôi,
những người luôn bên tôi, cổ vũ cho tôi trong suốt thời gian qua.
Học viên
Lê Hiền Giang
MỤC LỤC
MỞ ĐẦU 1
Chƣơng 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU 3
1.1. Tổng quan về chứng phì đại cơ tim 3
1.1.1. Lịch sử phát hiện và tần số mắc bệnh 3
1.1.2. Nguyên nhân và triệu chứng của bệnh 4
1.2. Bệnh Fabry 7
1.2.1. Lịch sử phát hiện, nguyên nhân và tần số mắc bệnh 7
1.2.2. Triệu chứng của bệnh 8
1.3. Gen GLA và Enzyme α – galactosidase A 11
1.3.1. Gen GLA 11
1.3.2. Enzyme α – galactosidase A 12
1.4. Tổng quan các nghiên cứu trên thế giới và Việt Nam về đột biến gen GLA;
bệnh Fabry và bệnh phì đại cơ tim 15
1.4.1. Đột biến gen GLA 15
2.4.2.5. Giải trình tự gen GLA 39
Chƣơng 3. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 41
3.1. Kết quả xác định hoạt độ enzyme α-Gal A 41
3.1.1. Hoạt độ enzyme α-Gal A 41
3.1.2. Số lượng mẫu và hoạt độ enzyme α-Gal A theo nhóm tuổi 45
3.2. Kết quả giải trình tự gen GLA 47 3.2.1. Đặc điểm của 26 mẫu được giải trình tự 47
3.2.2. Kết quả nhân bản các phân đoạn gen GLA 49
3.2.2.1. Kết quả điện di sản phẩm PCR 49
3.2.2.2. Kết quả đo OD sản phẩm tinh sạch 51
3.2.3. Phát hiện các đột biến trên gen GLA 51
KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 59
TÀI LIỆU THAM KHẢO 59
PHỤ LỤC
PCR
Polymerase Chain Reaction
S
Substrate (cơ chất)
UPLC
Ultra Performance Liquid Chromatography (Sắc ký lỏng hiệu năng
siêu cao)
UTR
Untranslated region (vùng trình tự không mã hoá axit amin)
α-Gal A
Enzyme α –galactosidase A
DANH MỤC CÁC BẢNG
Bảng 1.1. Những dấu hiệu và triệu chứng có thể có của bệnh Fabry [38] 9
Bảng 1.2. Vị trí và độ dài exon và intron của gen GLA 11
Bảng 1.3. Kích thước của 7 exon trong gen GLA ở người và số lượng các đột
biến liên quan [23]. 18
Bảng 2.1. Các thành phần có trong dung dịch phản ứng 32
Bảng 2.2. Các thông số trong phương pháp khối phổ 33
Bảng 2.3. Trình tự và nhiệt độ bắt cặp của mồi, kích thước sản phẩm PCR 36
Bảng 2.4. Chu trình nhiệt trong phản ứng PCR 36
Bảng 2.5. Thành phần của phản ứng nhân bản. 39
Bảng 2.6. Hàm lượng ADN khuôn cho phản ứng PCR giải trình tự 39
Bảng 2.7. Chu trình nhiệt cho phản ứng PCR giải trình tự. 40
Hình 3.2. Hoạt độ enzyme α-Gal A của nhóm đối chứng và bệnh nhân. 43
Hình 3.3. Số lượng mẫu theo nhóm tuổi 45
Hình 3.4. Hoạt độ enzyme α-Gal A theo nhóm tuổi 46
Hình 3.5. Hình ảnh điện di sản phẩm PCR của mẫu FB01 49
Hình 3.6. Kết quả điện di sản phẩm PCR 7 exon và intron 4 của mẫu FB26,
FB44; FB64; FB69 50
Hình 3.7. Đoạn trình tự exon 1 đột biến c.[178 C>T] ; [0], p.P60S 54
Hình 3.8. Đoạn trình tự exon 1 có đột biến 5'UTR -12 G>A 56
Hình 3.9. Đoạn trình tự exon 1 có đột biến 5'UTR -10 C>T 56
Hình 3.10. Đoạn trình tự nucleotide có đột biến IVS1+17 A>G 57
1
MỞ ĐẦU
Bệnh phì đại cơ tim (Hypertrophic cardiomyopathy - HCM) là một căn bệnh
trong đó cơ tim dày bất thường ở tâm thất trái, thất phải, mỏm tim hoặc toàn bộ cơ
tim. Phần lớn các trường hợp đều bị phì đại vách liên thất, làm tắc nghẽn đường ra
thất trái.
