BỘ GIÁO DỤC VÀ ðÀO TẠO
TRƯỜNG ðẠI HỌC NÔNG NGHIỆP HÀ NỘI
ðÀO THỊ THIÊM
NGHIÊN CỨU ðẶC TÍNH SINH HỌC CỦA MỘT SỐ
CHỦNG VI KHUẨN LIÊN KẾT HẢI MIÊN (SPONGE) LUẬN VĂN THẠC SĨ
HÀ NỘI – 2014BỘ GIÁO DỤC VÀ ðÀO TẠO
TRƯỜNG ðẠI HỌC NÔNG NGHIỆP HÀ NỘI
văn là trung thực và chưa ñược sử dụng ñể bảo vệ một học vị nào.
Tôi xin cam ñoan, mọi sự giúp ñỡ trong việc thực hiện luận văn này
ñã ñược cảm ơn, các thông tin trích dẫn trong luận văn ñều ñã ñược chỉ rõ
nguồn gốc.
Tác giả ðào Thị Thiêm Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sĩ Khoa học Nông nghiệp
Page ii
LỜI CẢM ƠN
Em xin chân thanh cảm ơn ñến thầy hướng dẫn PGS.TS.Phạm Việt
Cường, Viện trưởng Viện Khoa học Miền trung và TS.Nguyễn Văn Giang
trưởng Bộ môn vi sinh, khoa Công nghệ sinh học, trường Nông nghiệp Hà Nội,
người ñã tận tình chỉ bảo, hướng dẫn và giúp ñỡ em, là ñộng lực giúp em trong
thời gian em làm ñề tài và hoàn thành luận văn này.
ðồng thời em cũng xin chân thành cảm ơn PGS.TS. Nguyễn Thị Kim
Cúc, Th.S Vũ Thị Quyên cùng các cô, các anh chị, các bạn trong Phòng công
nghệ sinh học, Viện Hóa sinh biển, Viện khoa học Miền trung ñã giúp ñỡ em
rất nhiều trong thời gian em làm luận văn.
Em xin chân thàn cảm ơn các thầy cô Khoa Công nghệ sinh học, Ban
quản lý ñào tạo sau ñại học cũng toàn thể các bạn trong lớp CNSHA K21
trường Nông nghiệp Hà Nội ñã giúp ñỡ và tạo ñiều kiện ñể em có thể hoàn
thành tốt khóa học này.
Qua ñây, em cũng xin bày tỏ lòng cảm ơn sâu sắc tới gia ñình, bạn bè
ñã luôn ñộng viên em trong suốt thời gian học tập.
3.3 Môi trường nghiên cứu 15
3.4 Phương pháp nghiên cứu 17
3.4.1 Phân lập vi khuẩn liên kết hải miên 17
3.4.2 ðánh giá hoạt tính ñối kháng Vibrio spp. 18
3.4.3 ðặc ñiểm sinh hóa 18
3.4.4 ðịnh danh một số chủng tuyển chọn bằng kỹ thuật sinh học phân
tử Một số phương pháp sinh học phân tử 22
Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sĩ Khoa học Nông nghiệp
Page iv
PHẦN 4 KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN 24
4.1 Phân lập vi khuẩn liên kết hải miên 24
4.2 Xác ñịnh hoạt tính ñối kháng vi khuẩn kiểm ñịnh của một số
chủng phân lập 28
4.3 Nghiên cứu một số ñặc tính sinh lý, sinh hóa của các chủng tuyển
chọn 32
4.3.1 Xác ñịnh Gram 32
4.3.2 Một số ñặc tính sinh hóa của các chủng tuyển chọn 33
4.4 ðịnh danh các chủng vi khuẩn nghiên cứu bằng kỹ thuật giải
trình tự gen 16S rRNA 42
4.5 Kết quả phân tích trình tự 5 chủng vi khuẩn 46
4.5.1 Trình tự mẫu LC22b2 46
4.5.2 Trình tự mẫu LC22cs2 47
4.5.3 Trình tự mẫu LC22cs5 51
4.5.4 Trình tự mẫu LC22xv5 55
4.5.5 Trình tự LC22xv6 61
