4

MỤC LỤC
LỜI CẢM ƠN 1
MỤC LỤC 4
DANH MỤC BẢNG 10
DANH MỤC HÌNH 11
MỞ ĐẦU 12
CHƢƠNG 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU 15
1.1. Tình hình nghiên cứu ô nhiễm kim loại nặng ở trong và ngoài nƣớc. 15
1.2. Tình hình ô nhiễm Asen. 18
1.2.1. Sơ lược về Asen. 18
1.2.2. Tình hình ô nhiễm Asen ở Việt Nam. 19
1.2.3. Ảnh hưởng của Asen đến sức khỏe của con người. 19
1.2.4. Xử lý ô nhiễm Asen trong đất. 20
1.2.4.1. Phương pháp xử lý truyền thống. 20
1.2.4.2. Phương pháp sinh học. 20
1.3. Cơ sở khoa học của chuyển gen ở thực vật. 22
1.3.1. Khái niệm chuyển gen 22
1.3.2. Các phương pháp chuyển gen ở thực vật. 22
1.3.2.1. Các phương pháp chuyển gen trực tiếp 22
1.3.2.2. Phương pháp chuyển gen gián tiếp 22
1.3.2.3. Các hệ thống vector chuyển gen thực vật. 25
1.3.2.4. Giới thiệu về vector pCAMBIA1301. 28
CHƢƠNG 2. VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 31
5

2.1. Vật liệu nghiên cứu 31
2.1.1. Chủng vi khuẩn sử dụng trong thí nghiệm 31
2.1.2. Vật liệu sinh học phân tử 31
2.1.3. Vật liệu thực vật 31

chọn lọc.
41
2.2.4.5. Tái sinh cây hoàn chỉnh 41
2.2.4.6. Ra cây trên môi trường đất : trấu : cát 42
2.2.5. Phương pháp phân tích cây chuyển gen 42
2.2.5.1. Phương pháp kiểm tra cây chuyển gen bằng PCR. 42
2.2.5.2. Lai Southern blot. 42
CHƢƠNG 3. KẾT QUẢ 47
3.1. Thiết kế vector chuyển nạp mang gen arsC 47
3.1.1. Sơ đồ vector pCAMBIA1301-arsC dự định thiết kế 47
3.1.2. Gắn gen arsC vào vector biểu hiện pCAMBIA 1301 47
3.1.3. Biến nạp pCAMBIA1301-arsC vào tế bào khả biến E. coli DH5α bằng
phương pháp sốc nhiệt. 49
3.1.4 Kết quả kiểm tra vector pCAMBIA1301 – arsC 50
3.1.4.1. Kết quả kiểm tra vector pCAMBIA1301-arsC bằng phản ứng PCR –
colony. 50
3.1.4.2. Kết quả kiểm tra vector pCAMBIA1301-arsC bằng enzyme giới hạn
NcoI và Eco72I 51
3.2. Biến nạp vector pCAMBIA1301 – arsC vào vi khuẩn A. tumefaciens. 53
3.3. Tạo cây thuốc lá chuyển gen arsC. 54
7

3.4. Kiểm tra cây thuốc lá chuyển gen đƣợc trồng ngoài tự nhiên 64
3.4.1. Kiểm tra cây thuốc lá chuyển gen bằng kỹ thuật PCR 64
3.4.2. Kết quả kiểm tra cây thuốc lá chuyển gen bằng Southern Blot. 65
KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 68
Kết luận 68
Kiến nghị 68
TÀI LIỆU THAM KHẢO 69
PHỤ LỤC

KLN
LB
MS
NAA
OD
PCR
RNA
SDS
SSC
Agrobacterium tumefaciens
Asen
Benzylaminopurine
Base pair
Cauliflower Mosaic Virus 35S
Cefotaxime
Deoxyribonucleic Acid
Deoxy Nucleoside Triphosphate
Ethylene Diamine tetra- acetate Acid
-glucuronidase
Kanamycin
Kilo base


 
Naphthalene Acetic Acid

Polymerase Chain Reaction
Ribonucleic Acid
Sodium dodecyl sulfate
Saline sodium sitrate

10

DANH MỤC BẢNG
Bảng 2.1. arsC 31
Bảng 2.2. -arsC NcoEco72I 37
Bảng 2.3. NcoEco72I 37
Bảng 2.4. arsC  38
Bảng 3.1.              
 61
11

DANH MỤC HÌNH
Hình 1.1.  18
Hình 1.2.  29
Hình 3.1. -arsC 47






 

Ita Cd
-1 mg.kg
-1
[25], [27]. 

 







KLN   LN  


13


 




Trong
  


     “Nghiên cứu
chuyển gen liên quan đến tích lũy Asen vào cây thuốc lá”. 


2. Mục tiêu nghiên cứu
arsC 
arsC.
3. Nội dung nghiên cứu
-       pCAMBIA1301-arsC  A.
tumefaciensC58
- arsC.
-  .
15

CHƢƠNG 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU
1.1. Tình hình nghiên cứu ô nhiễm kim loại nặng ở trong và ngoài nƣớc
Nước ngoài

 
 ZIP 1, ZIP 2,
IRT1 (ion-regulated transporter), AtNramp, AtNramp 3 (metal transpoter gene
family),       CAD1, GmPCS1 (phytochelatin
synthase) [47] MT1, MT2 

 [54].
ThePteris vittata 

  g/l) [50],
[60]. Cucumis
sativus)        
Woman - 
 [62].


       
    [53], [65].     
 

                 
Arabidopsis
Trong nước

- 


17





   [2], [7], [11], [12], [19],
[20], [22], [23]. 









3-
, As, As
3+
, As
5+


arsenate.

Hình 1.1. 
19

1.2.2. Tình hình ô nhiễm Asen ở Việt Nam

 
 





 





[35].


    
[34], [36].
1.2.4.2.Phương pháp sinh học




  
    
Bacillus 
 
[8], [32], [33], [40], [44]:
21

- Phyto-transformation): 

 u
gPopulus 
Myriophyllium spicatum

- Rhizosphere remediation


                

arsC 
1.3. Cơ sở khoa học của chuyển gen ở thực vật
1.3.1. Khái niệm chuyển gen




[14].
1.3.2. Các phương pháp chuyển gen ở thực vật
1.3.2.1. Các phương pháp chuyển gen trực tiếp
-  
- .
- .
- .
- .
1.3.2.2. Phương pháp chuyển gen gián tiếp
- .
- Agrobacterium tumefaciens.
23

Agrobacterium  1970.
Agrobacterium tumefaciens (A.tumefaciens


A. tumefaciens
Agrobacterium         
i

Trong chi Agrobacterium  A.tumefaciens      
Agrobacterium tumefaciens [61].

          
-DNA

-vir 

-


-plasmid.

A. tumefaciens.
              
-
vir 

         -   
-
 - A. tumefaciens 
vir 
25


vir A. Gen vir

vir 
protein vir vir B, C, E, F,
H.
vir D, vir 
-DNA. Protein D
2

Agrobacterium. -
26







OS promoter.







   -        







   nptII, gen bar   
uidA.

A. tumefaciens 
- -intergrate vector):

(4). -

-DNA (T-DNA transfer stimulator sequence: TSS). 
28


trong Agrobacterium. E. coli, 

--
 vir 

Agrobacterium [14]. 
 
pCAMBIA1301.
1.3.2.4. Giới thiệu về vector pCAMBIA1301



          



- Multi
cloning sites) [10]. 
-




