1

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu http://www.lrc-tnu.edu.vn/

VIỆN HÀN LÂM KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ VIỆT NAM
VIỆN SINH THÁI VÀ TÀI NGUYÊN SINH VẬT
 TRẦN THỊ LƢƠNG NGHIÊN CỨU QUAN HỆ DI TRUYỀN MỘT SỐ GIỐNG LÚA ĐẶC
SẢN, CHẤT LƢỢNG, TRỒNG PHỔ BIẾN Ở VIỆT NAM BẰNG CHỈ
THỊ PHÂN TỬ SSR
LUẬN VĂN THẠC SĨ SINH HỌC

Hà Nội, Tháng 10-2013
2

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu http://www.lrc-tnu.edu.vn/

Hà Nội, ngày tháng năm 2013
Tác giả
Trần Thị Lƣơng
4

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu http://www.lrc-tnu.edu.vn/ LỜI CẢM ƠN



DANH MỤC TỪ, CỤM TỪ VIẾT TẮT
DNA : Deoxyribonucleic acid
RNA : Axit ribonucleotide
AFLP : Amplyfied Fragment Length Polymorphism
Bp : Cặp base (base pair)
CTAB : Cetyltrimethyl amoniumbromide
dNTP : Deoxynucleosid triphosphat
EDTA : Ethylene diamin tetra acetate
EtBr : Ethidium bromide
Kb : Kilo base
NST : Nhiễm sắc thể
PCR : Phản ứng chuỗi polymerase
(Polymerase chain reaction)
QTL : Locut tính trạng số lƣợng (Quantitative Trait Loci)
Rnase : Ribonuclease
RFLP : Đa hình độ dài các đoạn cắt hạn chế
(Restriction Fragment Length Polymorphism)
RAPD : Random Amplyfied Polymorphic DNA
SSR : Các trình tự lặp lại đơn giản
(Simple Sequence Repeats)
Taq Polymerase: Thermus aquaticus Polymerase
TBE : Tris base, Boric acid, EDTA.
TE : Tris EDTA 6

7

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu http://www.lrc-tnu.edu.vn/ DANH MỤC HÌNH ẢNH

Hình 3.1. Kết quả điện di DNA genome của 25 mẫu lúa (số 1-25 trên ảnh
tƣơng ứng với các giống theo thứ tự 1-25 ở bảng 2.1) 32
Hình 3.2. Ảnh điện di trên gel polyacrylamide của cặp mồi RM18 với các
mẫu lúa D30 – DS55 tƣơng ứng với số 1-60 (bảng 2.1) 36
Hình 3.3. Ảnh điện di trên gel polyacrylamide của cặp mồi RM510 với các
mẫu lúa DS1 - DS25 tƣơng ứng với số 1-25 (bảng 2.1) 37
Hình 3.4. Ảnh điện di trên gel polyacrylamide của cặp mồi RM20 với các
mẫu lúa DS1 - DS25 tƣơng ứng với số 1-25 (bảng 2.1) 37
Hình 3.5. Ảnh điện di trên gel polyacrylamide của cặp mồi RM17 với các
mẫu lúa DS1 – DS60 tƣơng ứng với số 1-60 (bảng 2.1) 37
Hình 3.6. Ảnh điện di trên gel polyacrylamide của cặp mồi RM223 với các
mẫu lúa DS1 - DS25 tƣơng ứng với số 1-25 (bảng 2.1) 38
Hình 3.7. Ảnh điện di trên gel polyacrylamide của cặp mồi RM19 với các
mẫu lúa DS30 – DS55 tƣơng ứng với số 1-25 (bảng 2.1) 38
Hình 3.8. Ảnh điện di trên gel polyacrylamide của cặp mồi RM72 với các
mẫu lúa DS1 – DS60 tƣơng ứng với số 1-60 (bảng 2.1) 39
Hình 3.9. Sơ đồ quan hệ di truyền của 60 giống lúa dựa trên số liệu phân tích
DNA với 33 chỉ thị phân tử SSR 44
2.2.2. Phƣơng pháp chạy PCR với các mồi SSR 28
2.2.3. Phƣơng pháp điện di trên gel agarose 28
2.2.4. Phƣơng pháp điện di sản phẩm PCR trên gel polyacrylamide 29
2.2.5. Phƣơng pháp phân tích số liệu 31
CHƢƠNG III: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 32
9