Hầu hết bệnh nhân mắc bệnh này đều không có triệu chứng và họ có thể sống
một cuộc sống bình thường như những người bình thường. Trên thực tế, bệnh chỉ
hay gặp ở người trẻ tuổi và vận động viên thể thao. Triệu chứng đầu tiên và cũng là
cuối cùng của bệnh phì đại cơ tim là đột tử. Tuy nhiên, ở một số ít bệnh nhân có thể
có một trong các triệu chứng sau đây: đau ngực, chóng mặt và hoa mắt, nhất là
trong lúc vận động mạnh hoặc khi thay đổi tư thế đột ngột, khó thở, thường xuyên
mệt mỏi, hay bị ngất xỉu.
Trong số các bệnh nhân phì đại cơ tim, có đến 40% chưa tìm ra nguyên nhân
gây bệnh. Gần đây, một số các biến thể không điển hình của bệnh do tích đọng các
chất tại lysosome đã được xác định và đã thu hút được sự chú ý của các bác sĩ, đặc
biệt là kiểu hình không điển hình của bệnh Fabry, với các biểu hiện phì đại cơ tim
và các triệu chứng tương tự.
1. Phân tích rối loạn enzyme α –galactosidase A ở bệnh nhân phì đại cơ tim.
2. Phân tích trình tự gen GLA của một số mẫu có hoạt độ enzyme α –
galactosidase A giảm mạnh.
3
Chƣơng 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU
1.1. Tổng quan về chứng phì đại cơ tim
1.1.1. Lịch sử phát hiện và tần số mắc bệnh
Trong thập kỉ qua, những tiến bộ quan trọng đã nâng cao hiểu biết của chúng
ta về cơ sơ phân tử của bệnh tim mạch. Khi cấu trúc xoắn kép của ADN được mô tả
lần đầu vào năm 1953 bởi Watson và Crick trong tạp chí Nature, không ai có thể dự
đoán những tác động to lớn mà mà phát hiện này đem lại trong việc thiết lập các
nghiên cứu về di truyền người. Phát hiện này cũng với lý thuyết về di truyền
Mendel là hai mốc quan trọng trong sự phát triển của lĩnh vực di truyền phân tử tim
mạch. Ngoài ra những tiến bộ công nghệ gần đây đã thúc đẩy mạnh mẽ những
nghiên cứu di truyền phân tử tim mạch. Ngày nay, di truyền phân tử tim mạch được
đặc trưng bởi sự tích hợp của nghiên cứu trong phòng thí nghiệm công nghệ cao và
y học lâm sàng. Di truyền học phân tử đã xác định lại nguyên nhân và tiêu chuẩn
chẩn đoán của nhiều bệnh, từ đó đem đến những phác đồ điều trị mới cho một số
bệnh tim mạch. Các rối loạn tim mạch đầu tiên được xác định cơ sở di truyền là
bệnh phì đại cơ tim [49].
Bệnh phì đại cơ tim do Lord Brock lần đầu tiên phát hiện ra vào năm 1957
[36, 37].
Đột biến ở gen mã hoá protein sarcomer trong cơ tim (chủ yếu là myosin và
troponin) chiếm khoảng 60% các trường hợp phì đại cơ tim, 40% còn lại là do các
đột biến gen khác hoặc chưa rõ nguyên nhân [8].
Gần 20 năm trước, người ta xác định được đột biến liên quan đến gen MYH7
mã hoá β-myosin chuỗi nặng là cơ sở gây bệnh phì đại cơ tim. Từ đó đến nay, hàng
trăm đột biến nằm rải rác trong ít nhất 27 gen có liên quan đến bệnh phì đại cơ tim
được tìm thấy [36].
