1
ĐẶT VẤN ĐỀ

Da là cơ quan lớn nhất của cơ thể có chức năng bảo vệ. Mặc dù chỉ
gồm 2 lớp mô chuyên biệt với hai loại tế bào chủ yếu là nguyên bào sợi và
tế bào sừng nhƣng việc tái tạo khi da bị tổn thƣơng vẫn còn là một thách
thức. Các tấm tế bào da nuôi cấy hoặc vật liệu tƣơng đƣơng da chế tạo từ
tế bào da nuôi cấy đã đƣợc ứng dụng trong điều trị bỏng, vết thƣơng mạn
tính …. Việc khắc phục các hạn chế đang đƣợc kỳ vọng vào vai trò tác
dụng của các tế bào gốc bởi chúng là những tế bào chƣa có chức năng
chuyên biệt, chúng có tiềm năng phát triển thành nhiều loại tế bào khác
nhau và có khả năng tự thay mới.
Tế bào gốc trung mô tồn tại trong tủy xƣơng, máu cuống rốn, dây rốn,
mô liên kết của cơ thể và ở các khoảng kẽ của nhiều cơ quan. Các tế bào
này có thể đƣợc nuôi cấy và nhân lên in vitro và dƣới các điều kiện thích
hợp chúng có thể cảm ứng biệt hóa thành các tế bào xƣơng, sụn, cơ và mỡ.
Hiện nay, tế bào gốc trung mô đƣợc coi là dạng tế bào quan trọng cho
công nghệ mô.
Trong liền vết thƣơng, tế bào gốc trung mô đƣợc xác định là chúng
biệt hóa thành các dạng tế bào da khác nhau. Tủy xƣơng là nguồn chính
của tế bào gốc trung mô nhƣng vấn đề thu tủy xƣơng gặp khó khăn và số
lƣợng ngƣới cho tủy xƣơng cũng hạn chế. Những vấn đề cần cân nhắc này
đã hạn chế các ứng dụng lâm sàng của tế bào gốc trung mô tủy xƣong.
Việc tìm kiếm các tế bào gốc trung mô từ nguồn mô khác đã đƣợc
quan tâm nghiên cứu trong những năm gần đây. Dây rốn là mô mềm có
chiều dài lớn và là cầu nối giữa thai và bánh nhau để trao đổi oxy, dinh
dƣỡng…cho thai. Các nghiên cứu phôi thai học và kháng nguyên bạch cầu
ngƣời (Human Leukocyte Antigen – HLA) của các tế bào từ dây rốn cho
thấy chúng có nguồn gốc từ thai nhi chứ không phải từ ngƣời mẹ.
Mô dây rốn là sản phẩm thải sau khi sinh và là một nguồn tƣơng đối

nguyên bào sợi trong môi trƣờng định hƣớng in vitro.
Bố cục luận án:
Luận án gồm 119 trang với 29 hình ảnh, 9 biểu đồ và 22 bảng, trong

3
đó: đặt vấn đề (2 trang); Tổng quan tài liệu (30 trang); Đối tƣợng và
phƣơng pháp nghiên cứu (23 trang); Kết quả nghiên cứu (36); Bàn luận (25
trang); Kết luận (2 trang); Kiến nghị (1 trang). Tài liệu tham khảo: 145 tài
liệu (tiếng Việt 29, tiếng Anh 116).

CHƢƠNG 1
TỔNG QUAN TÀI LIỆU
1.1. QUÁ TRÌNH LIỀN VẾT THƢƠNG
1.1.1. Diễn biến lâm sàng vết thƣơng, vết bỏng sâu
Thông thƣờng, các vết thƣơng liền trong vòng 4 – 6 tuần. Các vết
thƣơng khuyết da hoặc bỏng sâu toàn bộ lớp da thì quá trình liền vết
thƣơng đều phải trải qua quá trình hình thành mô hạt. Tùy thuộc vào diện
tích, độ sâu của vết bỏng, sức đề kháng của cơ thể, vết bỏng cơ bản tiến
triển theo ba giai đoạn đan xen và kế tiếp nhau là: Giai đoạn cấp tính, giai
đoạn tái tạo và giai đoạn hình thành sẹo.
1.1.2. Các tế bào chủ yếu tham gia liền vết thƣơng
Quá trình liền vết thƣơng có nhiều cơ chế phức tạp nhƣng kết quả
cuối cùng là tái lập lại các mô tế bào đã bị tổn thƣơng. Do đó quan niệm
mới trong điều trị các tổn thƣơng ở bất cứ cơ quan nào trong cơ thể là các
tế bào tổn thƣơng phải đƣợc thay thế bằng các tế bào khoẻ mạnh. Để duy
trì chức năng bảo vệ cơ thể, con ngƣời cần có da. Thành phần tế bào da
ngƣời chủ yếu gồm 2 loại là nguyên bào sợi và tế bào sừng.
1.1.2.1. Nguyên bào sợi
1.1.2.2. Tế bào sừng
1.2. GHÉP TẾ BÀO ĐIỀU TRỊ VẾT THƢƠNG

