TRƯỜNG ĐẠI HỌC sư PHẠM HÀ NỘI 2 KHOA SINH - KTNN
LƯU THỊ NHƯ
PHÂN TÍCH MỐI QUAN HỆ DI TRUYỀN CỦA SÂM
LÀO (PANAX SP.) VÀ SÂM NGỌC LINH (PANAX
VIETNAMENSIS HA ET GRUSHV.) VỚI MỘT SỔ
LOÀI KHÁC TRONG CHI PANAX
KHÓA LUẬN TÓT NGHIỆP ĐẠI HỌC
• • • • Chuyên ngành:Thực vật học
Người hướng dẫn khoa học:
TS. NGUYỄN THỊ PHƯƠNG TRANG
TS. HÀ MINH TÂM
Hà Nội, 2013
LỜI CẢM ƠN
Trường ĐHSP Hà Nội 2 Khóa luận tốt nghiệp
Lưu Thị Như K35C - Sinh
Trong quá trình làm khóa luận, tôi đã nhận được sự hướng dẫn và giúp đỡ của
TS. Nguyễn Thị Phương Trang và TS. Hà Minh Tâm. Nhân dịp này, tôi xin bày tỏ
lòng biết ơn sâu sắc nhất tới các thầy cô.
Tôi xin trân trọng cảm ơn tập thể cán bộ phòng Hệ thống học phân tử và Di
truyền bảo tồn - Viện Sinh thái và Tài nguyên sinh vật đã tạo mọi điều kiện thuận lợi
và tận tình giúp đỡ tôi trong suốt quá trình tìm hiểu và nghiên cứu tại viện.
Trong quá trình thực hiện đề tài, tôi còn nhận được sự giúp đỡ của nhiều tổ
chức, cá nhân trong và ngoài trường. Nhân dịp này, tôi xin ưân trọng cảm ơn: Ban
chủ nhiêm khoa Sinh - KTNN - Trường Đại học Sư phạm Hà Nội 2; đặc biệt là sự
giúp đỡ, động viên của gia đình, bạn bè trong suốt thời gian tôi học tập và nghiên
cứu.
Một lần nữa, tôi xin trân trọng cảm ơn!
Hà Nội, ngày 10 tháng 05 năm 2013 Sinh viên
Lưu Thị Như
LỜI CAM ĐOAN
Để đảm bảo tính trung thực, khách quan của khóa luận, tôi xin cam

MEGA Phần mềm phân tích di ữuyền tiến hóa phân tử
NCBI Trung tâm thông tin công nghệ sinh học quốc tế
PCR Polymerase Chain Reaction (phản ứng chuỗi trùng hợp)
rDNA ADN ribosome
RE Restriction Enzyme (enzyme giới hạn)
RFLP Restriction Fragment Length Polymorphism DNA
Trường ĐHSP Hà Nội 2 Khóa luận tốt nghiệp
Lưu Thị Như K35C - Sinh
Simple Sequence Repeat (ưình tự các đoạn lặp đơn giản)
DANH LUC BẢNG
trang
và Panax vỉetnamensỉs với một số loài khác trong chi Panax trên
cơ sở phân tích trình tự vùng ITS- rDNA bằng phương pháp
Maximum Parsimony
Trường ĐHSP Hà Nội 2 Khóa luận tốt nghiệp
Lưu Thị Như K35C - Sinh
SSR
Bảng 1
Bảng 2
MUC LUC
• •
MỞ ĐÀU
Lý do chọn đề tài:
Sâm ngọc linh {Panax vỉetnamensỉs Ha et Grushv. 1985) được tìm thấy ở
Việt Nam và hiện đang được coi là loài đặc hữu hẹp, chỉ phân bố ở miền trung
Việt Nam (vĩ độ 14°15) ở độ cao trên 1800m so với mặt biển [18]. Sâm ngọc linh
được xác định là một cây thuốc quý về giá trị sử dụng cũng như giá trị nguồn gen
[16].
Nhiều công trình nghiên cứu về Sâm ngọc linh đã được triển khai, đặc biệt
từ năm 1985, thông qua sự hợp tác quốc tế hiệu quả, chủ yếu với các nhà khoa

