PHƢƠNG PHÁP TẠO HẠT NHÂN TẠO

I.Đặt vấn đề

Ở một số giống thực vật, việc duy trì nòi giống theo phƣơng thức thông thƣờng là khó
khăn và tốn nhiều thời gian, số lƣơng những loài này ngày càng ít, đôi khi có những loài
đi đến tuyệt chủng do điều kiện bất lợi. để khắc phục vấn đề này và tiến xa hơn nữa là
thƣơng mại hóa, các nhà khoa học không ngừng nghiên cứu, tìm ra các phƣơng pháp mới
nhƣ nuôi cấy mô, phôi vô tính, hạt vô tính,…
trong bài này chúng ta sẽ cùng tìm hiểu về hạt nhân tạo. II.Công nghệ tạo hạt nhân tạo

1. Khái niệm
Năm 1978, Murashige phát hiện đầu tiên về kỹ thuật hạt nhân tạo. Năm 1987,
Redenbaugh và cộng sự đã phát triển thành công kỹ thuật tạo hạt nhân tạo. Về cơ bản,
hạt nhân tạo giống hạt tự nhiên, có cấu tạo là phôi vô tính đƣợc bọc bởi lớp áo bên ngoài
là lớp gel dinh dƣỡng và có khả năng nảy mầm nhƣ hạt tự nhiên, điểm khác biệt là hạt
nhân tạo không có phôi nhũ.

Hình: Cấu tạo hạt nhân tạo
Năm 1988, McKersie và cộng sự đã tạo thành công hạt nhân tạo cây cỏ linh lăng,
65% hạt biến đổi sau bƣớc làm khô. Năm 1985, Kitto và Janick bọc hạt nhân tạo cà rốt
bằng polyxyethylene đạt tỷ lệ sống 3%. Janick (1988), tạo hạt nhân tạo thành công trên
cần tây. Gray (1987) thành công trên nho và cây cỏ nón. Năm 1988, lúa mì đƣợc tạo hạt
nhân tạo do Carman và cộng sự.

2. Mục đích
Sự biểu hiện thành công của việc tái sinh cây thông qua việc hình thành phôi
vô tính ở một loài thực vật đã mở ra một phạm vi ứng dụng mới đó là tạo hạt nhân tạo

có thể hình thành chồi và rễ.
Không giống nhƣ các tế bào eukaryote, hầu hết các tế bào thực vật đều có khả năng phát
triển thành phôi dƣới những điều kiện xác định.Williams và Maheswaran (1986) đã cho
rằng phôi vô tính có thể đƣợc hình thành từ một tế bào đơn hay từ cả cụm tế bào phôi,
tiến trình này khác với những quá trình tự nhiên khác và đƣợc gọi là quá trình hình thành
phôi vô tính.
Phôi vô tính rất giống phôi hữu tính ở hình thái và sinh lý nhƣng không có tái tổ hợp di
truyền.do đó tất cả những cây con tái sinh bằng con đƣờng này thì có vật chất di truyền
giống hệt các tế bào sinh dƣỡng đã sinh ra chúng. Đặc tính này của phôi sinh dƣỡng
không những cho phép thực hiện sự hông
nhân giống vô tính mà còn tạo ra những thay đổi chuyên biệt và trực tiếp để đƣa các
tính chất mong muốn vào các cá thể bằng việc chèn thêm những trình tự gen cố định
vào tế bào sinh dƣỡng. (Saiprasad, 2001).
Giống nhƣ các tế bào của mô phân sinh, các tế bào sinh phôi có các đặc tính cơ
bản nhƣ sau: tế bào nhỏ, có cùng một đƣờng kính, có hoạt động biến dƣỡng rất mạnh
mẽ, có cƣờng độ tổng hợp ribonucleic acid rất cao, có tế bào chất đậm đặc, không bào
rất nhỏ, nhân to, dễ nhận thấy, hạch nhân rất to và sậm màu, đặc biệt là các tế bào này
có một lƣợng lớn các ribosom, ty thể, lƣới nội chất nhỏ và có vách rất dày (Ammirato,
1987; Emons, 1994; Raghvan, 1983; Thorpe, 1988).
c. Sự phát sinh hình thái của phôi vô tính
Tất cả các phôi vô tính đều có cấu trúc lƣỡng cực, gồm có mô phân sinh của cả