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu http://www.lrc-tnu.edu.vn/

3.1. Kết quả tách DNA genome 32
3.2. Đa dạng di truyền các giống lúa bằng chỉ thị phân tử SSR 33
3.2.1. Số alen, hệ số PIC, tổng số băng thể hiện trên từng cặp mồi 33
3.2.2. Các alen hiếm và alen đặc trƣng 35
3.2.3. Tỉ lệ khuyết số liệu (M) và tỉ lệ dị hợp tử (H) của các giống lúa
nghiên cứu 39
3.2.4. Quan hệ di truyền giữa các giống lúa nghiên cứu 42
KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 45
TÀI LIỆU THAM KHẢO 47
CÁC CÔNG TRÌNH CÔNG BỐ……………………………………………55
nghệ sinh học mới đã cung cấp công cụ hữu hiệu hỗ trợ đánh giá sự biến đổi
di truyền ở cả hai cấp độ kiểu gen và kiểu hình. Chỉ thị phân tử là công cụ
mạnh mẽ trong việc đánh giá các biến dị di truyền, giải thích mối quan hệ di
2

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu http://www.lrc-tnu.edu.vn/

truyền trong và giữa các loài, hỗ trợ việc quản lý các nguồn tài nguyên di
truyền thực vật (Virk et al., 2000; Song et al., 2003; Teixeira da Silva., 2005).
Trình tự lặp lại đơn giản (SSR) là công cụ quan trọng để xác định sự
biến đổi di truyền nguồn gen (Powell et al., 1996; Ma et al., 2011). Nhờ có ƣu
điểm là đánh giá nhanh chóng, chính xác, cho đa hình cao và ổn định, do đó
chỉ thị SSR đƣợc sử dụng rộng rãi trong phân tích đa dạng di truyền, lập bản
đồ phân tử (Zhang et al., 2007;. Ma et al., 2011), xây dựng dấu vân tay DNA
(Xiao et al., 2006; Ma et al., 2011), kiểm tra độ tinh khiết di truyền (Peng et
al., 2003; Ma et al., 2011), phân tích sự đa dạng các nguồn gen (Zhou et al.,
2003; Jin et al., 2010; Ma et al., 2011.).
Để góp phần giúp nhận dạng các giống phục vụ cho công tác bảo tồn và
cung cấp thông tin hữu ích cho công tác chọn tạo giống lúa chất lƣợng cao
chúng tôi thực hiện đề tài: “Nghiên cứu quan hệ di truyền một số giống lúa
đặc sản, chất lƣợng, trồng phổ biến ở Việt Nam bằng chỉ thị phân tử
SSR”.
2. Mục tiêu nghiên cứu của đề tài
Nghiên cứu quan hệ di truyền của các giống lúa để phân loại và cung
cấp các thông tin về lúa đặc sản, chất lƣợng, trồng phổ biến ở Việt Nam cho
công tác bảo tồn, khai thác sử dụng và chọn tạo các nguồn gen quý.
3. Nội dung nghiên cứu
- Tách DNA genome của 60 giống lúa nghiên cứu
- Phân tích DNA genome với các mồi SSR xác định các mồi cho đa hình,
số lƣợng allele của mỗi mồi, hệ số PIC, hệ số dị hợp tử.