được và so với Panax vietnamsis ở Quảng Nam, và các loài trong chi
Panax.
Ý nghĩa khoa học và thực tiễn
Ỷ nghĩa khoa học:
Góp phần bổ sung vốn kiến thức về đa dạng thực vật ở cấpđộ phân tử,
chuẩn bị cho các nghiên cứu tiếp theo về loài Sâm lào.
Ỷ nghĩa thực tiễn:
Đánh giá sự sai khác về mặt di truyền giữa cây sâm có nguồn gốc từ
Lào và Sâm ngọc linh của Việt Nam.
CHƯƠNG 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU
1.1 Giới thiệu về chi Sâm {Panax)
Chi Nhâm sâm (Panax L.) là một chi nhỏ trong họ Ngũ gia bì (Araliaceae).
Toàn bộ chi Sâm {Panax L.) trên thế giới đã biết chắc chắn có 11 loài và 1 dưới
loài (thứ -var) [23]. Sự phân bố của chi Panax L. trên thế giới cho thấy chúng chỉ
xuất hiện ở bắc bán cầu, kéo dài từ vùng rừng núi giáp bờ biển phía Đông của Bắc
Trường ĐHSP Hà Nội 2 1 Khóa luận tốt nghiệp
Lưu Thị Như K35C - Sinh
Mỹ bao gồm bắc Hoa Kỳ và Tây Nam Canada (có 2 loài P. quinquefolius và (P.
trỉỷolỉatus) . Vùng Đông Bắc Á (gồm viễn đông Nga, đông bắc Trung Quốc, bán
đảo Triều Tiên và Nhật Bản) có 2 loài p. ginseng và P. japonica. Trung tâm phân
bố của chi Panax L. có thể từ vùng Tây Nam của Trung Quốc lan tỏa xuống phía
Bắc của Việt Nam. Thực chất khu vực này gồm 2 tỉnh biên giới kề nhau là Vân
Nam (Trung Quốc) và Lào Cai (Việt Nam). Ở đây đang có tới 7 loài và thứ (dưới
loài) mọc hoàn toàn tự nhiên. Hai loài trồng là p. notogỉnseng nhập tò Bắc Mỹ và
p. pseudoginseng (không tìm thấy trong hoang dại nhưng giả thiết có nguồn gốc
từ vùng cận Himalaya hoặc là kết quả của lai tự nhiên giữa 2 loài gần gũi nào đó).
Đây có thể coi là trung tâm phân bố của chi Sâm {Panax L.) của thế giới. Ở Bắc
Mỹ hiện có 3 loài (P. notoginseng; p. quỉnqueỷolỉus và p. trỉỷolỉatus). Giới hạn
cuối cùng về phía Nam của chi Panax L. là loài Sâm ngọc linh (Panax
Vieừiamensis) ở miền trung của Việt Nam, tại 14°15 vĩ độ Bắc. Chính vì vậy Sâm

6 mm [12, 15] (Hình 2).
Sinh thái:
Sâm ngọc linh mọc dưới tán rừng ẩm, nhiều mùn, thích hợp với nhiệt độ
ban ngày từ 20 - 25°c, ban đêm 15 - 18°c, Sâm ngọc linh có thể sống rất lâu, thậm
chí trên 100 năm, sinh trưởng khá chậm.
Công dụng:
Bộ phận dùng làm thuốc chủ yếu là thân rễ, củ và ngoài ra cũng có thể
dùng lá và rễ con.
Sinh học:
Vào đầu tháng 1 hàng năm, Sâm xuất hiện chồi mới sau mùa ngủ đông,
thân khí sinh lớn dần lên thành cây sâm trưởng thành. Từ tháng 4 đến tháng 6, cây
nở hoa và kết quả. Tháng 7 bắt đầu có quả chín và kéo dài đến tháng 9. Cuối
tháng 10, phần thân khí sinh tàn lụi dần, lá rụng để lại 1 vết sẹo ở đầu củ sâm và
bắt đầu giai đoạn ngủ đông đến tháng 12. Chính căn cứ vào vết sẹo trên đầu củ
mỗi mùa đông đến mà người ta có thể nhận biết cây sâm bao nhiêu tuổi, phải ít
nhất 3 năm tuổi tức trên củ có 1 sẹo (sau 3 năm đầu sâm chỉ rụng 1 lá) mới có thể
khai thác, khuyến cáo là trên 5 tuổi [18, 20]. Mùa đông cũng là mùa thu hoạch tốt
nhất phần thân rễ của sâm.
Trường ĐHSP Hà Nội 2 1 Khóa luận tốt nghiệp
Lưu Thị Như K35C - Sinh
Hình 2: Sâm ngọc linh (Chụp tại vườn Sâm Đăc-Tô, Nam Trà My,
tỉnh Quảng Nam)
1.2.2. Phân bổ tự nhiên của Sâm ngọc linh (Panax vietnamensis)
Cho đến nay, Sâm ngọc linh mới chỉ phát hiện thấy ở cao nguyên Trung
phần, trong đó điểm phân bố tập trung vốn có (và quan trọng nhất) là núi Ngọc
Linh. Cụ thể là ở các xã Tê Xăng, Măng Ri, huyện Tu Mơ Rông; xã Mường
Hoong, Ngọc Linh, huyện Đăk Glei (tỉnh Kon Tum) và xã Trà Cang, Trà Linh,
Trà Nam, huyện Nam Trà My (tỉnh Quảng Nam).
Theo Hà Thị Dụng, cây sâm do Phạm Hoàng Hộ phát hiện ở núi Lang
Biang (tỉnh Lâm Đồng) năm 1970 cũng là Sâm ngọc linh [13].

