a
VIỆN HÀN LÂM KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ VIỆT NAM
VIỆN CÔNG NGHỆ SINH HỌC NGUYỄN THỊ THANH NGA
NGHIÊN CỨU TẠO DÒNG CÂY DƯA HẤU
(CITRULUS LANATUS THUMB.)
CHUYỂN GEN KHÁNG BỆNH
VIRUS ĐỐM VÒNG PRSV
Viện Công nghệ Sinh học HÀ NỘI, 2015
VIỆN HÀN LÂM KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ VIỆT NAM
VIỆN CÔNG NGHỆ SINH HỌC Nguyễn Thị Thanh Nga NGHIÊN CỨU TẠO DÒNG CÂY DƢA HẤU
(CITRULUS LANATUS THUMB.)
CHUYỂN GEN KHÁNG BỆNH
VIRUS ĐỐM VÒNG PRSV
Chuyên ngành: Di truyền học
Mã số: 62 42 01 21
LUẬN ÁN TIẾN SỸ SINH HỌC
NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC: GS.TS. LÊ TRẦN BÌNH
Viện Công nghệ Sinh học
Nguyễn Thị Thanh Nga
ii
LỜI CAM ĐOAN
Tôi xin cam đoan:
Đây là công trình nghiên cứu của tôi, các số liệu và kết quả trình bày trong luận án
là trung thực, đã được công bố trên các tạp chí khoa học chuyên ngành với sự đồng
ý và cho phép của các đồng tác giả.
Hà Nội, ngày 7 tháng 01 năm 2015
Nghiên cứu sinh Nguyễn Thị Thanh Nga
1.2.4. Biện pháp phòng trừ ……………………………………………………
20
1.2.5. PRSV gây bệnh trên dưa hấu……………………………………………
20
1.3. Ứng dụng kỹ thuật RNAi trong tạo cây trồng chuyển gen kháng virus…
21
1.3.1. Kỹ thuật RNAi…………………………………………………………
21
1.3.2. Ứng dụng kỹ thuật RNAi trong tạo cây trồng kháng virus……………
26
1.3.3. Một số hạn chế của công nghệ RNAi và giải pháp……………………
28
1.3.4. Một số nghiên cứu chuyển gen tạo tính kháng virus cho dưa hấu ……
29 iv
Chƣơng 2. VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU…………….
