ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI
TRƢỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN
Nguyễn Nhƣ Trang
NGHIÊN CỨU ĐẶC ĐIỂM HÌNH THÁI VÀ PHÂN TỬ CỦA MỘT SỐ
CHỦNG TUYẾN TRÙNG KÝ SINH GÂY BỆNH CÔN TRÙNG Ở HỆ
SINH THÁI NÔNG NGHIỆP TÂY NGUYÊN
LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC Hà Nội - 2014ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI
TRƢỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN
nghệ Việt Nam, đã giúp đỡ và tạo mọi điều kiện thuận lợi nhất để tôi có thể thực
hiện được đề tài nghiên cứu luận văn này.
Tôi cũng xin gửi lời cảm ơn tới ThS. Lê Thị Mai Linh, Phòng Hệ thống học
phân tử và Di truyền bảo tồn, làm việc tại phòng Tuyến Trùng học - Viện Sinh thái
và Tài nguyên sinh vật, người đã trực tiếp hướng dẫn và giúp về mặt kỹ thuật phân
tử và các ý kiến tư vấn hết sức hiệu quả trong quá trình nghiên cứu.
Tôi xin được gửi lời cảm ơn tới Ban chủ nhiệm cùng tập thể các thầy, cô giáo
trong Khoa Sinh học, Đại học khoa học tự nhiên, Đại học Quốc Gia Hà Nội, nói
chung và Bộ môn động vật không xương sống nói riêng đã tận tình chỉ bảo, giúp đỡ
để tôi hoàn thành được chương trình khóa học.
Cuối cùng tôi muốn gửi lời cảm ơn sâu sắc nhất tới toàn thể gia đình, bạn bè
những người luôn bên cạnh giúp đỡ, là chỗ dựa tinh thần để tôi có thể hoàn thành
được luận văn này. Hà Nội, tháng 12 năm 2014Tác giả
Nguyễn Như Trang
ii
MỤC LỤC
MỞ ĐẦU 1
CHƢƠNG 1 - TỔNG QUAN TÀI LIỆU 4
3.3.2. Khả năng sinh sản của tuyến trùng trong ấu trùng G. mellonella 45
3.3.3. Hiệu lực gây chết của tuyến trùng S-DL13 đối với ấu trùng BSL 48
KÊ
́
T LUÂ
̣
N VA
̀
KIÊ
́
N NGH: 51
TÀI LIỆU THAM KHẢO 53
PHỤ LỤC 58
iv
BẢNG CHỮ VIẾT TẮT
EPN
:
Tuyến trùng ký sinh gây bệnh côn trùng
(Entomopathogenic nematodes).
VKCS
:
Vi khuẩn cộng sinh
IJs
:
Ấu trùng cảm nhiễm (Infective juveniles)
BSL
PTSH
:
vi
DANH MỤC BẢNG
Bảng 1.1: Danh sách các chế phẩm sinh học BIOSTAR 20
Bảng 1.2. Áp dụng phòng trừ sâu hại ở một số địa phương 20
Bảng 2.1. Các mồi đặc hiệu cho PCR 26
Bảng 2.2: Thành phần hỗn hợp cho PCR 26
Bảng 2.3: Chu trình nhiệt cho phản ứng PCR 26
Bảng 2.4: Thành phần hỗn hợp phản ứng xác định trình tự DNA 28
Bảng 2.5: Chu trình nhiệt của phản ứng xác định trình tự DNA 29
Bảng 3.1: Các chỉ số đo của loài S. siamkayai ở Việt Nam 36
Bảng 3.2: Bảng ma trận khoảng cách di truyền của mẫu nghiên cứu với các trình tự
đoạn gen 18S trên Genbank 40
Bảng 3.3: Bảng ma trận khoảng cách di truyền của mẫu nghiên cứu với các trình tự
gen D2-D3 trên Genbank 41
Bảng 3.4: Khả năng sinh sản của chủng S-DL13 trên ấu trùng BSL 46
Bảng 3.5: Hiệu lực gây chết ấu trùng BSL của chủng S-DL13 48
1
MỞ ĐẦU
Việt Nam là nước có khí hậu nhiệt đới gió mùa nên có sự đa dạng phong phú
mang truyền vi khuẩn gây bệnh. Chính vì vậy mà nhóm tuyến trùng này trở thành
tác nhân sinh học có nhiều ưu thế trong phòng trừ sinh học sâu hại như: phổ diệt sâu
hại rộng, khả năng diệt sâu nhanh, có khả năng tự sản sinh tăng số lượng sau khi đã
giết chết sâu hại và có thể sản xuất sinh khối lớn bằng công nghệ sinh học thích hợp
in vivo và in vitro.