khối mô có khả năng tạo phôi cao khi đƣợc cấy chuyền sang môi trƣờng mới sẽ phát
triển và tăng trƣởng thành phôi. Mô có khả năng phát triển thành phôi có thể đƣợc
phân biệt với mô không có khả năng phát triển thành phôi do màu trắng của phôi và
hoá đỏ khi nhuộm bằng acetocarmine. Dƣới ánh đèn tử ngoại các tế bào phôi có thể
phát huỳnh quang màu xanh lá cây.
Sự phát sinh phôi soma do cảm ứng
Hiện tƣợng này do sự nuôi cấy lỏng các tế bào và mô sẹo sau khi các mô này
chịu các xử lý đặc biệt đem lại sự cảm ứng khả năng tạo phôi. Ngƣời ta đã thực hiện
nhiều nghiên cứu trên nhiều loại thực vật ở các điều kiện nuôi cấy khác nhau để quan
sát khả năng tạo thành mô sẹo.
23
d. Những nhân tố ảnh hưởng đến sự hình thành phôi vô tính
Việc cảm ứng tạo phôi vô tính là một trong những công việc khá mới mẻ và rất
khó khăn. Để đạt đƣợc hiệu quả cao và thành công, việc tìm hiểu các điều kiện sinh lý,
hóa học tác động đến sự hình thành phôi là một công việc rất quan trọng.
╬ Mẫu cấy
Mỗi loại mẫu cấy có những khả năng cảm ứng tạo phôi khác nhau. Sự lựa chọn
mẫu cấy rất khắc khe, ví dụ, nhiều loài một lá mầm đòi hỏi mẫu cấy phải ở một giai
đoạn cụ thể nào đó của hợp tử phôi non thì mới hình thành mô sẹo từ đó tạo phôi vô
tính. Những bộ phận thích hợp đƣợc sử dụng để nuôi cấy tạo phôi Asparagus
officinalis, Lilium nhƣ chồi đỉnh, cuống lá, lóng thân, mầm, phôi chƣa trƣởng thành,
còn những bộ phận khác thì hiệu quả tạo phôi rất thấp (Hisato Kunitake, 1998).
╬ Môi trƣờng nuôi cấy
Gần 70% nghiên cứu thành công đều nhờ vào sử dụng môi trƣờng MS với hàm
lƣợng muối khoáng cơ bản (Ammirato, 1983; Litz và Gray, 1992; Thorpe, 1988). Lý
do vì môi trƣờng này có chứa hàm lƣợng muối nitrat và ammonia cao. Tỉ lệ giữa muối
nitrat và ammonia trong môi trƣờng rất quan trọng trong việc cảm ứng tạo phôi
(Niedz, 1993, 1994). Polyamine trong môi trƣờng dinh dƣỡng có hiệu quả kích thích
đến việc hình thành phôi vô tính (Minocha và Minocha, 1995). Những chất hữu cơ
khác nhƣ nƣớc dừa, casein thủy phân, tinh chất mạch nha (malt extract)… ở những