Triều Tiên), chịu rét cao, ít chịu sâu bệnh; Indica ( đƣợc trồng ở các nƣớc
nhiệt đới và cận nhiệt đới nhƣ Việt Nam, Thái Lan, Ấn Độ ặc
4

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu http://www.lrc-tnu.edu.vn/

điểm hạt dài, thân cao, mềm dễ đổ, chịu sâu bệnh, năng xuất thấp, mẫn cảm
với ánh sáng; Javanica ặc điểm trung gian, hạt dài, dày và rộng hơn hạt
của Indica, chỉ đƣợc trồng ở vài nơi thuộc Indonesia (Nguyễn Văn Lẫm,
1998). Loài Oryza gluberrima S. đƣợc trồng với một diện tích nhỏ thuộc Tây
Phi. Sự tiế ủa cây lúa gắn liền với sự tiế ủa loài ngƣời đặc biệt ở
châu Á.
Lúa là cây trồng rất cổ xƣa, có tính đa dạng về di truyền và hình thái hơn
các loại cây trồng khác, là cây trồng nhiệt đới, hoa tự thụ phấn và đƣợc coi là
cây ngắn ngày (cây hàng niên). Cơ bản lúa là một cây cạn thích nghi với điều
kiện nƣớc. Nói chung nó ít chịu hạn hơn và khi gặp hạn nó cũng bị hại nhiều
hơn các loài lƣơng thực khác. Lúa là loại cây trồng mẫn cảm với điều kiện
ngoại cảnh. Quá trình sinh trƣởng, phát triển và năng suất cây lúa chịu ảnh
hƣởng rất lớn của yếu tố môi trƣờng. Hiện nay, lúa đƣợc trồng ở những điều
kiện sinh thái và khí hậu khác nhau, tuy vậy những loài quan trọng đều ƣa ẩm,
sinh trƣởng và phát triển ở các vùng nhiệt đới và á nhiệt đới, thƣờng có đủ
ánh sáng và nhiệt độ nên nƣớc là yếu tố hạn chế năng suất chính (Bùi Huy
Đáp, 1999).
1.2. Lúa đặc sản
1.2.1. Khái niệm chung
Lúa đặc sản là loại lúa cho sản phẩm chất lƣợng cao và mang tín đặc
thù của vùng. Các giống lúa đặc sản có quy trình sản xuất ổn định và quảng
bá thƣơng hiệu mang tính chuyên nghiệp.
Ở Việt Nam, các giống lúa đặc sản nổi tiếng nhƣ: giống lúa Nàng thơm
Chợ Đào, giống lúa Huyết rồng của huyện Vĩnh Hƣng – tỉnh Long An, giống

6

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu http://www.lrc-tnu.edu.vn/

1.2.2. Ý nghĩa khoa học và giá trị kinh tế
Các giống lúa đặc sản là nguồn gen quý cho việc nghiên cứu, lƣu giữ
nguồn gen và phát triển các giống lúa mới có nhiều đặc điểm tốt nhƣ mong
muốn.
Về giá trị kinh tế, các giống lúa đặc sản là mặt hàng quý hiếm đem lại
lợi nhuận cao cho ngƣời sản xuất. Giống lúa hiện nay đang đứng hàng đầu
trên thế giới về chất lƣợng gạo và giá cao là giống lúa thơm Basmati giá bán
một tấn gạo đến hàng ngàn USD. Giống lúa thuộc hạng kế cận là Khaw Dawk
Mali có giá 800 USD – 1000 USD/tấn. Các giống lúa đặc sản khác cho gạo
với giá bán thấp hơn các loại gạo đặc biệt kể trên đây một ít nhƣng so với gạo
thƣờng cũng gấp đôi gấp ba nhƣ gạo dự, gạo tám.
1.2.3. Tình hình nghiên cứu lúa đặc sản trong nƣớc và thế giới
Ở nƣớc ta, trƣớc đây các giống lúa đặc sản đƣợc trồng để tự cung tự
cấp và phần lớn phục vụ Vua chúa. Ngày nay, lúa đặc sản còn là mặt hàng
xuất khẩu quan trọng, đem lại lợi nhuận cao cho ngƣời sản xuất. Vì vậy, trong
Nông nghiệp đã và đang thực hiện những mô hình sản xuất vừa có lãi vừa bền
vững trong môi trƣờng sinh thái trong lành. Trong đó, đặc biệt là mô hình làm
lúa thơm đặc sản bản địa ở nơi thích hợp. Nhƣ trồng lúa đặc sản Khẩu Mang
của huyện Đồng Văn đang đƣợc huyện chủ trƣơng mở rộng diện tích vừa để
tạo điều kiện giúp bà con nông dân phát triển kinh tế vừa tạo nền tảng tƣ duy
sản xuất hàng hóa của ngƣời dân trong huyện.
Gần đây, với sự phát triển của công nghệ sinh học, ở nƣớc ta các
chƣơng trình nghiên cứu và phát triển các giống lúa đặc sản chất lƣợng cao,
nguồn giống có nhƣ cầu lớn trong sản xuất đã và đang đƣợc quan tâm đặc
biệt. Những giống lúa thơm đặc sản hàng đầu nhƣ Basmati, Khaw dawk mali
đang đƣợc phục tráng giống theo phƣơng pháp mới (MAS – marker asisted