EPN đã được nghiên cứu ứng dụng rộng rãi và thương mại hóa như những chế
phẩm sinh học ở nhiều nước như Mỹ, Úc, Canada, Trung Quốc, Nhật Bản, Thái Lan
[2]. Mặc dù nghiên cứu EPN ở Việt Nam chỉ mới được triển khai vài thập niên gần
đây, nhưng các kết quả nghiên cứu bước đầu cho thấy Việt Nam là một trong những
quốc gia có nguồn tài nguyên EPN phong phú và đa dạng, đồng thời đã đạt được
một số kết quả quan trọng trong việc điều tra phân loại và nghiên cứu, tuyển chọn
các chủng tuyến trùng có tiềm năng sinh học đưa vào sản xuất sinh khối và ứng
dụng vào thực tiễn trong phòng trừ sinh học sâu hại [3, 5]. Tuy nhiên, hầu hết các
chủng EPN ở Việt Nam chỉ tồn tại ở các hệ sinh thái rừng tự nhiên, rất ít các chủng
EPN được phân lập từ hệ sinh thái nông nghiệp. Vì vậy, việc điều tra phân lập nhóm
tuyến trùng này trong các hệ sinh thái nông nghiệp, đặc biệt hệ sinh thái nông
nghiệp Tây Nguyên là rất cần thiết.
Để có thêm dẫn liệu về tuyến trùng trong các hệ sinh thái nông nghiệp, chúng
tôi tiến hành đề tài nghiên cứu “ Nghiên cứu đặc điểm hình thái và phân tử của
một số tuyến trùng ký sinh gây bệnh côn trùng ở hệ sinh thái nông nghiệp Tây
Nguyên ” với các mục đích sau:
Xác định đặc điểm hình thái và phân tử của EPN ở hệ sinh thái nông nghiệp
Tây Nguyên.
Đặc trưng sinh học và tiềm năng sử dụng EPN trong phòng trừ sinh học.
Do hạn chế về thời gian và phạm vi nghiên cứu rất rộng, nên chúng tôi tập
trung nghiên cứu và xác định các tuyến trùng ký sinh gây bệnh côn trùng – EPN
trong hệ sinh thái cây công nghiệp trong hệ sinh thái nông nghiệp Tây Nguyên, cụ
thể tập trung với 2 loại cây công nghiệp chủ lực là cà phê và hồ tiêu.
3
Họ: Steinernematidae Chitwood & Chitwood, 1937
Giống: Steinernema Travassos, 1927
Giống: Neosteinernema Nguyen & Smart, 1994
Phân bộ: Rhabditina Chitwood, 1933
Dưới phân bộ: Rhabditomorpha De Ley & Blaxter, 2002
Liên họ: Strongyloidea Baird, 1853
Họ: Heterorhabditidae Poinar, 1976
Giống Heterorhabditis Poinar, 1976
Trên thế giới, tuyến trùng ký sinh gây bệnh côn trùng được biết đến từ những
năm 1923 khi Steiner lần đầu tiên mô tả một giống và loài tuyến trùng mới
5
Aplectana kraussei (Steiner, 1923). Đến năm 1927 giống này được đổi tên là
Steinernema (Travassos, 1927). Năm 1929, Steiner phát hiện và mô tả một giống
mới và đặt tên là Neoaplectana glaseri [37]. Sau rất nhiều tranh cãi về việc sắp xếp
giống Neoaplectana riêng biệt hay synonym với Steinernema, và tất cả các nhà
phân loại học cũng chấp nhận Neoaplectana là synonym với giống Steinernema
(Hunt, 2007) [24]. Năm 1955, Dulky và Hough đã sử dụng ấu trùng BSLlàm vật
