TRƢỜNG ĐẠI HỌC SƢ PHẠM HÀ NỘI 2
KHOA SINH - KTNN
======
NGUYỄN THỊ PHƢƠNG
NGHIÊN CỨU MỘT SỐ ĐẶC TÍNH
HÓA SINH DƢỢC CỦA DỊCH CHIẾT
TỪ THÂN CÂY NGŨ GIA BÌ
(Acanthopanax trifoliatus gatus (L.)MERR)
KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC
Chuyên ngành: Hóa sinh học
Ngƣời hƣớng dẫn khoa học
ThS. PHÍ THỊ BÍCH NGỌC
HÀ NỘI , 2014
LỜI CẢM ƠN
Với tấm lòng kính trọng và biết ơn sâu sắc, tôi xin chân thành cảm ơn
Nguyễn Thị Phƣơng
DANH MỤC CÁC KÍ HIỆU VÀ CHỮ VIẾT TẮT
BP Béo phì
ĐTĐ Đái tháo đƣờng
ĐT Điều trị
EtOAc Ethylacetat
EtOH Ethanol
HDL Lipoprotein tỷ trọng cao ( High- density lipoprotein)
LDL Lipoprotein tỷ trọng thấp ( Low- density lipoprotein)
Met Metformin
PĐ Phân đoạn
POD Peroxidase
TG Triglycerid
WHO Tổ chức Y tế Thế giới
TN
0
Thí nghiệm
DANH MỤC CÁC BẢNG
dinh dƣỡng khác nhau trong vòng 8 tuần
Hình 3.4. Biểu đồ so sánh một số chỉ số hóa sinh giữa các lô chuột thí nghiệm
Hình 3.5. Biểu đồ so sánh khối lƣợng của các lô chuột đái tháo đƣờng trƣớc
và sau khi điều trị
Hình 3.6. Nồng độ glucose huyết lúc đói của các lô chuột thí nghiệm trƣớc và
sau khi tiêm 72 giờ
Hình 3.7. Nồng độ glucose huyết lúc đói của các lô chuột trƣớc và sau 14
ngày điều trị
Hình 3.8. Biểu đồ một số chỉ số lipid chuột đái tháo đƣờng trƣớc và sau điều
trị bằng thân cây Ngũ gia bì
MỤC LỤC
MỤC LỤC 7
MỞ ĐẦU 1
NỘI DUNG 4
CHƢƠNG 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU 4
1.1. Giới thiệu chung về cây Ngũ gia bì 4
1.1.1. Phân loại, mô tả 4
1.1.2. Phân bố 4
1.1.3. Thành phần hoá học 4
1.1.4. Công dụng 5
1.2. Giới thiệu một số hợp chất tự nhiên từ thực vật 5
1.2.1. Các hợp chất thứ sinh và các chất có hoạt tính sinh học 5
1.2.2. Flavonoid thực vật 6
1.2.1.1. Cấu tạo hóa học 6
2.2.2.1. Định tính một số nhóm hợp chất tự nhiên 16
2.2.2.2. Định lƣợng polyphenol tổng số theo phƣơng pháp Folin-Ciocalteau 18
2.2.3. Nghiên cứu tác dụng của các phân đoạn dịch chiết từ thân cây Ngũ
gia bì (Acanthopanax trifoliatus gatus (L.) Merr) lên trọng lƣợng và một số
chỉ số hóa sinh máu của chuột béo phì thực nghiệm 19
2.2.3.1. Thử độc tính cấp, xác định LD
50
19
2.2.3.2. Xây dựng mô hình chuột béo phì thực nghiệm 19
2.2.4. Phƣơng pháp nghiên cứu tác dụng hạ glucose huyết của các phân
đoạn dịch chiết từ thân cây Ngũ gia bì (Acanthopanax trifoliatus gatus (L.)