4.3.5 Các chủng ñã ñược ñịnh danh ra ñến loài 62
PHẦN V KẾT LUẬN VÀ ðỀ XUẤT 63
5.1 Kết luận 63
2.1 Hải miên ñược lấy tại vùng biển Hải Vân- Sơn Chà 3
3.1 Các bước tiến hành nhuộm Gram 19
4.1 Hình ảnh vi khuẩn ñược phân lập và làm sạch trên môi trường
marine agar 2216 26
4.2 Thử hoạt tính ñối kháng của vi khuẩn 31
4.3 Ảnh nhuộm Gram các chủng vi khuẩn 32
4.4 Phản ứng thử catalase dương tính của chủng vi khuẩn 33
4.5 Phản ứng thử catalase âm tính 34
4.6. Thử khả năng sinh acetoin của vi khuẩn 34
4.7 Phản ứng lên men glucose kỵ khí 35
4.8 Kiểm tra khả năng sinh enzyme nitratase 36
4.9 Khả năng phát triển ở nồng ñộ muối 5% 37
4.10 Khả năng phát triển ở nồng ñộ muối 7% của vi khuẩn 37
4.11 Khả năng phát triển ở nồng ñộ muối 10% 38
4.12 Khả năng phân giải gelatin 39
4.13 Khả năng thủy phân tinh bột tan 39
4.14 Khả năng sử dụng citrate như là nguồn carbon duy nhất của vi
khuẩn trong quá trình biến dưỡng. 40
4.15 Tách DNA tổng số 42
4.16 ðiện di ñồ sản phẩm PCR gene 16S DNA riboxom của các chủng 43
4.17 ðiện di ñồ plasmid tái tổ hợp của các chủng vi khuẩn 44
4.18 ðiện di ñồ sản phẩm cắt plasmid tái tổ hợp 45
4.19 Cây phân loại 60
Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sĩ Khoa học Nông nghiệp
Page 1
Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sĩ Khoa học Nông nghiệp
Page 2
sống ñể tổng hợp các sản phẩm tự nhiên nói chung cực kỳ ñắt ñỏ hoặc không
thực hiện ñược, nuôi cấy vi sinh vật có thể cung cấp hợp chất quan trọng rẻ và
số lượng lớn.
ðề tài: “Nghiên cứu ñặc tính sinh học của một số chủng vi khuẩn
liên kết Hải miên (Sponge)” nhằm ñánh giá sự ña dạng sinh học của vi
khuẩn liên kết hải miên và tìm kiếm chủng có hoạt tính sinh học và có tiềm
năng ứng dụng trong thực tế.
1.2. Mục tiêu của ñề tài
- ðánh giá ñược mức ñộ ña dạng và xác ñịnh ñặc tính sinh học của vi
khuẩn liên kết hải miên
- Phát hiện các chủng có hoạt tính ñối kháng nguồn bệnh vi khuẩn
trong nuôi trồng thủy sản
1.3. Ý nghĩa của ñề tài
Bước ñầu tiến hành nghiên cứu về hệ vi khuẩn liên kết hải miên biển
Việt Nam và từ ñó tiến tới khai thác nguồn dược liệu từ vi sinh vật biển nói
chung và vi khuẩn liên kết hải miên nói riêng.
1.4 Nội dung nghiên cứu
a. Phân lập vi khuẩn từ loài hải miên biển
b. Xác ñịnh khả năng ñối kháng một số chủng vi khuẩn gây bệnh
c. Nghiên cứu các ñặc ñiểm sinh lý sinh hóa của các chủng tuyển chọn
d. ðịnh danh các chủng tuyển chọn bằng phương pháp giải trình tự gen
16S rRNA
Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sĩ Khoa học Nông nghiệp
Page 3
PHẦN II: TỔNG QUAN TÀI LIỆU
tách chiết.