bào gốc thành các nhóm sau:
- Tế bào gốc phôi
- Tế bào gốc thai
- Tế bào gốc nhũ nhi
- Tế bào gốc trƣởng thành
- Tế bào vạn tiềm năng do cảm ứng
1.3.2. Ứng dụng tế bào gốc trong điều trị bệnh
1.3.3. Các tiềm năng ứng dụng tế bào gốc

5
1.3.4. Biệt hóa tế bào gốc thành các tế bào da dùng trong điều trị vết thƣơng
1.3.4.1. Biệt hóa tế bào gốc trung mô thành nguyên bào sợi
1.3.4.2. Biệt hóa tế bào gốc thành tế bào sừng
1.4. DÂY RỐN VÀ TẾ BÀO GỐC PHÂN LẬP TỪ MÀNG DÂY RỐN
Năm 2004, nhóm nghiên cứu tại Đại học Quốc gia Singapore đã
thành công trong việc xác định và phân lập đƣợc các TBG biểu mô và TBG
trung mô từ màng dây rốn. Cả hai loại tế bào gốc biểu mô và trung mô
màng dây rốn đều có 2 loại marker là: Oct 4 (Octamer 4) và Nanog
(Pluripotency Sustaining ES Cell Factor). Điều này gợi ý cho thấy tính gốc
của cả hai loại tế bào này cao hơn so với tính gốc của tế bào tuỷ xƣơng,
máu cuống rốn hay các tế bào gốc trƣởng thành khác.

CHƢƠNG 2
ĐỐI TƢỢNG VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
2.1. ĐỐI TƢỢNG NGHIÊN CỨU
Thỏ thí nghiệm bao gồm 02 lô:
Lô 1, gồm 15 thỏ dùng để đánh giá tính sinh miễn dịch của tế bào
gốc trung mô màng dây rốn ngƣời khi ghép dị loại.
Lô 2, gồm 30 thỏ dùng để đánh giá hiệu quả ghép tấm tế bào gốc
trung mô điều trị vết bỏng nhiệt thực nghiệm.

- Pipet Aid
- Tủ lạnh gia dụng
- Tủ lạnh âm 86
0
C và âm 152
0
C
- Tank Nitơ lỏng
- Thiết bị hạ nhiệt độ theo chƣơng trình hoặc hộp hạ nhiệt độ với cồn PIA.
- Nỉa, kéo
2.2.5 Các giá đỡ để tạo tấm vật liệu tƣơng đƣơng trung bì.
Màng Tegaderm chất liệu polyurethane do hãng 3M Health Care,
USA cung cấp đƣợc dùng để làm giá đỡ tế bào.
2.3. PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
2.3.1. Các phƣơng pháp nghiên cứu trong phân lập, nuôi cấy và biệt
hóa tế bào

7
2.3.1.1. Phân lập tế bào gốc trung mô
2.3.1.2. Cấy chuyển nhân rộng số lƣợng tế bào gốc trung mô dây rốn
2.3.1.3. Đánh giá khả năng tạo colony của tế bào
2.3.1.4. Xác định số lƣợng tế bào trong nuôi cấy
Số lƣợng TB đƣợc tính theo công thức: C = n/v (n: số lƣợng TB đã
đếm đƣợc trong buồng đếm, v: thể tích đếm (ml), C: mật độ TB (TB/ml).
Trong buồng đếm Neubaeur có thể tích 0,1mm
3
= 1.10
-4
ml do đó công
thức tính là:


Sơ đồ 2.1. Thiết kế nghiên cứu vết thƣơng bỏng thực nghiệm

Thỏ nghiên cứu
(n = 30)
Gây bỏng thực nghiệm
2 bên lƣng thỏ
Cắt lọc hoại tử
ở vết thƣơng bỏng
Vùng B (n = 30)
Đắp tấm vật liệu
Tegaderm không