ữồng trọt thuộc nhóm 1 lại cao hơn rất nhiều.
Từ năm 1985 đến năm 2000, thông qua sự hợp tác quốc tế hiệu quả, đặc
biệt với các nhà khoa học Ba Lan, Nhật Bản đã cho thấy Sâm ngọc linh có 52 hợp
chất Saponin, trong đó có 24 saponin đã được xác định là có cấu trúc hoàn toàn
Trường ĐHSP Hà Nội 2 1 Khóa luận tốt nghiệp
Lưu Thị Như K35C - Sinh
mới, lần đầu tiên được công bố. Khi so sánh với nhóm sâm trồng có giá tri trên
thế giới như Nhâm sâm (Panax ginseng), Sâm mỹ (P. quinquefolius) và Tam thất
(p. notoginseng) thì thành phần saponin của Sâm ngọc linh rất giống với 3 loài nói
trên, nhưng hàm lượng lại cao hơn nhiều [16, 17].
b. Thành phần hóa học
Từ năm 1974 - 1990 Nguyễn Thới Nhâm và cộng sự đã nghiên cứu Nhâm
sâm việt nam, so sánh với Nhâm sâm Triều Tiên {Panax ginseng), Nhâm sâm
nhật bản (Panax japonicus) và Nhâm sâm hoa kỳ (Panax quinquefollium) [17].
Kết quả có thể tóm tắt như sau:
Bằng phương pháp sắc ký lớp mỏng (SKIM) đã phát hiện trong Panax
vietnamensis 15 vết saponin có giá trị Rf (Rf: Hệ số di chuyển) và mầu sắc tương
ứng với 12 hợp chất saponin của Panax ginseng. Chi tiết hơn nữa trong Panax
vietnamensis có hàm lượng cao nhất saponin kiểu damarane (7.58%), trong đó
saponin thuộc diol và triol có tỷ lệ 32% và một lượng nhỏ saponin của axit
oleanolic. Điều này trái với quy luật chung là thông thường các cây nhâm sâm
cho thân rễ phát triển thì thường chứa lượng saponin của axit oleanolic và lượng
nhóm saponin damarane [17].
Cũng là lần đầu tiên trên thế giới, người ta chiết được 1 lượng lớn
majonozit R2 và ocotillol saponin trong cùng một loại Panax (chỉ riêng hai chất
này đã chiếm 4.34%) gấp 43 lần hàm lượng majonozit và ocotillol saponin cao
nhất có trong các loài chi Panax. Ocotillol saponin đã trở thành 1 hợp chất cần
chú ý có thể đưa thành tiêu chuẩn để phân loại hóa học cho các cây Panax vì nó
có thể ảnh hưởng đến một số tác dụng mang tính đặc thù của Panax vietnamensis.
Sự có mặt của damarane saponin kiểu ocotillol cũng còn làm cho Sâm Việt Nam