Merr) 20
2.2.4.1. Tạo mô hình chuột ĐTĐ type 2 20
2.2.4.2. Thử khả năng hạ glucose huyết của các phân đoạn dịchchiết 20
CHƢƠNG 3. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 22
3.1. Quy trình tách chiết các phân đoạn từ thân cây Ngũ gia bì 22 3.2. Kết quả khảo sát thành phần các hợp chất tự nhiên có trong các phân
đoạn dịch chiết thân cây Ngũ gia bì 23
3.2.1. Định tính một số hợp chất tự nhiên có trong thân cây Ngũ gia bì 23
3.2.2. Định lƣợng polyphenol tổng số các phân đoạn dịch chiết 25
3.2.2.1. Kết quả xây dựng đƣờng chuẩn acid gallic 25
3.2.2.2. Kết quả xác định hàm lƣợng polyphenol tổng số 26
3.3. Kết quả xác định liều độc cấp 27
3.4. Kết quả mô hình chuột béo phì thực nghiệm 27
3.5. Tác dụng của một số phân đoạn dịch chiết thân cây Ngũ gia bì lên
chuột béo phì thực nghiệm 32
3.6. Tác dụng hạ glucose huyết của thân cây Ngũ gia bì trên mô hình chuột
đái tháo đƣờng type 2 33
Kiến thức chung về bệnh của ngƣời dân cũng rất thiếu. Gần 76% số ngƣời
đƣợc hỏi có kiến thức rất thấp về chẩn đoán và biến chứng của bệnh, chỉ có
0,5% có kiến thức tốt.
Trong những năm gần đây, công nghệ tách chiết các hợp chất từ thực vật
đã không ngừng phát triển và bƣớc đầu đạt đƣợc những thành quả đáng kể.
Trên thế giới từ rất lâu ngƣời ta đã ứng dụng những công nghệ này để sản
xuất các chất có hoạt tính sinh học, phục vụ cho nghiên cứu, sản xuất và phục
vụ lợi ích của con ngƣời. Những nghiên cứu về hợp chất có hoạt tính sinh học
2
ở thực vật phát triển từ những năm 1950. Có khoảng hơn 30.000 hợp chất
đƣợc chiết xuất từ thực vật có hoạt tính và rất có giá trị đối với cuộc sống.
Những hợp chất nhƣ: alkaloid, terpenoid, phenolic đƣợc biết đến nhƣ là các
hợp chất thứ cấp, chúng đƣợc tạo ra ở một số loại tế bào nhất định nhƣ các tế
bào rễ tơ, biểu mô, hoa, lá. Mặc dù, hóa học tổng hợp hữu cơ đạt nhiều thành
tựu quan trọng nhƣng nhiều hợp chất có hoạt tính sinh học (thƣờng gọi là các
chất thứ cấp) vẫn còn khó tổng hợp hoặc có thể tổng hợp đƣợc nhƣng chi phí
rất đắt. Chẳng hạn, một số hỗn hợp phức tạp nhƣ tinh dầu hoa hồng là không
thể tổng hợp hóa học đƣợc.
Trong lịch sử Y học từ 1550 năm trƣớc công nguyên, con ngƣời đã biết
dùng cây cỏ để chữa ĐTĐ. Nhiều loại thảo dƣợc đã chứng tỏ có tác dụng rất
tốt trong việc điều trị ĐTĐ nhƣ: mƣớp đắng, sinh địa, hoàng kỳ, huyền sâm,
cỏ ngọt, chè xanh, khoai lang,…Việc nghiên cứu, khảo sát về thành phần hóa
học và tác dụng dƣợc lý của các loài cây thuốc có giá trị của Việt Nam nhằm
đặt cơ sở khoa học cho việc sử dụng chúng một cách hợp lý, hiệu quả có tầm
quan trọng đặc biệt.
Cây Ngũ gia bì thuộc họ Ngũ gia bì mọc hoang ở nhiều tỉnh miền Bắc
nƣớc ta, hay gặp nhất là ở Lạng Sơn, Cao Bằng,Vĩnh Phúc, Phú Thọ, Bắc
Cạn, Thái Nguyên… đƣợc dùng để chữa nhiều bệnh . Tuy nhiên việc nghiên
cứu đặc tính hóa sinh, y dƣợc của các hoạt chất thiên nhiên từ đối tƣợng này
dài, phía cuống hơi thót lại, đầu nhọn, mỏng, mép có răng cƣa to, cuống lá dài
từ 4-7 cm. Hoa mọc khác gốc thành hình tán ở đầu cành. Ðầu mùa hạ ra hoa
nhỏ màu vàng xanh. Quả mọng, hình cầu, đƣờng kính chừng 2.5 mm, khi chín
có màu đen [10].
1.1.2. Phân bố
Ngũ gia bì mọc hoang ở nhiều tỉnh miền Bắc nƣớc ta, hay gặp nhất là ở
Lạng Sơn, Cao Bằng, Sapa (Lào Cai), Vĩnh Phúc, Phú Thọ, Bắc Cạn, Thái
Nguyên, Hòa Bình, Hà Tây, Tuyên Quang. Có mọc ở Trung Quốc (Quảng
Châu, Tứ Xuyên) [10].