Hải miên là vật chủ của cộng ñồng vi sinh vật lớn và vai trò của những
vi sinh vật này thay ñổi theo nguồn dinh dưỡng và sự cộng sinh, hỗ sinh với
hải miên,là nguồn giàu các sản phẩm tự nhiên có giá trị như polyketides,
nonribosomal peptides, và alkaloids nhằm xua ñuổi và ngăn chặn ñộng vật ăn
thịt, tranh giành không gian với các loài không cuống (sessile) khác, ñể liên
lạc và bảo vệ không bị nhiễm bệnh. Rất nhiều hợp chất có hoạt tính ñộc tế bào
(cytotoxic), kháng khuẩn, kháng nấm, kháng virus và chống viêm.
Rất nhiều hải miên có cộng ñồng vi sinh vật cực kỳ ña dạng trong mô
của chúng. Sự ña dạng này có thể giải thích một phần bởi sự thay ñổi các ñiều
kiện lý, hóa, sinh trong hải miên, có thể ảnh hưởng ñến sinh thái vi sinh vật và
tiến hóa. Những nghiên cứu về vi sinh vật liên kết hải miên cho thấy vi sinh
vật có thể chiếm ñến 50% thể tích hải miên, và con số này lớn hơn 2-3 lần so
với lượng vi khuẩn trong nước biển (Wang 2006),và cộng ñồng này ñặc hiệu
cho hải miên.
2.2. Vi khuẩn liên kết Hải miên biển
Vi sinh vật sinh sống trong tất cả các hệ sinh thái biển, chúng rất ña
dạng và trao ñổi chất phức tạp. Vi sinh vật biển là các nhà sản xuất sinh khối
ñầu tiên trong ñại dương, thu nhận ánh sáng và cố ñịnh cacbon, và là những
Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sĩ Khoa học Nông nghiệp
Page 5
recyclers dinh dưỡng ñầu tiên. Vi sinh vật biển cũng ñược biết tham gia vào
chu trình toàn cầu của các nguyên tố sinh học như nitơ, cacbon, oxy, photpho,
sắt, lưu huỳnh và các vi lượng. Những ñóng góp quí giá của chúng vào các
chu trình hóa ñịa sinh chưa ñược biết. Nhưng do tính linh hoạt của các khả
năng sinh hóa và sinh khối to lớn của chúng trong hệ sinh thái biển, chúng
ñược tin rằng là các thành phần chính chịu trách nhiệm cho việc duy trì các
chu trình này, giúp ổn ñịnh các hệ sinh thái.
Một hợp chất kháng khuẩn khác ñược tách từ vi sinh vật biển (Streptomyces
sp) là sisomicin, kháng Bacillus cereus và E.coli.
Vi sinh vật biển sinh biosurfactant và bioremediation[26]: vi sinh vật
biển ñược chứng minh có lợi nhiều mặt, trong ñó có biosurfactant. Các chủng vi
sinh vật sinh biosurfactant ñược chú ý, ñặc biệt cho bioremedation biển bị ô
nhiễm bởi dầu thô. Một số loài sinh tổng hợp biosurfactant là P.nautical. Các
thành phần chính gồm proteins, carbohydrates và lipids tỉ lệ 35:63:2, tương ứng.
Một chủng vi khuẩn biển nhiệt ñới Yarrowia lipolytica sinh emulsifier khi có
mặt alkanes hoặc dầu thô. Một số chủng khác như Alcaligenes sp.; Alcanivorax
borkumensis; Myroides sp. cũng có khả năng sinh biosurfactants khác nhau.
Bên cạnh ñó, vi sinh vật biển có khả năng oxy hóa các ion kim loại
nặng. Chủng Bacillus sp.SG-1 oxy hóa Coban và Manganese (Mn II). Mn (III,
IV) oxides ñược sản sinh bởi vi khuẩn oxy hóa Mn(II) là các chất oxy hóa
mạnh có khả năng oxy hóa các hóa chất vô cơ và hữu cơ.
Vi sinh vật biển là nhà sản xuất enzymes[27]: người ta tính rằng thị
trường thế giới cho enzyme công nghiệp tăng 10-15% hàng năm.