chủ để nhân nuôi loài S. feltiae với số lượng lớn [19]. Năm 1975, Poinar [33] đã
phát hiện ra một loài mới thuộc một giống mới có khả năng ký sinh gây bệnh trên
côn trùng là loài Heterorhabditis bacteriophora thuộc giống Heterorhabditis. Sau
đó giống Neosteinernema Nguyen & Smart, 1994 [27] đã được mô tả thêm cho
nhóm EPN. Năm 2000, Ganguly và Singh đã phân lập một loài tuyến trùng kí sinh
gây bệnh côn trùng mới, Steinernema thermophilum từ vùng nông thôn ở New
Delhi, Ấn Độ. Năm 2001, Steinernma pakistanense được Shahina et al., mô tả là
loài mới. Loài này được tìm thấy trong các mẫu từ các vùng khác nhau của
Pakistan. Năm 2004 Mutsuhiro Yoshida đã nghiên cứu và mô tả 1 loài EPN mới,
Steinernema litorale đã được phân lập từ các mẫu đất cát ở Nhật bản. Năm 2005
Qiu et al., đã nghiên cứu và mô tả một loài EPN mới là Steinernema akhursti được
thu thập từ các mẫu đất tại tỉnh Yunan, Trung Quốc. Năm 2006 Khương B. Nguyễn
hình thái để phân biệt chúng. Một số kỹ thuật phân tử đã được sử dụng trong định
loại EPN như: isozyme, protein tổng số hay kỹ thuật miễn dịch và phương pháp
nghiên cứu dựa trên PCR-RFLP được sử dụng rộng rãi cho định loại tuyến trùng.
Những kỹ thuật hiện đại hơn cũng đã được áp dụng như phương pháp RAPD có thể
được sử dụng để định loại chủng. Tuy nhiên, phương pháp giải trình tự DNA là
phương pháp tỏ ra ưu việt hơn cả về phương diện yếu tố kỹ thuật và phạm vi áp
dụng trong hệ thống học cũng như phát sinh chủng loại. Giải trình tự DNA vừa đạt
được độ nhạy cao nhờ được nhân bản qua PCR, hơn nữa lại là phương pháp chính
xác nhất nhờ khảo sát trực tiếp trình tự nucleotide của phân tử mang thông tin di
truyền. Hominick et al., (1996) đã đề xuất kỹ thuật phân tử dựa trên các đặc điểm
phân tử của các loài giúp cho việc phân loại đến loài và nhóm loài chính xác hơn.
Phương pháp này sử dụng kỹ thuật PCR để nhân vùng gen ITS-rADN của tuyến
7
trùng rồi sau đó giải trình tự và so sánh trình tự giữa các loài với nhau. Cho đến nay,
phương pháp này được sử dụng khá phổ biến trong các nghiên cứu về các loài tuyến
trùng mới. Dựa trên các dữ liệu về hình thái và phân tích vùng ITS của rDNA
Nguyen et al. (2004) đã công bố hai loài tuyến trùng mới trong là Heterorhabditis
mexicana phân lập ở Mexico [28] và loài Steinernema yirgalemense phân lập từ
Yirgalem (Nguyen et al., 2004) [29].
Năm 2004, Spiridonov et al sau khi phân tích mối quan hệ phát sinh chủng
loại vùng gen ITS1-5.8S-ITS2 của rADN của các loài tuyến trùng Steinernema đã
phân chúng ra thành 5 nhóm có mối liên hệ về hình thái ấu trùng cảm nhiễm: (i)
Nhóm „carpocapsae-scapterisci-tami‟ với chiều dài IJs nhỏ hơn 600μm, có 13 loài.