Thƣờng đào cây vào mùa hạ hay mùa thu, lấy rễ, bỏ gỗ, lấy vỏ, phơi
khô là đƣợc. Khi dùng để sống hoặc sao vàng sắc uống.
Vị thuốc thƣờng là những cuộn ống nhỏ, dài ngắn không đều, dày
chừng 1mm, vỏ ngoài màu vàng nâu nhạt, hơi bóng, có những nếp nhăn, bì
khổng dài, mặt trong màu xám trắng, dai, mặt phẳng, có nhiều điểm vàng nâu.
Mùi không rõ.
1.1.3. Thành phần hoá học
Tác giả Phạm Thanh Huyền đã xác định đƣợc thành phần hóa học chủ
yếu của cây Ngũ gia bì bao gồm : saponin, alkaloid, coumarin, phytosterol,
chất béo, tinh dầu, acid hữu cơ, tanin, acid uronic và đƣờng khử tự do 6.
Từ thân và lá cây Ngũ gia bì, Phan Văn Kiệm và cộng sự đã phân lập
đƣợc taraxerol, taraxeryl axetat, axit ent-pimara- 8(14), 15-dien-19-oic, axit
ent-kaur-16-en-19-oic và (2R, 3R) -2,3-di-(3,4- metylendioxibenzyl)-
5
butyrolactone 9.
1.1.4. Công dụng
Ngũ gia bì là 1 vị thuốc có tác dụng mạnh gân cốt, khu phong hóa thấp,
chủ trị đau bụng, yếu chân, trẻ con lên 3 tuổi chƣa biết đi, con trai âm suy
(dƣơng sự bất cử) con gái ngứa âm hộ, đau lƣng, tê chân, làm mạnh gân cốt,
tăng trí nhớ, ngâm rƣợu uống rất tốt. Theo tài liệu cổ Ngũ gia bì vị cay, tính
phòng tránh và điều trị một số bệnh thông thƣờng và cả những bệnh hiểm
nghèo ở ngƣời. Phổ biến nhất là các hợp chất flavonoid, phenolic và alkaloid.
Chúng đƣợc bào chế thành các dạng dƣợc liệu hay đƣợc bổ sung vào thực
phẩm nhằm nâng cao giá trị dinh dƣỡng và tăng cƣờng khả năng phòng ngừa
bệnh tật.
1.2.2. Flavonoid thực vật
Trong số các polyphenol tự nhiên, flavonoid là nhóm chất quan trọng vì
chúng phổ biến ở hầu hết các loài thực vật và có nhiều hoạt tính sinh – dƣợc
học có giá trị [5].
1.2.1.1. Cấu tạo hóa học
Flavonoid thuộc nhóm phenol, là dẫn xuất của 2 – phenyl chroman
(flavan). Đó là những hợp chất có cấu tạo gồm 2 vòng benzen A và B với một
dị vòng pyran C tạo thành khung carbon C6 – C3 – C6, trong đó vòng A kết
hợp với vòng C tạo thành khung chroman.
9
10
8
5
7
6
2
3
O
1
4
1'
5'6'
4'
3'
2'
1.2.2. Hợp chất phenolic
1.2.2.1. Cấu tạo hóa học
Hợp chất phenolic là nhóm các chất khác nhau rất phổ biến trong
thực vật. Trong phân tử có vòng thơm (benzen) mang một, hai hay ba nhóm
hydroxyl (-OH) gắn trực tiếp với vòng benzen. Dựa vào thành phần và cấu
trúc chia, ngƣời ta chia hợp chất phenolic thành ba nhóm chính là: nhóm hợp
8
chất phenolic đơn giản, nhóm hợp chất phenolic phức tạp, nhóm hợp chất
phenolic đa vòng.
1.2.2.2. Hoạt tính sinh học
Hợp chất phenolic có ở hầu hết các bộ phận của thực vật, đặc biệt là
các tế bào tham gia vào quá trình quang hơp. Chúng là những sản phẩm thứ
cấp của quá trình đƣờng phân và chu trình pentose qua cynamic acid hay theo
con đƣờng acetate malonate qua acetyl-coA.
Các phenolic tham gia vào quá trình hô hấp của thực vật với vai trò
nhƣ một chất vận chuyển hydro. Các polyphenol có thể hình thành liên kết
hydro với protein và enzyme, dẫn đến thay đổi hoạt động của các enzyme bị
tác động tƣơng tự nhƣ hiệu ứng điều hòa dị lập thể.