Công nghệ sinh học enzymes biển có thể cung cấp các chất xúc tác sinh học
mới với các tính chất chịu muối, chịu nhiệt, chịu áp suất (barophilicity), thích
nghi với lạnh (cold adaptivity) và dễ nuôi cấy qui mô lớn.
ðối với vi sinh vật công sinh nuôi cấy ñược, Li và cs (2006) phân lập
23 khuẩn tia từ Craniella australiensis sử dụng môi trường nước biển và dịch
chiết hải miên, trong ñó 11 chi Streptomyces riêng rẽ. Các chi Streptomyces,
Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sĩ Khoa học Nông nghiệp
Page 7
Pseudonocardia và Nocardia ñược phân lập từ hải miên biển Craniella
australiensis, Halichondria rugosa, Sponge sp. và Stelletta tenuis.
Hiện nay, cộng ñồng vi sinh vật ở hải miên và hệ gen của chúng chưa
ñược hiểu rõ. Bằng các phương pháp lai huỳnh quang in situ hoặc giải trình tự
nước. ðề tài trong Chương trình khoa học trong ñiểm cấp Nhà nước
KC.09.09/06-10: Nghiên cứu sàng lọc các chất có hoạt tính sinh học theo ñịnh
hướng kháng sinh, gây ñộc tế bào và chống ôxy hóa từ sinh vật biển nhằm tạo
các sản phẩm có giá trị dược dụng (2007-2008), do GS Châu Văn Minh chủ
trì ñã nghiên cứu một số sinh vật biển có chất kháng sinh, gây ñộc tế bào và
chống ôxy hóa và ñăng ký 3 thực phẩm chức năng tại Cục Vệ sinh an toàn
thực phẩm – Bộ Y tế.
Gần ñây người ta chú ý nhiều hơn ñến vi sinh vật liên kết hải miên ñể
tìm nguồn gốc ñích thực của các hợp chất hoạt tính sinh học và sự liên kết hải
miên với vi sinh vật.
Môi trường biển rất ña dạng và vi sinh vật biển phơi nhiễm áp suất,
nhiệt ñộ, ñộ mặn, dinh dưỡng cực ñoan. Những enzymes của những vi sinh
vật trong những môi trường như thế rõ ràng có những tính chất sinh lý và
sinh hóa ña dạng, cho phép quần thể vi sinh vật thích nghi và phát triển
mạnh trong các ñiều kiện cực ñoan ñó. Hiện nay những nghiên cứu về sinh
vật biển nói chung và vi sinh vật biển nói riêng còn là một lĩnh vực yếu và
thiếu ở Việt Nam. Vì vậy, ðề tài cung cấp những hiểu biết về ña dạng vi
khuẩn liên kết hải miên bằng phương pháp phân lập và ñịnh danh các
chủng phân lập trên các loại môi trường chọn lọc cho từng loại, hướng tới
tuyển chọn các chủng hữu ích có tiềm năng ứng dụng trong nghiên cứu các
hoạt chất có hoạt tính sinh học.
2.3 Các chủng thử hoạt tính ñối kháng của vi khuẩn liên kết Hải miên
2.3.1. Vi khuẩn Vibrio vulnificus (V.vulificus)
Khác với hầu hết các loại vi khuẩn, V. vulnificus là một loại vi khuẩn
hình dài có thể sống ở nước mặn. Nó là một sinh vật sống tự nhiên trong nước
biển, ñặc biệt ở những vùng có ñộ mặn thấp (0.5 ñến 2.0% muối), như: những
Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sĩ Khoa học Nông nghiệp
Page 9
Bệnh hoa liễu (HIV/AIDS)
•
Dạ dày bị rối loạn (người ñã bị mỗ dạ dày, người ñang dùng thuốc là
giảm ñộ axit trong dạ dày)
Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sĩ Khoa học Nông nghiệp
Page 10
•
Các thứ bệnh khác, hoặc những trường hợp bị phương pháp trị liệu
làm yếu hệ thống miễn dịch (như hóa liệu pháp)
2.3.2. Vibrio parahaemolyticus (V.parahaemolyticus)
V.parahaemolyticuslà Gram âm, bao gồm các chủng có ñộc tố có khả
năng gây bệnh và các chủng không gây bệnh hoai tử gan tụy cấp tính AHPND
(Acute Hepatopancreatic Necrosis Disease). Dòng vi khuẩn gây bệnh
AHPND phát triển trong dạ dày tôm, chúng hình thành nên các màng sinh học
( biofilm) giúp bảo vệ chúng bởi tác dụng của các loại kháng sinh và các
phương pháp ñiều trị khác. V.parahaemolyticus có khả năng chịu ñựng với
các ñộ mặn, pH, nhiệt ñộ và dễ dàng ñeo bám trên các sinh vật phù du di
chuyển theo dòng chảy.