(ii) Nhóm „affine-intermedium’ với chiều dài cơ thể IJs từ 600-700μm, nhóm này
có 3 loài. (iii) Nhóm „feltiae-kraussei-oregonense‟ với chiều dài cơ thể IJs từ 700-
1000μm, nhóm này có 21 loài. (iv) Nhóm „arenarium-glaseri-karii-
longicaudum‟ với chiều dài cơ thể IJs lớn hơn 1000μm, nhóm này có 11 loài. (v)
Nhóm „bicornutum-ceratophorum-riobrave‟ có cấu trúc mấu đôi ở vùng môi IJs,
nhóm này có 7 loài.
khoa học đã điều tra, phân lập, mô tả đặc điểm hình thái và sinh học, mô tả cơ chế
xâm nhập và phát triển của EPN. Một số loài EPN đã được nghiên cứu về khả năng
diệt sâu hại để ứng dụng trong thực tiễn phòng trừ sinh học. Đến nay, các nhà khoa
học Việt Nam đã phân lập được hơn 70 chủng EPN từ các vùng sinh thái khác
nhau [7]. Kết quả phân loại đã xác định được 11 loài, trong đó có 9 loài thuộc
giống Steinernema là S. tami, S. sangi, S. thanhi, S. loci, S. robustspiculum, S.
cumgarense, S. eapokense, S. sasonense, S. backanense, và 2 loài thuộc giống
Heterorhabditis là H. indica và H. baujardi.
Phan Ke Long et al., (2001) đã nghiên cứu và mô tả 2 loài tuyến trùng mới
thuộc giống Steinernema (Rhabditida): Steinernema loci và S. thanhi được phân lập
từ các mẫu đất bãi biển ở 2 tỉnh Thanh hóa và Hà Tĩnh. Sự kết hợp các nghiên cứu
về hình thái học và dữ liệu phân tích rDNA-RFLP cho thấy sự khác biệt của 2 loài
này với các loài Steinernema khác. Các đặc điểm hình thái ấu trùng cảm nhiễm tuổi
3 của Steinernema loci gồm: chiều dài cơ thể từ 896 - 1072 μm, khoảng cách từ đầu
9
đến lỗ bài tiết từ 71 - 86 μm, chiều dài đuôi từ 66 - 83 μm, 9 đường bên riêng biệt.
Các đặc điểm hình thái ấu trùng cảm nhiễm của Steinernema thanhi gồm: chiều dài
cơ thể 720-960 μm, khoảng cách từ đầu đến lỗ bài tiết 68-84 μm, chiều dài đuôi 52-
72 μm, 9 đường bên. Phân tích RFLP cho thấy Steinernema thanhi có thể phân biệt
từ loài S. arenarium bởi 9 enzym giới hạn, từ loài S. glaseri bởi 11 enzym, và 4
enzym từ loài S. loci.
Bằng việc mô tả các đặc trưng về sinh thái và phân tích RFLP vùng trình tự
ITS r-DNA, Phan Ke Long et al., (2001) đã đưa ra 1 loài tuyến trùng Steinernema
mới được thu thập tại tỉnh Thanh hóa, S. sangi. Loài mới này có một đặc điểm
tương đồng với loài S. kraussei là ấu trùng cảm nhiễm cùng có 8 đường bên, nhưng
chiều dài cơ thể lại ngắn hơn (753 và 951 μm), khoảng cách từ đầu đến lỗ bài tiết
ngắn hơn (51 và 63 μm), chiều dài gai giao cấu dài hơn (63 và 49 μm). Việc phân
tích RFLP cũng cho thấy sự khác biệt giữa 2 loài này bởi 9 enzym giới hạn.
Phan Ke Long et al., (2003) đã nghiên cứu sự phân bố của các chủng tuyến
nhú môi. Trên đỉnh đầu có 4 nhú đầu. Hai cơ quan thụ cảm hóa học (amphids) nhỏ,
nằm đối xứng và lùi về phía sau nhú môi. Xoang miệng ngắn và rộng, hình phễu,
vách xoang miệng được kitin hóa tương đối mạnh, lỗ miệng hình tam giác. Thực
quản rõ ràng, phần trước thực quản thường có dạng hình trụ, diều giữa thực quản
hơi phồng, phần eo thắt không điển hình, phần gốc thực quản hình quả lê, van thực
quan tiêu giảm. Vòng thần kinh rõ và thường nằm ở phần eo thắt hoặc phía trước
gốc thực quản. Lỗ bài tiết rõ ràng nằm trước vòng thần kinh. Âm hộ (vulva) hình
khe, nằm ở giữa cơ thể, mép âm hộ thường lồi lên và thường có cấu tạo màng vulva.
Đuôi ngắn, chiều dài đuôi thường ngắn hơn chiều rộng cơ thể tại hậu môn.