trong hơn 50% và 25% trƣờng hợp cảm ứng tạo phôi (Evans và cộng sự, 1983; Litz và
Gray, 1992). Có những sự khác biệt ở mức tế bào và mức độ phôi trong hoạt động
phân chia tế bào của các tế bào phôi vô tính và tế bào mô sẹo, cũng nhƣ là những sự
khác biệt trong sự phát triển hình thái của phôi vô tính đƣợc cảm ứng trên những chất
auxin khác nhau ( Rodrigeuz và Wetztein, 1998). Auxin đƣợc chứng tỏ cho thấy có
một tác dụng tích cực khi đƣợc sử dụng kết hợp với cytokinin và TDZ. Tuy nhiên ở
nồng độ auxin cao thƣờng hạn chế sự phát triển của phôi vô tính trong những giai đoạn
đầu tiên của sự phát triển phôi.
Cytokinin cũng có những tác dụng tƣơng đối lên sự hình thành phôi, nhƣng nó
không có những tác dụng đáng kể. Mặc dù vậy, sự kết hợp của cả auxin và cytokinin
cho thấy nhiều thuận lợi để đạt đƣợc hiệu quả cảm ứng phôi tối đa trên một số loài
(Cruz và cộng sự, 1990; Nishi, 1997). Tuy nhiên hiện nay, đã có nhiều nghiên cứu sự
25
dụng TDZ, chất điều hòa tăng trƣởng thuộc nhóm cytokinin, nhằm mục đích cảm ứng
tạo phôi vô tính ở một số thực vật hai lá mầm (Murthy và cộng sự, 1998). Vì vậy trong
những năm gần đây việc sử dụng TDZ đã trở nên phổ biến.
Môi trƣờng không có hormone thƣờng đƣợc sử dụng cho sự phát triển của phôi
vô tính từ dạng hình cầu cho tới khi phát triển thành cây con. Đôi khi, những nồng độ
thấp của hormone trong môi trƣờng cần cho sự biểu hiện hoặc trong môi trƣờng cần
cho sự phát triển thì có thể có lợi, thậm chí là bắt buộc phải có, tùy theo loài, để kích
thích sự phát triển bình thƣờng của phôi.
Tóm lại, để cảm ứng tạo một cấu trúc lƣỡng cực cần phải có tín hiệu của một
loại hormone. Ngƣợc lại, để cảm ứng tạo cơ quan thì phải có hai tín hiệu hormone
khác nhau: đầu tiên là tạo chồi, sau đó tạo rễ, sử dụng hai môi trƣờng khác nhau. Để
những tế bào phôi phát triển bình thƣờng thành những cây con thì cần một môi trƣờng
khác, có hoặc không có hormone.
╬ Thời gian xử lý
Khoảng thời gian mẫu cấy đƣợc xử lý với chất điều hòa tăng trƣởng là một
nhân tố quan trọng trong việc cảm ứng cũng nhƣ hình thành phôi vô tính một cách
bình thƣờng. Khi mẫu cấy đƣợc chuyển sang môi trƣờng không có nhân tố tăng

loại cây trồng và kiểu gen. Kiểu gen có một ảnh hƣởng to lớn trong việc cảm ứng tạo
phôi của hầu hết các loài thực vật. Không phải tất cả các thực vật đều có khả năng cảm
ứng tạo phôi. Đối với những cây tự thụ phấn, những giống cây khác nhau thì khả năng
phát sinh phôi vô tính cũng có thể khác nhau.
Đã có các thí nghiệm khác nhau tiến hành trên các loài có kiểu gen khác nhau để
khảo sát khả năng hình thành phôi vô tính. Chẳng hạn nhƣ ở cây Asparagus, ngƣời ta
đã quan sát khả năng tạo phôi vô tính trên các giống có kiểu gen khác nhau (Hisato và
Masahiro, 1998). Delbreil và Julien (1994) đã mô tả những khác biệt quan sát đƣợc từ
tần suất tạo phôi từ chồi dỉnh của 12 giống Asparagus có các kiểu gen khác nhau.
Những khác biệt về tần suất hình thành phôi ở các loài đa bội ( lƣỡng bội, tứ bội) cũng
đã đƣợc phát hiện ( Kunitake và cộng sự, 1992). Haensch và cộng sự (1996) đã quan
27
sát khả năng hình thành phôi vô tính và tái sinh cây ở những giống Lilium có kiểu gen
khác nhau.
╬ Cƣờng độ chiếu sáng
Các nhân tố khác trong môi trƣờng nuôi cấy nhƣ là cƣờng độ ánh sáng cũng có
ảnh hƣởng đến việc cảm ừng tạo thành phôi vô tính. Các nghiên cứu cũng đã baó cáo
về những ảnh hƣởng khác nhau của chế độ sáng và tối. Nhìn chung, chế độ tối đã cho
thấy có những ảnh hƣởng tốt hơn trong giai đoạn cảm ứng. Ở một số loài thực vật, sự
cảm ứng cần có những điều kiện ủ trong tối. Những điều kiện trong tối có thể đƣợc tạo
bằng cách bao môi trƣờng nuôi cấy bằng những tấm nhôm mỏng hoặc đặt chúng trong
hộp carton. Những nghiện cứu tạo phôi vô tính ở loài Gossypium kltzschianum và
L.longiflorum đạt đƣợc kết quả tốt khi nuôi cấy trong tối (Yuqiang Sun và cộng sự,
2003; Tribulato, 1997).
e. Những vấn đề thường gặp trong quá trình phát sinh phôi vô tính
Một vài vấn đề thƣờng gặp trong quá trình phát sinh phôi vô tính ở vài loại thực
vật là sự xuất hiện những phôi dị thƣờng. Các lá mầm có thể bị xoắn lại, mô phân sinh
chồi có thể có hình dạng không bình thƣờng hoặc có thể thiếu. Những trƣờng hợp này
cần phải có những thao tác phụ để thúc đẩy sự xuất hiện bình thƣờng và sự phát triển
của phôi bằng cách sử dụng nồng độ từ thấp đến vừa phải các chất điều hòa tăng