quan hệ giữa các loài là phân tích trình tự ADN, bởi vật liệu di truyền là duy nhất
cho mỗi cá thể bất chấp hình dạng ngoài của chúng và ít bị ảnh hưởng bởi tuổi,
Trường ĐHSP Hà Nội 2 1 Khóa luận tốt nghiệp
Lưu Thị Như K35C - Sinh
điều kiện sinh lý, yếu tố môi trường, thu hoạch, bảo quản và chế biến. ADN chiết
từ lá và củ đều mang cùng thông tin di truyền. ADN chiết thì ổn định và có thể
giữ ở -20°c trong thời gian dài (khoảng 3-5 năm), do đó loại bỏ sự giới hạn về
thời gian trong phân tích. Chỉ sử dụng một lượng ít mẫu cũng có hiệu quả, đây là
một thuận lợi trong việc phân tích mẫu có giới hạn [2, 9,21].
1.4. ứng dụng kỹ thuật sinh học phân tử
1.4.1 Thành tựu nghiên cứu về phân loại học phân tử
Ngoài nước: trong những năm gần đây, kỹ thuật sinh học phân tử đang
được áp dụng rộng rãi, có hiệu quả trong nghiên cứu tiến hóa, phân loại và đa
dạng di truyền quần thể sinh vật. Phương pháp chủ yếu dựa trên kỹ thuật phân
tích ADN. Các chỉ thị AFLP (đa hình độ dài các đoạn ADN khuếch đại), RFLP
(đa hình các đoạn cắt giới hạn), RAPD (đa hình các ADN Khuếch đại ngẫu
nhiên), SSR (trình tự các đoạn lặp đơn giản), cpSSR (trình tự lặp đơn giản), gen
mã hóa 18S - RNA, hay được sử dụng để đánh giá đa dạng di truyền, nhận dạng
các đoạn ADN hoặc các trình tự đặc trưng cho loài [23, 19]. Với số lượng bản sao
lớn trong hệ gen là điều kiện thuận lợi cho kỹ thuật PCR với các cặp mồi thích
hợp.
Vì thế chỉ trong vài thập kỷ, cơ sở dữ liệu gen (GenBank, 2007) đã lưu dữ
trên 70 triệu trình tự ADN với gần 90 tỷ nucleotit. Đây là nguồn dữ liệu có giá trị
trong sinh học bảo tồn (Conservation biology) vì bốn lý do chính là (1) số liệu về
trình tự các nucleotit rất có giá trị trong việc xác định các đơn vị bảo tồn giúp cho
đánh giá sắp xếp phân loại, nhất là bậc loài và dưới loài; (2) số liệu trình tự
nucleotit đảm bảo độ chính xác cao nên tạo cơ sở khoa học tốt nhất cho bảo tồn
đa dạng di truyền, trong nghiên cứu di ữuyền quần thể (population genetics), vì nó
bộc lộ rõ các biến đổi di ưuyền ở trong và giữa các quần thể, giữa các cá thể, giữa
cha mẹ và con cái ; (3) kết quả ADN cho phép xác định chính xác loài, quần thể

Trường ĐHSP Hà Nội 2 1 Khóa luận tốt nghiệp
Lưu Thị Như K35C - Sinh
kết quả có giá trị. Nhóm nghiên cứu của Nông Văn Hải đã thực hiện trên gen ty
thể (18S rRNA) để nghiên cứu phả hệ và giám định ADN một số loài lan Hài, đã
phát hiện ra mức độ tiến hóa của chúng [14]. Hay nhóm tác giả của đặng Tất Thế
(2003-2006) cũng sử dụng các nhóm gen này để phân tích sự tiến hóa phân tử và
phát sinh chủng loại của một số loài thú, bó sát quý hiếm của Việt Nam [27].
Nguyễn Thúy Hạnh (2006) [13]. Hay nhóm tác giả của Nguyễn Minh Tâm đã
dùng các chỉ thị SSR để đánh giá đa dạng nguồn gen cây vạn tuế của Việt Nam
làm cơ sở cho công tác di truyền [22].
Tuy nhiên, nghiên cứu các ứng dụng phương pháp phân tích ADN góp
phần vào việc phân loại mẫu thực vật đang còn ít.
1.4.2. Các bước trong phương pháp phân loại hiện
đại 1.4.2.1. Kỹ thuật PCR
Kỹ thuật PCR (Polymerase Chain Retion) được Karry Mullis và cộng sự
mô tả lần đầu tiên năm 1985 đã góp phần tạo nên một cuộc cách mạng trong sinh
học phân tử. Đây là phương pháp invitro để nhân bản nhanh một đoạn ADN nào
đó mà chỉ cần lượng mẫu ban đầu rất hạn chế (cỡ 10"
3
[xg). Kỹ thuật này có độ
nhạy rất cao và được ứng dụng trong nhiều lĩnh vực như sinh học phân tò, chuẩn
đoán bệnh, trong di truyền quần thể và phân tích pháp lý [29].
Trong nghiên cứu khoa học, kỹ thuật PCR rất hữu hiệu cho việc nhân bản
số lượng lớn các đoạn ADN, có thể sử dụng PCR để tách dòng đặc hiệu, giúp phát
hiện đột biến, cho phép phân tích gen từ các tế bào riêng lẻ, giúp nghiên cứu quá
trình tiến hóa ở mức độ phân tử. Thậm chí giúp phục hồi những gen đã tồn tại
cách đây hành chục triệu năm [30].
1.4.2.2. Đọc trình tự nucleotide
Phương pháp giải trình tự hiện nay được dùng phổ biến là phương pháp
Dideoxy hay còn gọi là phương pháp gián đoạn chuỗi (chain - determination