Con đực: Kích thước cơ thể nhỏ hơn con cái. Cơ thể cong về phía bụng hình
chữ J khi xử lý nhiệt. Vùng đầu luôn có 6 nhú môi và 4 nhú đầu, tạo thành vòng
tròn bao quanh miệng. Cấu tạo phần thực quản, lỗ bài tiết, vòng thần kinh giống
như ở con cái. Tinh hoàn dạng đơn, gấp khúc về phía bụng. Có một đôi gai giao cấu
và một đôi gai đệm. Gai đệm ngắn hơn gai giao cấu. Vùng đuôi thường có 1 nhú
đơn lớn và 10 đến 14 cặp nhú sinh dục, không có cánh đuôi. Tận cùng mút đuôi
tròn, hình chóp hoặc nhọn.
Ấu trùng cảm nhiễm: Ấu trùng cảm nhiễm là ấu trùng tuổi 3 nhưng luôn được
bao bọc bởi lớp vỏ của ấu trùng tuổi 2. Cơ thể cong về phía bụng và thon nhỏ về hai
đầu. Đường bên thường có từ 1- 9 đường, tùy thuộc vào từng loài. Thực quản và
ruột thường tiêu giảm. Lỗ bài tiết rõ ràng nằm trước vòng thần kinh. Vòng thần kinh
điển hình, thường nằm ở phần eo thắt của thực quản. Vi khuẩn cộng sinh nằm phía
12
trước ruột, sau thực quản. Lỗ miệng và hậu môn khép kín. Đuôi dạng chóp hoặc
dạng chỉ. Phasmids nằm ở khoảng giữa của đuôi, hơi nhô lên hoặc khó quan sát.
Hình 1.2: Hình chụp từ kính hiển vi điện tử của tuyến trùng Steinernema và
Heterorhabditis. A và C: Đầu của tuyến trùng gây nhiễm, và tuyến trùng cái
thế hệ một của Steinernema. B và D: Đầu của tuyến trùng gây nhiễm và
tuyến trùng cái thế hệ hai của Heterorhabditis (Theo Nguyễn Ngọc Châu,
Cánh đuôi dạng mở peloderan hoặc hơi leptoderan, tức là cánh đuôi không kéo dài
đến tận cùng đuôi. Trên mỗi cánh đuôi bên có 9 nhú sinh dục dạng nan quạt.
Phasmids không rõ. Đuôi hình chop, tận cùng đuôi không có mucro.
Ấu trùng cảm nhiễm (infective juveniles) : Giai đoạn này ứng với ấu trùng tuổi
3 và chúng thường nằm lại bên trong vỏ cutin của ấu trùng tuổi 2. Cơ thể rất thon
dài so với ấu trùng cùng tuổi của nhóm khác. Vùng bên của vỏ cutin có các đường
đôi dọc cơ thể. Miệng và hậu môn khép kín. Phần đầu tròn và phía lưng miệng có
cấu trúc kitin hóa dạng rang, sừng, gai hoặc kitin dày lên nằm về phía lưng hoặc
trong một số trường hợp nằm gần bên. Cấu trức này giúp tuyến trùng đục thủng vỏ
cutin của côn trùng vật chủ để xâm nhập. Thực quản dài, hẹp, phần sau thực quản
có dạng diều và có van bên trong. Vòng thần kinh nằm bao quanh isthmus. Vị trí lỗ
14
bài tiết ở ngay phía sau vòng thần kinh. Vùng ruột trước có thể quan sát cấu trúc
dạng túi, bên trong chứa các vi khuẩn cộng sinh dạng gậy, vi khuẩn này cũng phân
bố dọc theo ống ruột. Đuôi nhọn. Phasmids không rõ. Sau khi xâm nhập vật chủ, ấu
trùng cảm nhiễm sẽ phát triển thành con cái lưỡng tính.
1.1.3. Đặc điểm sinh học
Theo Kaya & Gaugler (1923) [26], vòng đời của các loài tuyến trùng giống
Steinernema và Heterorhabditis bao gồm các giai đoạn: trứng, 4 giai đoạn ấu trùng
và trưởng thành. Giai đoạn ấu trùng cảm nhiễm là ấu trùng tuổi 3 tồn tại ở trong đất.