31
2.1. Vật liệu, địa điểm nghiên cứu……………………………………………
31
2.1.1. Vật liệu thực vật…………………………………………………………
31
2.1.2. Chủng vi sinh vật, vector………………………………………………
31
2.1.3. Dụng cụ, thiết bị, vật tư…………………………………………………
32
2.1.4. Hóa chất…………………………………………………………………
33
59
3.2.1. Đánh giá khả năng sống sót của cây dưa hấu trên môi trường chứa chất
v
chọn lọc Km
59
3.2.2. Ảnh hưởng của nồng độ vi khuẩn (OD
600
) đến hiệu quả chuyển gen
60
3.2.3. Ảnh hưởng của thời gian biến nạp đến hiệu quả chuyển gen
61
3.2.4. Kết quả biến nạp gen gus vào dưa hấu …………………………………
63
3.2.5. Kết quả phân tích các dòng cây chuyển gen gus ……………………….
65
3.2.6. Kết quả chuyển gen gus vào cây dưa hấu
67
3.3. Kết quả biến nạp cấu trúc RNAi vào dưa hấu
68
3.4. Kết quả phân tích biểu hiện gen và đánh giá khả năng kháng virus của
các dòng cây chuyển gen
69
3.4.1. Phân tích các dòng cây chuyển gen T0
69
3.4.2. Phân tích các dòng cây chuyển gen T1
79
BAP
6 - Benzyl Amino Purin
IAA
Indol - 3 - Axetic Axit
IBA
3 - Indol Butyric Axit
NAA
α - Naptalen Axetic Axit
bp
Base pair
CP
Coat protein
Nib
Nuclear Inclusion Body protein
HC-Pro
Helper component-proteinase
dNTP
Deoxyribonucleotide triphosphate
EDTA
Ethylene diamine Tetra-acetic Acid
LB
Luria-Bertani
PCR
RT-PCR
Polymerase Chain Reaction
Reverse transcription polymerase chain reaction
RNAi
RNA interference
miRNA
microRNA
viii
DANH MỤC CÁC BẢNG
Trang
Bảng 1.1. Thành phần dinh dưỡng trong dưa hấu……………………………
9
Bảng 1.2. Danh sách các vi sinh vật gây hại chủ yếu trên dưa hấu …………
10
Bảng 2.1. Thành phần các loại môi trường tái sinh có bổ sung IBA và BAP…
36
Bảng 2.2. Thành phần các loại môi trường tái sinh có bổ sung IBA, BAP,
NAA……………………………………………………………………………
36
Bảng 2.3. Nồng độ GA
3
sử dụng trên MT kéo dài chồi……………………
69
ix
Bảng 3.11. Kết quả chuyển cấu trúc RNAi/CP-Nib-HCpro vào dưa hấu
72
Bảng 3.12. Kết quả lây nhiễm virus các dòng dưa hấu chuyển gen RNAi/Cp-
Nib-HCpro thế hệ T0 và WT
75
Bảng 3.13. Kết quả PCR phân tích các dòng dưa hấu chuyển gen thế hệ T1
80
Bảng 3.14. Kết quả lây nhiễm virus các dòng dưa hấu chuyển gen RNAi/Cp-
Nib-HCpro thế hệ T1 và cây WT
82
55
Hình 3.6. Kết quả tạo rễ cho chồi dưa hấu D2…………………………………
56
Hình 3.7. Kết quả thích ứng cây in vitro………………………………………
57
Hình 3.8. Một số hình ảnh về xây dựng quy trình tái sinh cây dưa hấu………
59
Hình 3.9. Ảnh hưởng của nồng độ vi khuẩn (OD
600
) đến biểu hiện gus
61
Hình 3.10. Ảnh hưởng của thời gian lây nhiễm đến biểu hiện Gus
62
Hình 3.11. Ảnh hưởng của thời gian đồng nuôi cấy đến biểu hiện gus………
62
Hình 3.12. Ảnh hưởng của thời gian đồng nuôi cấy và nồng độ vi khuẩn đến
biểu hiện Gus…………………………………………………………………
63
Hình 3.13. Hình ảnh chuyển gen gus vào cây dưa hấu
65
Hình 3.14. Biểu hiện bền vững của gus ở các dòng dưa hấu chuyển gen
66
xi
Hình 3.15. Kết quả điện di sản phẩm PCR với cặp mồi đặc hiệu nhân gen
nptII trên gel agarose 0,8%
67
Hình 3.16. Kết quả điện di sản phẩm PCR các dòng dưa hấu chuyển gen T
thế hệ T1
với cặp mồi đặc hiệu PRSV-CP-Fi / PRSV-HC-Ri
80
1
MỞ ĐẦU
1. Tính cấp thiết
Dưa hấu (Citrullus lanatus Thumb.) là cây trồng quan trọng có giá trị dinh
dưỡng và thương mại cao, được trồng phổ biến ở vùng nhiệt đới và cận nhiệt đới,
trong đó quá nửa diện tích được trồng ở vùng Đông Nam Á, châu Phi, vùng biển
Caribê và miền Nam nước Mỹ. Trong quá trình sản xuất dưa hấu, cây rất dễ bị
nhiễm các bệnh do vi khuẩn, virus hay do nấm gây ra, ảnh hưởng nghiêm trọng đến
năng suất và chất lượng quả. Trong các nguyên nhân gây bệnh, virus là một trong
những nguyên nhân chính làm giảm năng suất cũng như chất lượng dưa hấu.
Có hơn 10 loại virus gây bệnh khá nghiêm trọng cho dưa hấu, trong đó virus
đốm vòng đu đủ (papaya ringspot virus type W - PRSV-W) là một trong những
virus gây hại nặng nề nhất. Chiến lược kiểm soát virus chủ yếu dựa vào thuốc trừ
sâu để tiêu diệt các loại côn trùng truyền bệnh, sử dụng thuốc diệt cỏ để tiêu diệt cỏ
dại cũng như các thực vật khác mang mầm bệnh. Tuy nhiên, các phương pháp này
chỉ có tác dụng phòng bệnh, khi cây đã bị nhiễm virus thì các phương pháp kiểm
soát trên không còn tác dụng. Biện pháp có hiệu quả nhất trong việc phòng và
3.4. Phân tích cây chuyển gen và đánh giá khả năng kháng với PRSV Việt
Nam của các dòng cây chuyển gen thu được.