Theo những thống kê trong 20 năm qua, bệnh phì đại cơ tim là một bệnh tim
mạch có tính chất gia đình phổ biến và có sự đa dạng về mặt di truyền. Đại đa số
5
các đột biến gây bệnh làm thay đổi tính chất vật lý và chức năng của protein là đột
biến nhầm nghĩa, trong đó 1 axit amin này được thay thế bằng 1 axit amin khác.
Ngoài ra, có thể có đột biến gây ảnh hưởng đến nhiều axit amin trong 1 protein (đột
biến dịch khung đọc), kết quả là dẫn đến nhiều sản phẩm rất khác nhau và thường
gây ra nhiều hậu quả lâm sàng hơn [14].
Ngoài những nguyên nhân do đột biến các gen mã hoá cho protein cơ tim,
những nguyên nhân khác cũng đang được nghiên cứu tìm hiểu. Ưu điểm của những
xét nghiệm di truyền là xác định được nguyên nhân cụ thể ở những bệnh nhân phì
đại cơ tim có phải do gen mã hoá protein cơ tim gây nên hay là do những gen khác.
Những bệnh về tim liên quan đến sự trao đổi chất ở cơ tim thường được chẩn đoán
lâm sàng sai. Ví dụ một loại rối loạn tích đọng lysosome do gen trội liên kết với
NST X, lysosome liên quan đến protein màng (LAMP2- bệnh Danon); bệnh Fabry,
một bệnh do đột biến lặn ở gen GLA nằm trên NST X, gen này mã hoá cho enzyme
α-galactosidase A. Sự thiếu hụt enzyme này dẫn đến sự lắng đọng
glycosphingolipid trong tế bào [14, 56].
Theo thông kê, đột biến gen GLA ở bệnh nhân Fabry có thể chiếm tới 5% số
bệnh nhân phì đại cơ tim [8].
Chẩn đoán phân biệt giữa phì đại cơ tim do đột biến protein cơ tim với các
7
kỳ thiếu niên. Tập thể dục và lao động nặng có thể làm các triệu chứng biểu hiện rõ
hơn.
Mức độ nghiêm trọng của bệnh phụ thuộc vào vị trí cơ tim phì đại, và liệu nó
có ảnh hưởng đến việc bơm máu hay không. Các triệu chứng ở trẻ em thường gặp là
khó thở (thở rất nhanh khi tập thể dục), đau thắt ngực, choáng váng hoặc chóng mặt,
ngất, đánh trống ngực, loạn nhịp tim. Các triệu chứng ở trẻ sơ sinh có thể khó khăn
hơn để phát hiện bao gồm khó thở, phát triển kém, ra mồ hôi nhiều, hay khóc và
kích động khi ăn được cho là do đau ngực [77].
Do những biểu hiện lâm sàng phức tạp, nguyên nhân gây bệnh đa dạng nên đã
gây nhiều khó khăn cho các bác sĩ trong việc tiên lượng và chẩn đoán bệnh [12].
1.2. Bệnh Fabry
1.2.1. Lịch sử phát hiện, nguyên nhân và tần số mắc bệnh
Một trong những căn bệnh tích đọng các chất trong lysosome phổ biến nhất là
bệnh Fabry. Bệnh gây nên do đột biến gen lặn ở gen GLA khiến cho enzyme α-Gal
A không được tổng hợp, tổng hợp thiếu hoặc sai hỏng về chức năng.
Bệnh Fabry hay còn gọi là bệnh Andeson-Fabry, được mô tả đầu tiên vào năm
1898 bởi hai nhà khoa học hoạt động độc lập là Johannes Fabry người Đức và
William Anderson người Anh. Năm 1947 nguyên nhân gây bệnh được xác định là
do chất béo lắng đọng trong các mạch máu của cơ thể. Năm 1963, chất béo lắng
đọng được xác định là globotriaosylceramide (Gb3) và đến năm 1967 người ta xác
định được enzyme α-Gal A chính là tác nhân gây tích đọng Gb3. Năm 1986, gen
GLA mã hoá cho enzyme α-Gal A được xác định [75].
Từ đó đến nay người ta đã xác định được hàng trăm đột biến trên gen GLA gây
nên bệnh Fabry, kèm theo đó là các kiểu hình khác nhau của bệnh. Phần lớn các
bệnh nhân bị bệnh Fabry có một đột biến điểm duy nhất trong gen GLA của họ.