1
x 10
3
) + (5 N
2
x 10
2
)
2
N
1
: Số lƣợng khuẩn lạc ở đĩa thạch cấy lúp 0,001.
N
2
: Số lƣợng khuẩn lạc ở đĩa thạch cấy lúp 0,01.
5: 5 ml nƣớc muối 0,9%.
2.3.2.7. Các chỉ tiêu theo dõi toàn thân
* Toàn thân
* Cân nặng thỏ
2.3.2.8. Các chỉ tiêu theo dõi tại chỗ vết thƣơng
- Theo dõi hàng ngày diễn biến
- Tính diện tích vết thƣơng
2.3.2.9. Các xét nghiệm huyết học và sinh hoá máu
- Xét nghiệm huyết học
- Xét nghiệm sinh hoá
2.3.2.10. Xác định hoạt độ enzym GOT trong huyết thanh 10
2.3.2.11. Xác định hoạt độ enzym GPT trong huyết thanh

mẫu
%
Mọc tế
bào
02
11,7
10
58,8
15
88,2
17
100,0
Tế bào
đạt 50%
00
00
05
29,4
14
82,3
16
94,1

Sau 4 tuần tất cả các mẫu mô đều mọc tế bào.
Theo dõi tế bào mọc ra khỏi mẫu mô nuôi cấy, thu tế bào bằng quy
trình tripsin và cấy chuyển đến P3-P4.

11
3.1.1.2. Khả năng tạo colony của tế bào gốc trung mô dây rốn
Bảng 3.3. Khả năng tạo colony của tế bào gốc trung mô ở P2

3.1.2. Biểu hiện kháng nguyên hòa hợp tổ chức và tính sinh miễn dịch
của tế bào gốc trung mô dây rốn
3.1.2.1. Đặc điểm biểu hiện HLA-G, HLA-E và HLA-DR của tế bào

Ảnh 3.6. Kháng nguyên HLA-G và HLA-E có trong dịch nghiền tế bào
gốc trung mô màng dây rốn được phát hiện bằng kỹ thuật western blot.
Mức độ biểu hiện HLA-DR trên bề mặt TBGTM màng dây rốn đƣợc
phân tích qua flowcytometry.

12 Biểu đồ 3.2. Kết quả phân tích bằng flowcytometry mức độ biểu hiện HLA-DR
của tế bào gốc trung mô màng dây rốn.
3.1.2.2. Tính sinh miễn dịch của tế bào gốc trung mô dây rốn

Biểu đồ 3.3. Phát hiện kháng thể thỏ kháng tế bào gốc với kháng
nguyên siêu nghiền bằng xét nghiệm ELISA 13

Biểu đồ 3.4. Phát hiện kháng thể thỏ kháng tế bào gốc với kháng
nguyên là tế bào nguyên vẹn
3.1.3. Khả năng biệt hóa của tế bào gốc trung mô thành nguyên bào sợi
3.1.3.1. Thay đổi về hình thái và dấu ấn tế bào trong quá trình biệt hóa
Bảng 3.4. Tỷ lệ % hình dạng tế bào biệt hóa qua các thế hệ tế bào
Thế hệ tế bào
Hình sao
Hình thoi

Đang phân
chia
Nhân quái
P5
70,7
26,2
3,1
00
P10
38,8
58,0
3,4
00
P15
17,4
80,9
1,7
00 3.1.3.2. Khả năng chế tiết collagen và tạo tấm vật liệu tƣơng đƣơng
trung bì của tế bào gốc trung mô
Bảng 3.7. Hàm lượng collagen hòa tan (µg/ml)
Mẫu xét nghiệm
Nhóm tế bào
Nhóm chứng
(TBGTM)
Nhóm nghiên cứu
(NBS biệt hóa)
P

Số lƣợng hồng cầu
(x10
12
/L)
5,56  1,67
5,67  1,69
5,84  0,12
Huyết tắc số
(g/L)
120,13  1,44
125,58  2,92
131,1  2,81
Hematocrit (%)
34,41  1,81
37,25  1,56
38,10  2,10
Số lƣợng bạch cầu
(x10
9
/L)
5,26  0,36
8,27  0,72
6,26  0,56
Bạch cầu N (%)
23,05  2,41
19,90  1,67
20,69  2,42
Bạch cầu L (%)
58,24  4,30
62,20  2,26

D5
26,53 ± 12,04
25,84 ± 11,40
0,601
D10
77,44 ± 12,24
68,76 ± 11,14
< 0,01
D15
93,23 ± 3,74
87,36 ± 4,78
< 0,001
Ngày thứ 10 và 15, diện tích vết bỏng của vùng A liền nhanh vùng B
rệt hơn (p<0,001).