4. Những đóng góp mới của luận án
Luận án là công trình đầu tiên ở Việt Nam ứng dụng thành công nguyên lý làm
câm gen RNAi và kỹ thuật chuyển gen ở thực vật để tạo được các dòng dưa hấu
kháng bệnh đốm vòng đu đủ do PRSV gây ra. Khả năng kháng virus của dòng cây
chuyển gen đã được di truyền ổn định sang thế hệ T1.
Luận án đã đạt được các đóng góp cụ thể như sau:
1. Đã xây dựng được quy trình tái sinh vào 4 giống dưa hấu.
3
2. Đã tối ưu hóa được quy trình chuyển gen vào 2 giống dưa hấu nghiên cứu.
3. Chuyển thành công cấu trúc RNAi/CP-Nib-Hcpro vào 2 giống dưa hấu
nghiên cứu nhằm tạo tính kháng đối với PRSV Việt Nam.
4. Đã tạo được 2 dòng dưa hấu chuyển gen có khả năng kháng hoàn toàn với
PRSV Việt Nam, khả năng kháng virus của 2 dòng cây chuyển gen này đã
được di truyền ổn định sang thế hệ T1.
5. Ý nghĩa khoa học và thực tiễn của luận án
Kết quả nghiên cứu thu được trong luận án này là cơ sở khoa học cho việc
nghiên cứu tái sinh invitro, chuyển gen vào các giống dưa hấu khác có nguồn gốc
Việt Nam.
Bên cạnh đó, kết quả luận án đã khẳng định khả năng tiếp nhận đoạn gen
chuyển trong chuyển gen của 2 giống dưa hấu nghiên cứu (D2 và L2), làm cơ sở để
chuyển các gen mục tiêu theo những mục đích khác vào 2 giống dưa hấu này như
chuyển gen làm tăng tính chống chịu với điều kiện bất lợi của môi trường, chuyển
gen kháng các virus khác,…
Các dòng dưa hấu chuyển gen mang cấu trúc RNAi/CP-Nib-Hcpro có khả
năng kháng với PRSV tạo được trong nghiên cứu này rất có triển vọng để làm giống
hoặc lai tạo giống mới theo mục đích tạo giống kháng với PRSV.
6. Bố cục của luận án
xưa của Ai Cập hơn 4000 năm trước, hạt giống dưa hấu cũng được tìm thấy trong
các lăng mộ của các Pharaoh Tutankhamen. Từ Ai Cập, dưa hấu lan rộng ra khắp
các nước dọc theo biển Địa Trung Hải theo các chuyến tàu chở hàng. Đến thế kỷ 10
dưa hấu đã được du nhập vào Trung Quốc – một trong những quốc gia sản xuất dưa
hấu lớn nhất thế giới hiện nay. Đến thế kỷ 13, dưa hấu được tìm thấy ở châu Âu và
thế kỷ 16, dưa hấu được tìm thấy ở châu Mỹ. Thuật ngữ “watermelon” lần đầu tiên
5
được đề xuất bởi John Mariani vào năm 1615 trong từ điển thực phẩm và đồ uống
của Mỹ (Davis et al., 2004; Niao et al., 2005; Adrian, 2008). Ở Việt Nam, dưa hấu
được biết đến từ câu chuyện truyền thuyết Mai An Tiêm.
Citrullus colocynthis được xem là một trong những tổ tiên của dưa hấu hiện
nay. Loại dưa hấu này có quả nhỏ, đường kính tối đa là 7,5 cm, thịt quả màu trắng,
có vị đắng, hạt nhỏ có màu nâu. C. colocynthis là loại dưa hấu hoang dã được trồng
xen với sắn, ngô, khoai lang ở nhiều quốc gia ở miền Bắc và miền Đông của Châu
Phi như Ả rập, Nigieria, Ai cập, Iran, Namibia,… Tổ tiên của dưa hấu không có vị
ngọt, thậm chí đôi khi có vị đắng, thịt quả cứng và màu trắng giống như colocynthis
(Swain & Powell, 2004; Guner et al., 2004).