biệt hóa ở tế bào thực vật. Việc tạo thành công phôi vô tính ở một số loài thực vật, cả
hạt trần lẫn hạt kín, cây một lá mầm và hai lá mầm, đã mở ra nhiều triển vọng mới cho
29
nền công nghệ sinh học thực vật, tuy nhiên đây là một công việc khó khăn và khá mới
mẻ.
Hình 2.8 Chồi lan Hồ Điệp tái sinh từ phôi
f. Một số thành tựu tạo phôi vô tính
Phôi vô tính đã đƣợc nghiên cứu trên hơn 130 loài, bao gồm các loài ngũ cốc,
các loài cỏ, cây họ đậu và các cây có quả hình nón (Ammirato, 1983; Wann,1988).
Trong đó, việc nghiên cứu tạo phôi Lan cũng rất đƣợc các nhà khoa học quan tâm.
╬ Tạo phôi thông qua nuôi cấy protocorm lan Hồ Điệp (Jen Tsung Chen và
Wei Chin Chang, Đài Loan):
Jen-Tsung Chen và Wei-Chin Chang là 2 nhà nghiên cứu lan nổi tiếng ở châu
Á. Hai ông tiến hành nuôi cấy Protocorm lan Hồ Điệp trên môi trƣờng ½ MS không
bổ sung chất điều hoà sinh trƣởng. Sau 45 ngày nuôi cấy, 28.1% mẫu cấy hình thành
phôi, trung bình 1 mẫu hình thành 1 phôi.
Khi nuôi cấy thử nghiệm Protocorm lan Hồ Điệp trên môi trƣờng MS bổ sung
TDZ (0.45M, 4.54M, 13.62M), hai ông thấy rằng TDZ có ảnh hƣởng trực tiếp đến sự
hình thành phôi vô tính. Trong đó, môi trƣờng bổ sung TDZ nồng độ 13.62M cho hiệu
quả tạo phôi cao nhất: gần 100% mẫu protocorm hình thành phôi (45NSC). Trung bình
30
13.5 phôi/mẫu cấy… Ngƣợc lại, khi bổ sung thêm NAA (nồng độ 0.54M và 57.37M)
sẽ ức chế sự tạo phôi.
╬ Phƣơng pháp nuôi cấy tạo phôi lan Hồ Điệp từ cuống hoa (Ken Tokuhara và
Masahiro, Nhật Bản)
Theo báo cáo của hai nhà khoa học ngƣời Nhật này, khi nuôi cấy mẫu cuống
hoa trên môi trƣờng New Dogashima (NDM) có chứa (NAA 0,5µM + BA 4,4µM +
sucrose 29,2 mM) thì mô sẹo phát sinh phôi (embryo callus) sẽ đƣợc tạo thành sau 7
tháng nuôi cấy, với tỉ lệ 73% mẫu cấy hình thành embryo callus.
╬ Tác động của điều kiện nuôi cấy và cơ quan nuôi cấy lên sự hình thành