Chỉ có một số lượng nhỏ các chủng vi khuẩn Vibrio gây bệnh trên
tôm nuôi. Phần lớn nó là mầm bệnh cơ hội, tức là chúng chỉ phát triển và
gây bệnh khi vật chủ bị stress hoặc yếu và không có khả năng chống lại
chúng. Chỉ có một số ít mầm bệnh vi khuẩn Vibrio là tác nhân gây bệnh
chính trên ñộng vật khỏe mạnh. Vi khuẩn Vibrio có ñộc tính cao có thể giết
chết tôm khi tiếp xúc với sự hiện diện rất ít của mầm bệnh hoặc khi tôm ăn
phải một lượng nhỏ vi khuẩn.
V.parahaemolyticus rất phổ biến trong môi trường ở các vùng cửa
sông, và một số ít hiện diện trong môi trường nước ngọt. Hầu hết chúng ñều
không có khả năng gây bệnh và thường vô hại khi ăn phải, tuy nhiên ñộc tố
của vi khuẩn là sức khỏe của vật chủ yếu ñi và dẫn ñến cái chết. Dòng vi
khuẩn V. parahaemolyticus gây bệnh EMS/AHPND không tấn công và xâm
nhập vào máu của tôm thông qua các vết thương hoặc các cơ chế xâm nhập
khác. ðiều này giải thích lý do tại sao thuốc kháng sinh không thể ngăn chặn
các nhiễm trùng do EMS/AHPND gây nên. Nếu như kháng sinh không thể
tiếp xúc với mầm bệnh ở mức ñộ ñủ ñể ảnh hưởng ñến nó thì kháng sinh sẽ
không thể phát huy tác dụng. Mặc dù vẫn có nhiều trường hợp cần dùng ñến
kháng sinh trong việc ñiều trị bệnh trên tôm, dùng kháng sinh ñể trị bệnh
EMS/AHPND là một ví dụ rất ñiển hình về việc sử dụng kháng sinh không
Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sĩ Khoa học Nông nghiệp
Page 12
hiệu quả. Ẩn mình trong cái vỏ bọc an toàn là màng bao sinh học (biofilm), vi
khuẩn V. parahaemolyticus - tác nhân gây bệnh EMS/AHPND ñược bảo vệ
trước các hóa chất về mặt lý thuyết là có thể tiêu diệt chúng. ðiều này sẽ ñặt
ra một thách thức rất lớn ñối với các cố gắng phát triển một phương pháp ñiều
trị EMS/AHPND.
2.3.3 Pseudomonas
Pseudomonas là một chi vi khuẩn xuất hiện ở mọi nơi trong môi
trường. Sự biến dưỡng dễ thay ñổi và linh ñộng của chúng làm cho chúng có
thể sống ở nhiều môi trường khác nhau như nước, ñất, trên cây và trong các
ñộng vật. Trong số những loài Pseudomonas này, có những loài tiêu biểu có
thể ñược sử dụng trong công nghệ sinh học.
ðặc ñiểm hình thái chung của Pseudomonas là Gram âm, tế bào hình
que, di ñộng nhờ roi ở ñầu và không có bào tử.