Tỉ lệ ước chừng của bệnh Fabry là 1/40000 nam giới và căn bệnh này được
tìm thấy ở tất cả các sắc tộc [27].
chứng tim mạch gồm loạn nhịp tim, phì đại thất trái, suy tim, thiếu máu cục bộ cơ
9
tim, hoặc nhồi máu cơ tim. Cơn thiếu máu và đột quỵ là những biểu hiện muộn và
cũng là nguyên nhân gây tử vong sớm ở những bệnh nhân Fabry [38].
Bảng 1.1. Những dấu hiệu và triệu chứng có thể có của bệnh Fabry [38]
Cơ quan
Dấu hiệu/ triệu chứng
Tổng quan
Giảm chất lượng cuộc sống do một nhóm các triệu chứng và
tiên lượng.
Hệ thống thần kinh
Acroparesthesias (hội chứng liên quan đến các dị cảm như
ngứa ran, tê và tê cứng ở tay, chân)
Các cơn đau, đột quỵ
Thiếu máu não thoáng qua
Nghẽn mạch
Da
Angiokeratomas (những tổn thương trên da, đường kính
khoảng 1 -3mm, có thể phẳng hoặc nổi cục nhỏ, gây nên do
sự tổn thương hoặc giãn nở vĩnh viễn của các mao mạch)
Tăng tiết mồ hôi/ ít hoặc không tiết mồ hôi
Dạ dày – ruột
Buồn nôn
Tiêu chảy
Đầy bụng sau ăn và đau
Ăn mau no
Khó tăng cân
Thận
đầu muộn và tiến triển chậm của bệnh, các biểu hiện suy cơ quan xuất hiện khi bệnh
nhân đã lớn tuổi (sống được thời gian dài) [23]. Một trong những triệu chứng
thường thấy nhất ở những bệnh nhân Fabry thể không điển hình là chứng phì đại cơ
tim.
Ở những bệnh nhân Fabry có những biểu hiện phì đại cơ thất trái giống như
biểu hiện phì đại cơ tim. Bệnh cơ tim của bệnh nhân Fabry được báo cáo là đến 6%
nam giới và 12 % nữ giới có hiện tượng phì đại cơ tim khởi phát muộn. Đặc biệt,
tim có thể là cơ quan duy nhất có liên quan ở bệnh nhân nam giới (hoặc đồng hợp tử
gen bệnh) hay ở nữ giới mang gen bệnh, trong khi các hoạt động enzyme gần như
bình thường và thiếu các biểu hiện lâm sàng khác. Điều này gây khó khăn trong
việc chẩn đoán bệnh. Do đó cần có thêm các nghiên cứu sinh hoá và phân tích di
truyền để đưa đến kết luận chính xác [48].
11
1.3. Gen GLA và Enzyme α – galactosidase A
1.3.1. Gen GLA
Gen GLA là gen mã hoá cho enzyme α – galactosidase A nằm trên cánh dài
của NST X, ở vùng Xq22.1 (hình 1.2). Chính xác hơn, gen GLA nằm từ cặp base
101 408 012 đến cặp base 101 397 790 trên NST X. Nó bao gồm 7 exon với độ dài
mỗi exon khoảng 92 đến 219 bp (bảng 1.2). Vùng mang mã gồm 1290 bp và mã
hóa cho 1 chuỗi polypeptid có 429 amino acid, với 31 axit amin đầu tiên là một
chuỗi tín hiệu.
Hình 1.2. Vị trí của gen GLA trên NST X
(Nguồn: Genetics Home Reference)
Bảng 1.2. Vị trí và độ dài exon và intron của gen GLA
Exon / Intron
Vị trí bắt đầu
Intron 4
101 400 665
101 398 947
1719
Exon 5
101 398 946
101 398 785
162
Intron 5
101 398 784
101 398 568
217
Exon 6
101 398 567
101 398 370
198
Intron 6
101 398 369
101 398 100
270
Exon 7
101 398 099
101 397 803
297
12
1.3.2. Enzyme α – galactosidase A
Enzyme α – galactosidase A (hay còn được gọi là α – Gal A; GLA và α –
GAL) được mã hóa bởi gen GLA. Enzyme α- Gal A là một glycoprotein homodimer
bào sử dụng. Ở người, các sai hỏng ở các enzyme trong lysosome gây bệnh tích
đọng các chất trong lysosome (lysosomal storage diseases - LSDs). Ở nhóm bệnh
này, sự khiếm khuyết của gen dẫn đến sự thiếu hụt hoặc mất chức năng của các
enzyme dẫn đến tích tụ các chất trong mô. Các triệu chứng bệnh cụ thể phụ thuộc
vào số lượng, hoạt động của các enzyme [65].