nhiệt độ hóa hồ và nhiệt độ bền thể gel là các đại lƣợng chủ yếu để đánh giá
8

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu http://www.lrc-tnu.edu.vn/

chất lƣợng nấu và ăn của gạo. Yoshihashi và cộng sự (2005) đã sử dụng chỉ
thị SSR để xác định giống lúa thơm Khao dawk mali đặc sản của Thái Lan.
Garland và cộng sự (1999) đã sử dụng các đoạn lặp lại (T)n trong đoạn RG28
để xác định các giống lúa thơm. Bao và cộng sự (2002, 2006) đã sử dụng các
mồi đặc hiệu SSR để nhân các đoạn lặp lại (CT)n có trong các gen Wx (gen
ghi mã cho enzyme tổng hợp Amylose), gen SBE (gen mã hóa cho enzyme
tổng hợp Amylopectin) và gen SSS (gen mã hóa cho enzyme tổng hợp tinh bột
hòa tan có trong nội nhũ lúa) để nghiên cứu sự đa dạng các microsatellites
trong các gen tổng hợp tinh bột ở lúa. Đồng thời, nhiều nhà nghiên cứu và xác
định hàm lƣợng amylose và amylopectin ở lúa (Ayre et al., 1997; Bergman et
al., 2001; Shu et al., 1999;…).
1.3. Lúa chất lƣợng
1.3.1. Khái niệm chung và nhu cầu thị yếu sử dụng lúa gạo ở các quốc gia
Chất lƣợng gạo là sự kết hợp của các đặc tính vật lý và hóa học đƣợc
yêu cầu cho việc sử dụng cụ thể của một ngƣời dùng cụ thể.
Chất lƣợng gạo là một đặc điểm rất phức tạp, chủ yếu đƣợc xác định
bởi bốn thành phần: Chất lƣợng xay xát, dáng vẻ bên ngoài, chất lƣợng nấu và
ăn, chất lƣợng dinh dƣỡng. Tiêu chuẩn chất lƣợng gạo cũng có biến đổi theo
thị yếu của từng vùng, từng dân tộc khác nhau. Ví dụ ở Nhật Bản, ngƣời ta
thích gạo tròn loại japonica, mềm, tƣơng đối dẻo khi nấu. Nhật Bản và Hàn
Quốc thích gạo có hàm lƣợng amylose thấp vì nó dẻo, mềm, bóng và có vị
ngọt. Ngƣời Thái Lan thì chuộng gạo dài loại indica, chà trắng, mềm nhƣng
giòn khi nấu. Trong khi ở Bangladesh, Ấn độ, Pakistan, Sri Lanka, Nigeria,
Liberia thích gạo đồ.
Các giống lúa có hàm lƣợng amylose trung bình, có cơm hơi dẻo và