1.1.1.2. Phân loại
Dưa hấu thuộc: Bộ Cucurbitales
Họ: Cucurbitaceae
Chi: Citrullus
Loài: C. lanatus, C. colocynthis, C. ecirrhorus và C. sp
Tên tiếng Anh: Watermelon.
Tên Trung Quốc: Tây Hoa.
1.1.1.3. Đặc điểm hình thái
Dưa hấu là cây thân leo, có bộ rễ lan xa nên dù ở vùng khô cằn cũng có thể
cho ra loại trái cây chứa đến 90% nước, làm cho dưa hấu trở thành nguồn hyđrat
hoá quan trọng ở những nơi khan hiếm nước.
Quả dưa hấu có vỏ cứng, là loại quả phổ biến và có giá trị quan trọng nhất
phát triển, chất lượng dưa tốt, tốn ít công chăm sóc. Nơi đất cao, thoáng, không bị
bóng râm che, không bị gió bão, pH trong khoảng 5 – 7 là thích hợp để trồng dưa
hấu.
Dưa hấu có thể được trồng quanh năm ở những vùng gần xích đạo. Ở Việt
Nam, dưa hấu được trồng quanh năm ở các tỉnh phía Nam, tập trung vào các vụ
chính như: vụ dưa noel (gieo hạt tháng 9), vụ dưa hấu tết (gieo hạt tháng 11), vụ
dưa hè thu (gieo trồng trong suốt mùa mưa),… Ở miền Bắc, dưa hấu được trồng 2
vụ chính: vụ dưa hè thu (gieo hạt trong tháng 3) và vụ đông xuân (gieo hạt trong
tháng 10, một số tỉnh miền Núi phía Đông Bắc gieo hạt vào tháng 12).
7
1.1.1.5. Tình hình sản xuất dƣa hấu
Năm 2012, trên thế giới có khoảng 34,7 triệu ha diện tích trồng dưa hấu, giảm
2,88% so với năm 2011 (35,7 triệu ha). Trung Quốc là nước sản xuất dưa hấu lớn
nhất với khoảng 18,2 triệu ha (51,2%), tiếp theo là Thổ Nhĩ Kỳ (165 nghìn ha), Iran
(145 nghìn ha), Liên bang Nga (125 nghìn ha), Brazil (95 nghìn ha), Ukrane (61
nghìn ha), Ai cập (57 nghìn ha), Mỹ (50 nghìn ha),… Năng suất dưa hấu năm 2012
đạt 30,34 tấn/ha, tăng 4,37% so với năm 2010 (29,07 tấn/ha), sản lượng đạt 105,4
triệu tấn, tăng 0,67% so với năm 2011 (104,5 triệu tấn). Trong đó, Trung Quốc sản
xuất 70,2 triệu tấn (chiếm 66,6% tổng sản lượng dưa hấu trên toàn thế giới), đứng
sau Trung Quốc là các quốc gia như Thổ Nhĩ Kỳ 4,04 triệu tấn, Iran 3,8 triệu tấn,
Brazil 2,07 triệu tấn, Mỹ 1,77 triệu tấn, Ai cập 1,87 triệu tấn (FAO, 2014).
Năm 2012, Việt Nam có khoảng 31 nghìn ha (tăng 14% so với năm 2011 –
27,2 nghìn ha) diện tích đất trồng dưa hấu, năng suất trung bình đạt 15,16 tấn/ha
(tăng 6,39% so với năm 2011), tổng sản lượng đạt 470 nghìn tấn, tăng 0,43% so với
năm 2011 (FAO, 2014). Dưa hấu được trồng rất phổ biến ở vùng đồng bằng sông
Cửu Long đặc biệt là Long An và Tiền Giang, Quảng Ngãi, năng suất đạt từ 15-25
tấn/ha. Ở miền Bắc, dưa hấu được trồng nhiều ở một số tính như Vĩnh Phúc, Thái
Bình, Hải Dương, Hà Nội, Bắc Giang, Hòa Bình, Bắc Kạn,…
cung cấp nước cho cơ thể và làm thức ăn chăn nuôi.