Enzyme α – galactosidase A cũng là một lysosome enzyme. Hoạt động bình
thường của gen GLA và enzyme α – Gal A trong tế bào được nêu trong hình 1.5. 14 Hình 1.5. Gen GLA hoạt động bình thường sinh ra α-Gal A phân cắt Gb3 [76].
Sự thay đổi trong gen GLA tạo ra những enzyme α – galactosidase A bất
thường hoặc hàm lượng enzyme suy giảm. Điều này dẫn đến sự phân cắt Gb3
không hiệu quả. Kết quả là, chất này tích tụ trong các tế bào của cơ thể, đặc biệt là
các tế bào mạch máu ở da và các tế bào trong thận, tim và hệ thần kinh (Hình 1.6).
Tùy theo mức độ tích tụ và cơ quan nơi Gb3 tích tụ sẽ có những triệu chứng khác
nhau. Một trong những biểu hiện thường thấy nhất là chứng phì đại cơ tim [76].
Hình 1.6. Khiếm khuyết gen GLA gây tích đọng Gb3 trong lysosome [76].
15
1.4. Tổng quan các nghiên cứu trên thế giới và Việt Nam về đột biến gen
GLA; bệnh Fabry và bệnh phì đại cơ tim
1.4.1. Đột biến gen GLA
Sau khi xác định gen GLA mã hoá cho enzyme α – Gal A vào năm 1986, hàng
loạt các đột biến gen GLA gây nên bệnh Fabry đã được các nhà khoa học tìm ra.
Năm 1989, Bernstein và cộng sự đã xác định một đột biến thay thế
[28].
Năm 1997, Christine M. Eng và cộng sự đã phát hiện 35 đột biến gen GLA ở
các bệnh nhân Fabry thể tim và thể điển hình. Các loại đột biến gồm đột biến vô
nghĩa, nhầm nghĩa, vị trí cắt nối, đột biến chèn hoặc mất một vài nucleotide, trong
đó các đột biến xuất hiện ở exon 7 nhiều nhất [19].
Năm 2000, Kase và cộng sự mô tả đột biến Q279E gây ra các biến thể tim của
bệnh Fabry. Khi so các tế bào hoạt động bình thường với các nguyên bào sợi của
bệnh nhân bị đột biến, họ nhận thấy tế bào đột biến Q279E chỉ tạo ra một lượng nhỏ
enzyme α – Gal A. Các tác giả nhận định rằng, protein đột biến có lẽ giảm ở lưới
nội chất của tế bào [40].
Năm 2003, nhóm nghiên cứu của Yasuda đã xác định được 2 đột biến lệch
khung mới là 1277delAA và 1284delACTT xảy ra ở đoạn cuối trình tự mã hoá đầu
3’ và làm mất các tín hiệu kết thúc. Việc xoá 2 cặp nu cũng làm thay đổi trình tự
poly A. Cả hai đột biến tạo ra các sản phẩm phiên mã có độ dài đoạn trình tự đầu 3’
khác nhau, một số bị kéo dài thêm khoảng 1 kb [70].
Cũng trong năm 2003, Lai và cộng sự đã chỉ ra rằng hầu hết các đột biến ở gen
GLA đã được xác định ở những bệnh nhân bệnh Fabry chỉ bằng giải trình tự gen, và
do đó một số các đột biến cắt nối được phân loại sai là đột biến nhầm nghĩa. Để xác
định được các sai sót cắt nối gây ra bởi đột biến. Nhóm tác giả đã tiến hành tìm
kiếm các đột biến đã được công bố có vị trí gần vị trí cắt nối, bao gồm cả đột biến
Copyright: Tài liệu đại học ©