16
Bảng 3.13. Tốc độ liền vết thương
Thời điểm
Diện tích vết thƣơng thu hẹp
(cm
2
/ngày)
P
Vùng A (n = 30)
Vùng B (n = 30)
Ngày thứ 1 - 5
0,93 ± 0,32
0,90 ± 0,29
0,488
Ngày thứ 5 – 10

D10
08,96  1,80
12,50  3,01
0,001

Số lƣợng tế bào viêm cả 2 vùng đều giảm theo tiến trình nghiên cứu.
Tại thời điểm 10 ngày nghiên cứu (15 ngày sau gây bỏng), vùng A có số
lƣợng tế bào viêm thấp hơn so với vùng B và sự khác biệt có ý nghĩa thống
kê (P<0,001).

17
Bảng 3.18. Thay đổi số lượng nguyên bào sợi tại mô vết thương

Thời điểm
Số lƣợng nguyên bào sợi/ĐVDT
Vùng A (n=30)
Vùng B (n=30)
P
D0
13,86  5,40
13,53  03,13
0,714
D5
37,20  8,26
36,56  9,35
0,76
D10
67,10  9,09
52,73  10,38
<0,001

1,53  0,50
1,47  0,51
0,189
D10
2,47  0,56
1,86  0,51
0,010

Tại thời điểm ngày nghiên cứu thứ 10, chỉ số phân bào tăng hơn so
với ngày thứ 5, đặc biệt vùng A tăng cao hơn so với vùng B có ý nghĩa
thông kê (p<0,01).

18
3.2.3. Vi khuẩn học vết thƣơng bỏng thực nghiệm
Bảng 3.22. Thay đổi mật độ Số lượng vi khuẩn vết thương
Thời điểm
Số lƣợng vi khuẩn (510
3
/cm
2
)
Vùng A (n = 30)
Vùng B (n = 30)
P
D0
05,67 ± 31,07
9,02 ± 28,40
0,575
D5
16,06 ± 37,15

4.1.2.1. Khả năng tạo colony của tế bào gốc trung mô dây rốn
Tỷ lệ colony trong tập hợp số tế bào tách ra khỏi mẫu mô đạt cao,
thấp nhất là 66% và cao nhất là 77%. Các mẫu nghiên cứu cho thấy, tế bào
gốc trung mô phát triển tốt và tạo ra số lƣợng lớn các colony (gần 30
colonies) và đƣờng kính của colony cũng đạt hơn 2mm.Nghiên cứu này
chỉ ra rằng tế bào gốc trung mô phân lập đƣợc duy trì khả năng di truyền.
Kích thƣớc colony lớn cũng gợi ý rằng chúng có khả năng tăng sinh và cả
khả năng di cƣ.
4.1.2.2. Tế bào gốc trung mô dây rốn có tính sinh miễn dịch thấp
Đặc điểm kháng nguyên HLA ở tế bào gốc trung mô dây rốn
Kết quả ở biểu đồ 3.2 cho thấy, trên 98% số tế bào thuộc quần thể
TBGTM màng dây rốn thể dƣơng tính với CD90 là một dấu ấn đặc trƣng
của TBGTM. Kết quả phân tích 15 mẫu TBGTM màng dây rốn cho mức
độ biểu hiện của HLA-DR chỉ ở mức 1,95 ± 1,53%.
TBGTM màng dây rốn trẻ sơ sinh bộc lộ các phân tử HLA-G và
HLA-E nhƣng không bộ lộ HLA-DR. Đặc điểm biểu hiện này về HLA có
thể là một phần nguyên nhân tạo nên tính sinh miễn dịch thấp của loại tế
bào gốc này.
Trong nghiên cứu này, tất cả các mẫu huyết thanh thỏ ở các thời điểm
đƣợc khảo sát là D15, D30 và D60 đều có hoạt tính kháng thể kháng
TBGTMMDRN đƣợc cấy ghép, chứng tỏ các tế bào này có tính sinh miễn dịch.

20
4.1.3. Biệt hóa tế bào gốc trung mô dây rốn thành dạng nguyên bào sợi

Trong nghiên cứu này, chúng tôi thu dây rốn trong điều kiện vô trùng
sau đó phân lập tế bào gốc theo phƣơng pháp nuôi cấy bám dính của mô.
Phƣơng pháp này đã đƣợc nhiều tác giả sử dụng để phân lập tế bào gốc
trung mô dây rốn và xác định đặc tính của chúng. Kết quả nghiên cứu
của chúng tôi tập trung vào quan sát các biến đổi hình thái của tế bào