9
Bảng 1.1. Thành phần dinh dƣỡng trong dƣa hấu
(nguồn: USDA)
STT
Thành phần
Giá trị dinh dƣỡng trong 100g
1
Năng lượng
127 kJ (30 kcal)
2
Đường
7,55 g
3
Chất xơ
0,4 g
4
Chất béo
0,15g
5
Protein
0,61g
16
Can-xi
7 mg
17
Sắt
0,24 mg
18
Magie
10 mg
19
Phốt pho
11 mg
20
Kali
112 mg
21
Kẽm
0,1 mg
22
Natri
1 mg
23
Folate
3 µg 10
1.1.2. Các loại bệnh hại dƣa hấu
Bệnh hại dưa hấu có thể gây ra bởi nấm, vi khuẩn, virus và một số tuyến trùng
Cháy lá
Nấm
8
Alternaria cucumerina
Cháy lá
9
Cercospora citrullina
Đốm và cháy lá
10
Phytophthora capsici
Thối quả, bạc lá, thối gốc
11
Sclerotium rolfsii
Thối gốc, hoa, quả, đốm
12
Sphaerotheca fuliginea
Bệnh phấn trắng
13
Colletotrichum orbiculare
Cháy lá, thân, quả, cuống lá
14
Botryosphaeria quercum
(Schw.)
Thối gốc
15
Cladosporium lagenarium
Vảy nấm
16
Corynespora cassicola
Đốm lá
Đốm sáng lá, quả
26
Erwinia spp.
Thối vỏ
Virus
27
Papaya ringspot virus type
W (formally watermelon
mosaic virus 1)- PRSV
Khảm lá và quả
28
Watermelon mosaic virus –
WMV
Khảm lá và quả
Virus
29
Zucchini yellow mosaic
virus – ZYMV
Khảm lá và quả
30
Tomato spotted wilt virus –
TSWV
Khảm lá
31
Cucumber mosaic virus - CMV
Khảm lá
32
Squash mosaic virus - SQMV
Khảm lá
Tuyến
Trong công tác kiểm soát các bệnh virus hại cây trồng, việc sử dụng các loại
thuốc kháng sinh là không có tác dụng. Các biện pháp kiểm soát chủ yếu nhằm vào
việc đề phòng virus thông qua việc tiêu diệt các vector truyền bệnh, thường dùng là
phun thuốc trừ sâu để tiêu diệt các loại côn trùng truyền bệnh, sử dụng thuốc diệt cỏ
để tiêu diệt cỏ dại cũng như các thực vật khác mang mầm bệnh, tạo tính kháng đối
với virus cho cây trồng. Khi cây đã bị nhiễm virus, các phương pháp kiểm soát trên
không còn tác dụng. Trong các biện pháp phòng bệnh virus hại cây trồng hiện nay,
biện pháp có hiệu quả nhất là tạo ra tính kháng đối với virus cho cây.
Do dưa hấu là loại cây trồng rất nhạy cảm với nhiều loài vi khuẩn, nấm và
virus gây bệnh nên việc cải thiện khả năng kháng bệnh của dưa hấu bằng kỹ thuật di
truyền đã và đang rất được quan tâm nghiên cứu. Khả năng kháng tự nhiên đối với
một số loại virus đã được xác định trong một số loài dưa hấu hoang dã, như kháng
WMV 2 (Xu et al., 2004), ZYMV (Ling et al., 2009; Xu et al., 2004) hoặc PRSV-w
(Strange et al., 2002; Guner et al., 2002), tuy nhiên quả của những loài dưa hấu này
lại có chất lượng kém, đòi hỏi phải mất nhiều năm để đánh giá, lựa chọn, lai tạo để
tạo giống có khả năng kháng được virus và chất lượng quả tốt. Các phương pháp
truyền thống đã tạo ra các giống dưa hấu có khả năng kháng bệnh thán thư, bạc lá,
bệnh héo do nấm Fusarium (Mohr, 1986; Crall et al., 1994), nhưng đối với một số
bệnh như bệnh đốm quả do vi khuẩn, bệnh đốm vòng đu đủ do PRSV, bệnh khảm
dưa hấu do WMV, bệnh khảm vàng bí xanh do ZYMV đang gặp rất nhiều khó khăn
Copyright: Tài liệu đại học ©