(>2% amylose). Gạo tẻ có hàm lƣợng amylose rất thấp (2-9% amylose), thấp
10

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu http://www.lrc-tnu.edu.vn/

(9-20% amylose), trung bình (20-25% amylose) và cao (25-33% amylose). Tỉ
lệ amylose/amylopectin của gạo hoặc tinh bột đƣợc thể hiện rõ bằng cách xét
nghiệm hàm lƣợng amylose bằng phƣơng pháp so màu Iodine. Tinh bột dẻo
nhuộm màu nâu đỏ với Iodine, tinh bột không dẻo nhuộm màu xanh tím với
Iodine, và amylose nhuộm màu xanh với Iodine. Viện Nghiên cứu lúa quốc tế
(2003) đã phân loại gạo theo hàm lƣợng amylose nhƣ (bảng 1.1):
Bảng 1.1 Phân loại gạo dựa vào hàm lượng amylose
STT
Loại gạo
% Amylose
1
Nếp
1-2
2
Rất thấp
2-9
3
Thấp
10-20
4
Trung bình
20-25
5
Cao
25-35

(74,5 - 79
o
C).
Độ trở hồ xác định thời gian cần thiết để nấu gạo thành cơm. Điều kiện
môi trƣờng nhƣ nhiệt độ trong giai đoạn chín có ảnh hƣởng đến độ trở hồ.
Nhiệt độ cao trong giai đoạn tạo hạt sẽ làm cho tinh bột có độ trở hồ cao. Ở
nhiều quốc gia trồng lúa, ngƣời ta ƣa thích gạo có độ trở hồ trung bình. Độ trở
hồ (BEPT) đƣợc ƣớc lƣợng bằng trị số trải rộng dƣới tác dụng của dung dịch
kiềm (alkali spreading value), trong đó gạo có nhiệt độ hóa hồ thấp (BEPT
thấp) bị phân rả hoàn toàn; gạo có BEPT trung bình bị phân rả 1 phần; và gạo
với BEPT cao chỉ phồng lên trong dung dịch KOH 1,7%.
Bảng 1.2 Tương quan giữa nhiệt độ hóa hồ và độ tan rã của gạo trong môi
trường kiềm
Loại
Nhiệt độ (
o
C)
Giá trị tan rã trong môi
trƣờng kiềm (cấp)
Thấp
55-69
6-7
Trung bình
70-74
4-5
Cao
75-79
2-3
Nói chung, các giống lúa cổ truyền vùng nhiệt đới có BEPT trung bình,
ngoại trừ các giống Bulu (Ấn Độ) và các giống nếp thì có BEPT thấp (Juliano

cơm. Độ bền gel cứng liên hệ chặt với tính cứng cơm và thƣờng thấy rõ ở
những giống có hàm lƣợng amylose cao. Nói chung, gạo cứng cơm thì không
dẻo.
Lúa trồng ở các nƣớc khác nhau, thì có sự khác biệt rất lớn về sự liên
kết 3 đặc tính này của tinh bột (hàm lƣợng amylose, độ trở hồ và độ bền thể
gel). Lúa nhiệt đới hay Indica có các đặc tính tinh bột này biến động nhiều
hơn loại lúa japonica và javanica (Buler). Không có loại lúa japonica nào có
hàm lƣợng amylose cao và hầu hết chúng có BEPT thấp và gel mềm. Hầu hết
các giống Bulu có hàm lƣợng amylose trung bình, BEPT thấp, và gel mềm
(Bảng 1.4).