4.2.2.2. Ảnh hƣởng đến quá trình viêm
Kết quả ở nhóm nghiên cứu cho thấy khi ghép tế bào thì phản ứng
viêm ở vết thƣơng đều giảm dần và giảm nhiều hơn so với vùng đối
chứng: ở ngày thứ 5 vết thƣơng tiết dịch ít và quanh vết thƣơng không
viêm nề trong khi đó vùng chứng còn tiết dịch nhiều và bề mặt vết thƣơng
vẫn có giả mạc (bảng 3.8).
4.2.2.3. Ảnh hƣởng đến quá trình biểu mô hoá vết thƣơng
Nghiên cứu này chỉ ra rằng vết thƣơng ghép tấm vật liệu tƣơng
đƣơng trung bỉ làm tăng chỉ số phân bào so với vùng chứng (bảng 3.17).
Kết quả cả sự tăng phân bào tế bào lớp mầm là trên thực tế vết thƣơng
quan sát thấy với vùng ghép tế bào thì vết thƣơng thu hẹp và đƣợc đóng kín
chủ yếu do biểu mô hoá. Kích thƣớc của quầng biểu mô đƣợc tính từ bờ mép
vết thƣơng ban đầu đến sát mép vết thƣơng ở thời điểm 10 ngày đều lớn hơn
so với vết thƣơng vùng chứng.
4.2.2.4. Ảnh hƣởng đến quá trình co rút vết thƣơng
Kết quả nghiên cứu ghép tế bào gốc trung mô màng dây rốn của
chúng tôi cho thấy tế bào gốc trung mô làm tăng nhanh quá trình biểu mô
hoá mà cụ thể là kích thƣớc mép biểu mô lớn hơn và chỉ số phân bào cao

22
hơn so với vùng chứng (bảng 3.17) trong khi đó ở vùng chứng không ghép
tế bào thì hiện tƣợng co rút vết thƣơng diễn ra sớm và mạnh hơn vùng
nghiên cứu.
Tóm lại: Qua phân tích các số liệu nghiên cứu và bàn luận trên đây
có thể đƣa ra nhận định những tác động chính làm liền vết thƣơng ở từng
loại vết thƣơng theo thứ tự sắp xếp nhƣ sau:
Vết thƣơng vùng đối chứng
1. Co kéo mạnh làm hẹp vết thƣơng.
2. Tổ chức hạt bình thƣờng
3. Biểu mô hoá bình thƣờng.

theo chúng tôi, các kết quả nghiên cứu ảnh hƣởng của ghép tấm tế bào tới
quá trình liền vết thƣơng chỉ do chính các tế bào đƣợc ghép lên vết thƣơng
quyết định.

KẾT LUẬN
Qua nghiên cứu biệt hóa tế bào gốc trung mô màng dây rốn để điều
trị vết thƣơng bỏng thực nghiệm chúng tôi rút ra một số kết luận sau:
1. Một số đặc điểm phân lập nuôi cấy, biệt hóa tế bào gốc trung mô
màng dây rốn.
- Tế bào phân lập từ màng dây rốn mọc đơn lớp trong điều kiện nuôi
cấy in vitro và có khả năng tạo cụm. Cụm của tế bào gốc trung mô ở dạng
CFU-F (Collony Forming Unit – Fibroblast).
- Tế bào gốc trung mô dây rốn có đặc tính sinh miễn dịch thấp. Các
tế bào có bộc lộ các phân tử HLA-G và HLA-E nhƣng không bộ lộ rõ
HLA-DR.
- Kháng thể đặc hiệu kháng tế bào gốc trung mô màng dây rốn ở thỏ
đƣợc ghép thấp và giảm dần từ ngày thứ 30 sau ghép.
- Tế bào gốc trung mô dây rốn có thể cảm ứng để biệt hóa thành
nguyên bào sợi trong môi trƣờng định hƣớng in vitro

24
2. Ghép tế bào gốc trung mô màng dây rốn trên mô hình vết thƣơng
bỏng là an toàn và có tác dụng tích cực trong điều trị vết thƣơng
- Quá trình biểu mô hóa tại vết thƣơng ghép tấm tế bào gốc trung mô
màng dây rốn có tác dụng thúc đẩy nhanh quá trình liền vết thƣơng.
- Mật độ nguyên bào sơn, tân mạch và chỉ số phân bào vùng nghiên
cứu tăng cao hơn so với vùng đối chứng.
- Tình trạng viêm ở vết thƣơng giảm nhẹ dần từ ngày nghiên cứu thứ
5 đến ngày nghiên cứu thứ 10.
- Ghép tấm tế bào gốc trung mô màng dây rốn vật liệu tƣơng