Các ñặc ñiểm sinh lí là dị dưỡng, không lên men, linh hoạt về dinh
dưỡng, không quang hợp hoặc cố ñịnh nitrogen
Pseudomonas aeruginosa (ñại diện của Pseudomonas, hay còn gọi là
trực khuẩn mủ xanh) là một trong những vi khuẩn phổ biến gây bệnh ở ñộng
Mẫu Hải miên ñược thu thập từ biển Lăng Cô ( Huế), ñược lưu trữ tại
phòng Công nghệ sinh học, viện Hóa sinh biển ở -80°C
Trình tự mồi cho 16S rARN:Mồi xuôi: AGA GTT TGA TCA TGG
CTCA; Mồi ngược: AAG GAG GTG ATC CAG CC
3.2. Hóa chất, thiết bị
- Hóa chất sử dụng trong nuôi cấy vi khuẩn: agar, cao thịt, cao nấm
men, peptone, NaCl…
- Hóa chất sử dụng thử phản ứng sinh lý, sinh hóa của các chủng vi
khuẩn nghiên cứu: KNO3, glucose, KOH, anpha- naphton, ñỏ phenol,
lysozyme, KI, ZnCl2, tinh bột, Na3C6H5O4.2H2O…
- Hóa chất dùng trong sinh học phân tử:
- TE1:
+ 10 mM Tris–HCl
+ 1 mM ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA), pH 8.0
- ðệm lysis
+ 0.5 M NaCl
+ 100 mM EDTA
+ 10 mM Tris, pH 8.0
- Proteinase K 20mg/ml
- SDS 1%
- Phenol-chloroform (25-24)
- Phenol/chloroform/isoamyl alcohol (25-24-1)
- Isopropanol
Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sĩ Khoa học Nông nghiệp
Page 15
- TE (H
2
O) vô trùng.
3
- 16, KBr - 0.08, thạch - 20.0. Các
loại vi lượng (mg/l): SrCl
2
- 34.0, H
3
BO
3
- 22.0, Na
2
(SiO
2
)
n
O - 4.0, NaF -
2.4, NH
4
NO
3
- 1.6, Na
2
HPO
4
- 8.0. Ngoài ra còn một số hóa chất dùng trong
nuôi cấy vi sinh vật như NaCl 0.9%, nước biển nhân tạo.
- Nước biển nhân tạo có thành phần sau (g/l): MgSO
4
.7H
2
O - 3.50, NaHCO
39
O
5
Na) 3; Saccharose 20; NaCl
Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sĩ Khoa học Nông nghiệp
Page 16
10; Ferric citrate (C
6
H
5
FeO
7
) 1; Bromothymol blue 0,04; Thymol blue 0,04;
Thạch 15
Môi trường thử hoạt tính sinh lý, sinh hóa của vi khuẩn nghiên cứu
Môi trường thử khả năng sinh catalase
Cao thịt 10.36g Peptone 5.18g
pH 6.5-6.7 H
2
O 1000ml
Môi trường xác ñịnh khả năng khử nitrat
peptone 10g KNO3 10g
Cao thịt 1g NaCl 5g
H
2
O 1000ml pH 7.2±0.2
O 1000ml
pH 7.2±0.2
Môi trường xác ñịnh khả năng thủy phân tinh bột tan
Peptone 5.16g NaCl 10.32g
Cao thịt 5.18g Agar 15.5g
Tinh bột tan 10-30g pH 7.2±0.2
Môi trường xác ñịnh khả năng phân giải Gelatin
Peptone
5g Gelatin 120g
H
2
O 1000ml 7.2÷7.4
Môi trường xác ñịnh khả năng ñồng hóa citrate
NH
4
H
2
PO
4
1g MgSO
4
.7H
2
O 0.2g
K
2
HPO
4
o
C. Sau 24 giờ nuôi cấy, chọn các khuẩn lạc ñặc
trưng, riêng rẽ, làm sạch lại trên môi trường phân lập, cấy trải ở các nồng ñộ
từ cao ñến thấp và giữ giống cho những nghiên cứu tiếp theo.
Copyright: Tài liệu đại học ©