Tác dụng mạnh lên quá trình sinh trƣởng của thực vật, là chất hoạt
hóa IAA- oxydase và tham gia vào quá trình sinh tổng hợp của enzyme này.
Hợp chất phenolic có tính kháng khuẩn.
1.2.3. Alkaloid thực vật
1.2.3.1. Cấu tạo hóa học
Alkaloid là nhóm các hợp chất hữu cơ có cấu trúc phức tập chứa
nitơ, đa số có nhân dị vòng, có đặc tính kiềm, thƣờng gặp ở thực vật và động
vật.
Alkaloid thƣờng không màu, không mùi, có vị đắng. Một số alkaloid
có màu vàng nhƣ berberin, palmitin.
N
nhau.
Alkaloid đƣợc sử dụng nhiều trong công nghiệp dƣợc, có rất nhiều
thuốc chữa bệnh đƣợc sử dụng trong y học là các alkaloid tự nhiên hoặc nhân
tạo nhƣ morphine, caffein, nicotin, cocain, …
1.2.4. Tannin thực vật
1.2.4.1. Cấu trúc hóa học
Tannin là hợp chất phenol có trọng lƣợng phân tử cao, có chứa nhóm
chức hydroxyl và các nhóm chức khác (nhƣ carboxyl), có khả năng tạo phức
với protein và các phân tử lớn khác trong điều kiện đặc biệt.
Tannin đƣợc cấu tạo dựa trên gallic acid và tanic acid. Tannin đƣợc
chia làm hai nhóm chính là tannin thủy phân và tannin ngƣng tụ.
Tannin thƣờng là hợp chất vô định hình hoặc tinh thể, không màu, có
tính quang học, vị chát. Tannin tan trong nƣớc tạo dung dịch keo và độ hòa
tan thay đổi tùy thuộc mức độ polymer hóa. Chúng tan tốt trong ethanol,
acetone.
1.2.4.2. Hoạt tính sinh học
Tannin là chất cầm rửa do có tác dụng giảm sự bài tiết trong ống tiêu
hóa, kết tủa protein tạo thành một màng che niêm mạc. Tannin chữa ngộ độc
kim loại nặng và alkaloid do có khả năng tạo kết tủa với chúng.
Tannin có tác dụng chống ung thƣ do có khả năng kết hợp với các
chất gây ung thƣ. Ở nồng độ cao, tannin ức chế hoạt động của các enzyme
nhƣng lại kích hoạt enzyme ở nồng độ thấp.
10
Tannin có tác dụng ức chế và diệt khuẩn, tác dụng cầm máu do làm
se hệ mao mạch hay tác dụng làm giảm đau tại chỗ do làm giảm tác dụng ở
đầu dây thần kinh trung ƣơng.
1.2.5. Hợp chất coumarin
Coumarin là dẫn xuất của α-purine có cấu trúc C6 – C3 dị vòng chứa
oxy. Coumarin kết tinh không màu hoặc màu vàng nhạt, vị đắng, cay, có mùi
< 18.5
< 18.5
Bình thƣờng
18.5 - 24.9
18.5 - 22.9
Quá cân
≥ 25 - 29.9
≥ 23
Béo phì độ 1
30 - 34.9
>23 - 24.9
Béo phì độ 2
35 - 39.9
25 - 29.9
Béo phì độ 3
≥ 40
≥ 30
1.3.1. Thực trạng béo phì trên thế giới và ở Việt Nam
Theo tổ chức y tế thế giới (WHO) hiện nay số ngƣời béo phì đã lên tới
1,7 tỉ ngƣời [3], không chỉ gặp nhiều ở các quốc gia phát triển mà còn gặp ở
các quốc gia đang phát triển.
Tại Việt Nam, theo tiêu chuẩn của ngƣời châu Á, số ngƣời thừa cân
béo phì cũng tăng theo thời gian. Năm 1991 theo điều tra của Lê Huy Liệu và
cộng sự thì tỉ lệ thừa cân mắc bệnh béo phì nói chung tại Hà Nội nói chung là
1,1%. Đến năm 2000 con số này đã là 2,62% tăng gấp 2,5 lần trong vòng 10
năm [3].