13

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu http://www.lrc-tnu.edu.vn/

Bảng 1.4. Phân loại các giống gạo tẻ (nonwaxy) ở các nước Á châu dựa trên
hàm lượng amylose, độ trở hồ - BEPT (kiểm định kiềm) và độ bền thể gel
Quốc gia
Số mẫu
Loại
Amylose (a)
Loại BEPT
cuối cùng (a)
Loại độ
cứng gel (b)
Ghi chú
Bangladesh
Burma
China
China – Taiwan

I,L
I,L
L>I
I,L
I>L
L
HI>I,L
L>I
I>HI
I,L>HI
S>M>H
M,S>H
S>M>H
S>H
S>M,H
S>M>H
S>M
H>S
S
-
S,M>H
(a) L: thấp
(Low).
I: Trung bình
(Intermediate)
HI: TB-cao
H: Cao (High)
(b) S: mềm
(soft).
M: Trung bình

78,46 + 3,61
79,98+2,61
2
Gạo trắng (%)
63,68+ 8,36
63,14+2,62
3
Gạo nguyên (%)
33,12+ 12,81
45,79+6,91
4
Chiều dài hạt (mm)
6,84+ 0,37
6,69+0,23
5
Tỉ lệ dài/ngang
3,23+ 0,22
3,21+0,14
6
Bạc bụng(%)
2,90+2,41
5,16+2,94
7
Amylose (%)
26,49+1,49
26,68+2,88
8
Độ trở hồ (cấp)
3,05+0,65
2,16+0,47

1.4. Tình hình nghiên cứu lúa chất lƣợng ở Việt Nam và trên thế giới
Trong những năm gần đây, chiến lƣợc chọn giống nhờ chỉ thị phân tử
đã đƣợc sử dụng để chọn những tính trạng mà việc thực hiện đo đếm ghi chép
rất khó khăn và tốn kém. Sự ƣu việt của chỉ thị phân tử đó là sự chọn lọc
không cần các số liệu hình thái và rất ít ảnh hƣởng bởi môi trƣờng và có thể
chọn lọc từ lúc cây còn non đã mang lại những thành tựu đáng kể cho công
tác chọn giống. Đối với chọn lọc tính trạng chất lƣợng nhờ chỉ thị phân tử đặc
biệt là ở lúa đã đƣợc quan tâm rất nhiều (Ayres et al., 1992; Hwang et
al.,1998; He et al., 1999). Hàm lƣợng amylose và mùi thơm là hai tính trạng
đƣợc quan trọng đối với chất lƣợng gạo, đặc biệt là đối với các giống lúa đặc
sản. Một số gen và chỉ thị phân tử liên quan đến hai tính trạng này đã đƣợc
xác định nhƣ các gen Wax cho hàm lƣợng amylose (He et al., 1999), một số
chỉ thị phân tử liên quan đến mùi thơm cũng đƣợc công bố nhƣ RG28 (Ahn et
16

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu http://www.lrc-tnu.edu.vn/

al., 1992). Các chỉ thị SSR nhƣ RM342, RM210, RM223, RM350 cũng đƣợc
xác định liên kết với gen thơm (Vanavitit et al., 2004).
Năm 2004, Jain và cộng sự đã phân tích mối quan hệ di truyền lúa
thơm và lúa chất lƣợng của Ấn Độ. Nghiên cứu này, đã sử dụng 30 chỉ thị
đánh dấu huỳnh quang trên 69 kiểu gen khác nhau. Kết quả cho thấy lúa
thơm và lúa chất lƣợng của Ấn Độ có sự khác nhau về mặt di truyền và là
sản phẩm của mô hình tiến hóa độc lập và lâu dài.
Năm 2007, Thomson và cộng sự đã phân tích đa dạng di truyền của
246 giống lúa bản và 64 giống lúa cải tiến địa của Indonesia sử dụng 30 chỉ
thị phân tử. Kết quả phát hiện 394 alen, trung bình 13 alen/locus, hệ số Pic
trung bình 0,66. Trong số 309 giống lúa nghiên cứu có 68% theo nhóm
indica, 32% là Japonica.
Nhận dạng giống và DNA của các giống lúa thơm là việc rất hữu ích