Các ấu trùng cảm nhiễm đều chứa vi khuẩn cộng sinh ở bên trong ruột và mang vi
khuẩn từ vật chủ này đến vật chủ khác. Khi phát hiện ra vật chủ chúng sẽ tiến hành
xâm nhập vào vật chủ. Các loài thuộc giống Steinernema có tập tính xâm nhập vào
cơ thể vật chủ qua các lỗ mở tự nhiên của côn trùng như miệng, hậu môn và lỗ thở.
Còn các loài thuộc giống Heterorhabditis ngoài con đường xâm nhập thụ động qua
các lỗ mở tự nhiên, chúng còn xâm nhập vào cơ thể côn trùng một cách chủ động
nhờ vào cấu trúc đặc biệt là một cái móc lưng. Cấu trúc đặc biệt này chỉ có ở ấu
trùng cảm nhiễm chúng giúp cho tuyến trùng có thể xâm nhập trực tiếp qua lớp vỏ
cutin của vật chủ ở những vùng màng mỏng giữa các khớp nối.
chủ, tuyến trùng sẽ giải phóng vi khuẩn cộng sinh (VKCS). Lúc này, VKCS nhân
lên nhanh chóng trong cơ thể vật chủ, giải phóng độc tố và gây chết vật chủ. Tuyến
trùng ăn vi khuẩn, phát triển và sản sinh ra các thế hệ tuyến trùng. Khả năng sinh
sản của tuyến trùng là một trong những đặc điểm quan trọng để tuyến trùng sống sót
và tồn tại ngoài tự nhiên. Khả năng sinh sản của tuyến trùng phụ thuộc vào nhiều
yếu tố như: khả năng sinh sản của từng chủng tuyến trùng, số lượng ấu trùng cảm
nhiễm gây nhiễm ban đầu, vào sự mẫn cảm của vật chủ và sinh khối của vật chủ.
Theo nghiêm cứu của Wang & Bedding (1996) [40] chỉ với 2 ấu trùng cảm nhiễm
của loài S. carpocapsae trên một ấu trùng BSL đã thu được khoảng 150.000 ấu
trùng cảm nhiễm. Thí nghiệm của Hazir et al. (2001) trên 5 chủng khác nhau của
loài S. feltiae đã xác định sản lượng ấu trùng cảm nhiễm thu được trên một ấu trùng
BSL là từ 45 x 10
3
đến 72 x 10
3
với số lượng gây nhiễm là 50 ấu trùng cảm nhiễm/
ấu trùng BSL [23]. Một chủng tuyến có khả năng sinh sản tốt sẽ góp phần duy trì
mật độ cao của ấu trùng cảm nhiễm trên đồng ruộng sau khi phun và kéo dài khả
năng phòng trừ sâu hại của chủng tuyến trùng đó trong thời gian dài [3].
1.2 Khả năng ứng dụng của tuyến trùng ký sinh gây bệnh côn trùng trong
phòng trừ sinh học sâu hại
1.2.1 Trên thế giới
Vai trò ký sinh gây bệnh ở côn trùng của một số loài tuyến trùng được tìm ra
từ những năm 1930s và tiềm năng phòng trừ sâu hại của chúng cũng được biết đến
khá sớm. Năm 1932, Glaser là người đầu tiên công bố tiềm năng phòng trừ sâu hại
của tuyến trùng họ Steinernematidae ở Mỹ. Trong một thử nghiệm ngoài đồng
ruộng ở New Jersey, ông quan sát thấy tuyến trùng S. glaseri đã tiêu diệt một số
lượng lớn bọ cánh cứng Nhật Bản (Popillia japonica Newn) [22]. Mặc dù vậy, do
sự phát triển bùng nổ của thuốc hóa học bảo vệ thực vật nên những nghiên cứu về
EPN và những ứng dụng của nó chưa được quan tâm phát triển. Việc nghiên cứu sử
8401) chỉ đạt 4,3%.
Bong & Sikorowski (1983) đã thử nghiệm hiệu quả của loài S. carpocapsae
trong phòng trừ ấu trùng sâu xanh hại ngô Helicopverpa zea. Kết quả cho thấy, hiệu
Copyright: Tài liệu đại học ©