1.3.2. Tác hại và nguy cơ của bệnh béo phì
Ngƣời béo phì có nguy cơ bệnh tật cao hơn so với ngƣời thƣờng do
nhiễm độc mỡ máu, tiêu biểu nhƣ:
13
1.4.2. Thực trạng ĐTĐ trên thế giới và ở Việt Nam
Bệnh Đái tháo đƣờng (ĐTĐ) đang gia tăng nhanh chóng trên thế giới,
đặc biệt ở các nƣớc đang phát triển, trong đó có Việt Nam.
Năm 1994, trên thế giới có 110 triệu ngƣời mắc, năm 1995 con số này
đã là 135 triệu ngƣời (4% dân số). Ƣớc tính đến năm 2010 số ngƣời mắc ĐTĐ
sẽ lên đến 221 triệu và năm 2050 là 300 triệu. Ở Việt Nam, vào những năm
đầu thập kỷ 90, tỷ lệ ĐTĐ ở Hà Nội, Huế và Tp. Hồ Chí Minh tƣơng ứng là
1,2%, 0,96% và 2,52%, nhƣng vào năm 2001 khu vực thành thị của 4 thành
phố lớn đã là 4,0%.
Theo WHO, năm 2000 toàn thế giới có khoảng 151 triệu ngƣời mắc bệnh
đái tháo đƣờng và dự đoán đến năm 2025 con số mắc bệnh sẽ tăng đến 300-330
triệu, chiếm 5,4% dân số toàn cầu. Đáng chú ý là bệnh có xu hƣớng gia tăng
mạnh tại các quốc gia đang phát triển ở châu Phi, châu Mỹ La Tinh và châu Á,
đặc biệt ở độ tuổi lao động [2].
Ở Việt Nam, theo thống kê của Bệnh viện Nội tiết, số ngƣời mắc bệnh đái
tháo đƣờng ở nƣớc ta chiếm khoảng 5% dân số (khoảng 4,5 triệu ngƣời), riêng ở
các thành phố lớn nhƣ Hà Nội, Hải Phòng, Hồ Chí Minh, tỷ lệ này chiếm
khoảng 7% và con số này vẫn không ngừng tăng lên với tốc độ nhanh nhất thế
giới [2].
1.4.3. Tác hại và biến chứng
ĐTĐ không chỉ có tính chất là một bệnh mãn tính, ĐTĐ còn kèm theo
nhiều biến chứng nguy hiểm nhƣ các bệnh về thận dẫn đến suy thận, bệnh về
mắt dẫn đến mù lòa, tổn thƣơng hệ thần kinh và đặc biệt là các biến chứng về
mạch máu (xơ vữa động mạch) có thể dẫn đến tử vong nhƣ bệnh mạch vành,
nhồi máu não, xuất huyết não [15], [13], [4], [11]. 14
gồm có: bộ máy Soxhlet chiết mẫu của Đức, tủ sấy, phễu chiết, phễu lọc,
máy cô quay chân không RE 400 Yamato, máy li tâm eppendorf, máy li tâm
lạnh, máy xét nghiệm tự động các chỉ số sinh hóa Olympus, máy đo đƣờng
huyết tự động, cân kĩ thuật, micropipet, máy đo quang phổ,…
16
2.2. Phƣơng pháp nghiên cứu
2.2.1. Phương pháp tách chiết nghiên cứu
Từ 3000g thân cây Ngũ gia bì đã sấy khô đƣợc ngâm trong ethanol
90% , loại dung môi dƣới áp suất giảm thu đƣợc tổng khối lƣợng mẫu cao cồn
tổng số là 150g.
Tiếp tục ngâm mẫu (sau khi đã ngâm với ethanol) với n-hexan trong
vòng 10 ngày sau đó thu dịch chiết và cô loại dung môi thu đƣợc 50.2 g dạng
cao và bảo quản trong tủ lạnh.
Tiếp tục ngâm mẫu (sau khi đã ngâm với n- hexan) với ethylacetate
trong vòng 10 ngày sau đó thu dịch chiết và cô loại dung môi thu đƣợc 42.5g
dạng cao và bảo quản trong tủ lạnh.
2.2.2. Phương pháp khảo sát thành phần hóa học của thân cây Ngũ gia bì
2.2.2.1. Định tính một số nhóm hợp chất tự nhiên
Cao các phân đoạn đƣợc hòa tan trong dung môi thích hợp với từng
loại phản ứng định tính. Các nhóm phản ứng đƣợc trình bày tóm tắt ở bảng 2.1.
Copyright: Tài liệu đại học ©