(NJ), (2) phương pháp Minimum Evolution, (3) phương pháp
Maximum Parsimony . Khoảng cách di truyền giữa các loài
cũng được ước lượng thông qua độ dài của cành cây [37,
38].
Trường ĐHSP Hà Nội 2 1 Khóa luận tốt nghiệp
Lưu Thị Như K35C - Sinh
CHƯƠNG 2: ĐỐI TƯỢNG, ĐỊA ĐIỂM, THỜI GIAN VÀ
PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN cứu
2.1 Đối tượng nghiên cứu
- Mầu lá và củ của Sâm thu được ở Lào (tạm gọi là Sâm lào - Panax sp.)
(Mầu Sâm lào do viện Dược liệu trung ương cung cấp. (hình 3).
- Mầu Sâm ngọc linh thu tại vườn trồng sâm Đak-Tô, huyện Nam Trà My,
Tỉnh Quảng Nam
Hình 3. Lá và củ Sâm lào (Mấu do Viện dược liệu TW cung cấp)
Hình 4. Mau Sâm ngọc lỉnh (vườn Sâm Đăk-tô, Nam Trà My,
Quảng Nam)
2.2 Nơi thực hiện nghiền cứu
Nghiên cứu được thực hiện tại phòng Hệ thống học phân tử và Di truyền bảo tồn,
viện Sinh thái và Tài nguyên Sinh vật, viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam
2.3 Thời gian nghiên cứu
Từ tháng 6/2011-5/2013
2.4 Phương pháp nghiên cứu
2.4.1 Tách ADN tổng số
Mầu lá (củ) củ tươi được nghiền trong nitơ lỏng (-196°C) thành dạng bột mịn.
Khoảng lOOmg bột nghiền được dùng để tách ADN, sử dụng Dneasy plant mini kit
(Qiagen, Đức).
Phương pháp chiết tách ADN gồm ba bước chính:
Bước 1: Phá màng tế bào và màng nhân bằng các tác nhân vật lý hay hoá học hoặc kết
hợp nhiều tác nhân, giải phóng ADN ra môi trường.
Bước 2: Loại bỏ thành phần không mong muốn trong mẫu (protein, lipid,

- Mồi ngược: PalTS-R: 5’- CTT ATT GAT ATG CTT AAA CTC AG - 3’. Chu
trình phản ứng PCR được chạy trong tổng thể tích 50|xl gồm 32|xl
H2O, 5 (0.1 đệm, 5 |xl dNTP, 3 (0.1 mồi xuôi F (30 pM), 3 (0.1 mồi ngược R (30 pM), 1
|J,1 ADN tổng số, 1 ^il enzyme Tag polymerase.
Chương trình chạy PCR được tiến hành theo chu kỳ nhiệt: 3 phút ở 95°c, 30 chu
kỳ (50 giây 95 °c, 1 phút 55 °c, 1 phút 72 °C) và sau đó là 1 chu kỳ ở 72 °c trong 5
phút.
Kiểm tra sản phẩm PCR bằng điện di trên gel agrarose 1% và tinh sạch bằng
Qiaquick gel extranction kit (Qiagen,Đức).
2.4.4. Đoc trình tư
• •
Sản phẩm PCR sau khi tinh sạch được sử dụng làm khuôn cho phản ứng giải
trình tự trực tiếp với mồi PalTS - F, sử dụng Bigdye terminator cycler và đọc kết quả
trên hệ thống ABI 3100 Avant Genetic Analyzer (Applied Biosystems.Mỹ).
2.4.5. Phân tích số liệu
Trình tự ADN của 2 loài Sâm lào và Sâm ngọc linh được so sánh, phân tích với
7 loài khác thuộc chi Panax và 1 loài ngoài nhóm (Aralia foliolosa) được dùng làm
tham chiếu (Bảng 3) sử dụng phần mềm Clustal w và MEGA
5.1
Bảng 1. Danh sách các trình tự sử dụng trong nghiên cứu
Ten khoa hoc Mã hiệu Genbank
1
Panax
quinquefolius
AY233328
2 Panax japonicus FJ980423
3 Panax japonicus var bipinnatifidus AY271921
4 Panax notoginseng JX680329
5 Panax pseudoginseng var bipinnatifidus AY271923
6

70ũbp
Hình 6. Kỉểm tra sản phẩm PCR bằng điện di trên gel agarose 1%
Giếng M: 1 OObp DNA ladder (invitrogen)
Giếng 1: Sản phẩm PCR từ lá Sâm ngọc linh
Giếng 2: Sản phẩm PCR từ mẫu lá Sâm lào