.2H
2
O nhờ vào sự trao đổi ion giữa ion Na
+
có trong
hỗn hợp sodium alginate với Ca
2+
có trong hỗn hợp CaCl
2
.2H
2
O. Vỏ bọc cứng nhiều hay
ít là phụ thuộc vào số lƣợng ion Na
+
trao đổi với ion Ca
2+
.
Do đó nồng độ của hai tác nhân tạo gel, sodium alginate và CaCl2.2H2O, và thời
gian cho việc tạo liên kết ion phải thật tối ƣu để có thể tạo thành vỏ bọc ở một độ cứng
thích hợp nhất. Không nhƣ phôi hợp tử, phôi vô tính thiếu lớp nội nhũ chứa chất dinh
dƣỡng bên ngoài nuôi phôi, do đó bằng việc thêm vào chất nền gel những chất dinh
dƣỡng, chất điều hòa tăng trƣởng, carbohydrate sẽ tạo một nội nhũ nhân tạo thích hợp tối
đa cho tăng trƣởng và sống sót của phôi (Gray, 1990; Gray và Purohit, 1991;
Redenbaugh và Walker, 1990). Ngoài ra nhằm tránh cho phôi bị mất nƣớc, hay các tổn
thƣơng cơ học, tăng sức đề kháng cho phôi ngƣời ta có thể thêm vào chất nền gel chất
kháng sinh, thuốc trừ nấm, trừ sâu, vi sinh vật.
Mặc dù việc tạo hạt nhân tạo từ cách bọc phôi vô tính bằng sodium alginate cho
thấy có một số thành công nhất định trong việc tái sinh cây con, vẫn còn nhiều vấn đề
khó khăn khi sử dụng vỏ bao alginate này, chất dinh dƣỡng có thể bị mất đi khỏi vỏ bao
(Redenbaugh và csv, 1987), sự trao đổi khí kém (Redenbaugh và csv, 1993)… Đã có một

Dùng dao cắt những chồi (shootbud) có kích thƣớc 2-3 mm từ cây nuôi cấy in vitro.

╬Với nguyên liệu là phôi vô tính
Dùng dao tách rời các phôi hình tim.

Bƣớc 2. Dùng pince cấy gắp các phôi/chồi cho vào môi trƣờng tạo vỏ alginate.
Bƣớc 3 Dùng pipette 10ml hút môi trƣờng alginate có chứa chồi/phôi nhỏ vào dung dịch
CaCl
2
.2H
2
O 100mM trong 15 phút.
Bƣớc 4.Dùng pince gắp hạt vào đĩa petri có chứa nƣớc cất vô trùng để làm sạch lƣợng
CaCl2.H2O còn sót lại. Bƣớc 5. Cấy hạt nhân tạo vào môi trƣờng nuôi cấy (MS không bổ sung các chất điều hòa
sinh trƣởng).

những vùng chuyên canh khoai tây để chế biến khoai sấy khô xuất khẩu.
Việc chiếu xạ bằng gamma tuy đã tạo điều kiện thuận lợi để “hạt” khoai tây tồn
tại ở môi trƣờng bên ngoài với điều kiện thiên nhiên khắc nghiệt, nhƣng cũng cần một số
biện pháp bổ trợ bởi “hạt” mỏng manh, dễ bị mất nƣớc và là miếng mồi béo bở của vi
sinh vật.
Trƣớc khi mang “hạt” ra trồng cần xử lý lạnh từ 4 - 6
o
C trong vòng một tuần, sốc
nhiệt 38
o
C trong vòng hai ngày hoặc xử lý bằng một số loại axit và chất bảo vệ thực vật. III. Ưu nhược điểm hạt nhân tạo
Ưu điểm
- Phôi phát triển nhanh, số lƣợng nhiều, có thể hạ thấp giá thành và tiết kiệm sức
lao động.
- Cây trồng đời sau mang ƣu thế của giống cây cố định, không hề thay đổi.

- Dễ dàng sử dụng trong quá trình vận chuyển, lƣu trữ và trồng.
- Thời gian bảo quản lâu hơn, khả năng phát triển hạt giống vẫn còn tốt cho khoảng
thời gian dài hơn.
- Sản phẩm đồng nhất về mặt di truyền
- Ứng dụng quy mô lớn, thích hợp cho độc canh quy mô lớn.
- Bảo tồn giống cây, để tránh sự tuyệt chủng của các loài có nguy cơ tuyệt chủng
- Tạo điều kiện nghiên cứu về chức năng vỏ hạt, hình thành nội nhũ trong phát triển
của phôi và nảy mầm hạt giống.
- Tăng năng suất cây trồng
-
Nhược điểm