BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ Y TẾ

TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI NGUYỄN THỊ MINH NGUYỆT
XÂY DỰNG PHƯƠNG PHÁP PHÁT HIỆN
6-MONOACETYLMORPHIN TRONG
MẪU NƯỚC TIỂU BẰNG GC-MS

LUẬN VĂN THẠC SĨ DƯỢC HỌC
HÀ NỘI 2013
 1

HÀ NỘI 2013
LỜI CẢM ƠN

Nhân dịp hoàn thành luận văn Thạc sĩ Dược học, em xin được gửi
lời trân trọng cảm ơn tới thầy hướng dẫn TS. Nguyễn Xuân Trường. Cám
ơn sự tận tình chỉ bảo, cũng như sự động viên của thầy đã giúp em vượt
qua những khó khăn để hoàn thành luận văn tốt nghiệp. Sự hiểu biết sâu
sắc của thầy đã thắp sang
tình yêu khoa học cho mỗi học viên may mắn được thầy hướng dẫn.
Em
cũng xin trân trọng cảm ơn các thầy cô, đặc biệt các thầy cô
trong bộ môn kiểm nghiệm thuốc- độc chất, Trường Đại học Dược Hà
Nội đã truyền đạt kiến thức cho em trong suốt khóa học.
Tôi xin được cảm ơn tới các anh chị đồng nghiệp nơi tôi công tác,
cùng các anh chị công tác tại Trung tâm Giám định ma túy-Viện Khoa
học Hình sự, đặc biệt là Th.s Đỗ Duy
Nam, Th.s Hoàng Ngọc Mai đã
giúp đỡ, tạo điều kiện cho tôi hoàn thành luận văn.
Cuối cùng tôi xin gửi lời cảm ơn tới bố mẹ, chồng, em trai đã động
viên, tạo điều kiện cho tôi hoàn thành tốt khóa học.
Hà Nội, ngày 30 tháng 8 năm 2013
Học viên Nguyễn Thị Minh Nguyệt

 3

ÊN CỨU 27
2.1. Đối tượng nghiên cứu
27
2.2. Hóa chất và thiết bị: 27
2.3. Phương pháp và nội dung nghiên cứu 27
2.3.1. Điều kiện làm việc của hệ sắc ký khí – khối phổ (GC-MS) 27
2.3.2. Khảo sát chọn các điều kiện tối ưu cho quá trình chiết 28
2.3.3. Thẩm định phương pháp định lượng 6- MAM trong nước tiểu bằng
GC- MS
29
2.4. Phương pháp xử lý số liệu
32

 4
CHƯƠNG 3. KẾT QUẢ 33
3.1. Xây dựng quy trình chiết, phân tích 6-MAM trong nước tiểu 33
3.1.1. Lựa chọn điều kiện phân tích 6-MAM trên GC-FID 33
3.1.2. Khảo sát lựa chọn dung môi chiết
34
3.1.3. Khảo sát lựa chọn pH môi trường chiết xuất 6-MAM trong mẫu
nước tiểu
38
3.1.4. Khảo sát sự ổn định 6-M
AM trong mẫu nước tiểu 40
3.1.5. Lựa chọn điều kiện dẫn xuất 6-MAM và phân tích trên GC-MS
trong mẫu nước tiểu
44
3.1.6. Quy trình phân tích 6-MAM trong mẫu nước tiểu bằng chiết lỏng-
lỏng, dẫn xuất hóa và phân tíc
h trên GC-MS 47

DCM Dichlorometan
Ete Diethylete
EI Kỹ thuật ion hóa bằng va chạm electron
EtAc Ethylacetat
GC-MS Sắc ký khí – khối phổ
HPLC (High performance
liquid Chromatography) Sắc ký lỏng hiệu năng cao
IS (Internal Standard) Chất nội chuẩn
LOD (Limit of Detection) Giới hạn phát hiện
LOQ (Limit of Quantification) Giới hạn định lượng
M-3-G Morphin – 3 – glucuronic
M-6-G Morphin – 6 – glucuronic
PFPA Anhydric pentafluoropropionic
RSD Phương sai
SD Độ lệch chuẩn
 6
DANH MỤC HÌNH
Hình 1.1. Công thức cấu tạo của Morphin 6
Hình 1.2. Sơ đồ chuyển hóa của các chất nhóm
opiat 10
Hình 1.3. Công thức cấu tạo 6-MAM 11
Hình 1.4. Sơ đồ máy
khối phổ 21
Hình 1.5. Sơ đồ quá trình i
on hóa bằng EI 22
Hình 1.6. Sơ đồ bẫy ion tứ cực 24
Hình 3.1: Phổ đồ của hỗn hợp chất chuẩn m
ethadone, morphine, 6-MAM,
Octacosan trong CTSK GC-FID 34
Hình 3.2: Phổ đồ GC của mẫu c

Bảng 3.1: Kết quả khảo sát dung m
ôi chiết trong trường hợp đã loại tạp 37
Bảng 3.
2: Kết quả khả năng chiết 6-MAM trong nước tiểu phụ thuộc vào
pH mẫu 39
Bảng 3.3: Kết quả sự thay đổi tỷ lệ diện tích pic của 6-MAM và chất nội
chuẩn trong quá trình bảo quản mẫu nước tiểu 41
Bảng 3.4: Kết quả hiệu suất chiết 6-MAM theo quy trình đã lựa chọn 43
Bảng 3.5: Kết quả khảo sát tính phù hợp của hệ thống 51
Bảng 3.6: Kết quả khảo sát xây dựng đường chuẩn, xác định LOD, LOQ 52
Bảng 3.7: Kết quả khảo sát xác định độ đúng 54
Bảng 3.8: Kết quả khảo sát hiệu suất thu hồi của phương pháp 56
Bảng 3.9: Một số thông tin ban đầu về mẫu nước tiểu thực tế 57
Bảng 3.10: Kết quả phân tích mẫu thực tế 58

 8
ĐẶT VẤN ĐỀ

Ma túy là một vấn nạn, không chỉ trong nội bộ của một quốc gia mà
còn là vấn đề cần được quan tâm của nhiều nước. Toàn cầu hóa đã mang lại
nhiều cơ hội cho sự phát triển kinh tế- xã hội, song cũng đặt ra nhiều thách
thức lớn trong công cuộc đấu tranh với tệ nạn ma túy, đặc biệt ở các nước
đang phát triển. Hiện nay, do mức độ nghiêm trọng từ phương thức đến t
hủ
đoạn sản xuất, vận chuyển, buôn bán ma tuý ngày càng tinh vi đã ảnh hưởng
không nhỏ đến công tác quản lý, đấu tranh ngăn chặn ma túy của các nước.
Cũng như các quốc gia khác trong khu vực và quốc tế, Việt Nam đã có
nhận thức sâu sắc về tác hại của ma túy đối với cá nhân, cộng đồng và xã hội.
Việc đấu tranh phòng, chống ma túy ở Việt Nam là một mặt trận nóng bỏng,
được cả xã hội q

Morphintrong dịch sinh học không thể kết luận đối tượng đã sử dụng Heroin.

6-Monoacetylmorphin(6-MAM) là sản phẩm chuyển hóa trung gian của
Heroin trong cơ thể, đồng thời cũng là “chìa khóa” để phân biệt Heroin với
các opiat khác. Tuy nhiên, nồng độ của 6-MAM trong nước tiểu thường rất
nhỏ, cần có những thiết bị phân tích hiện đại, có độ nhạy cao để nhận dạng.
Trên thế giới để xác định việc sử dụng Heroin người ta thường tiến hành phân
tích sản phẩm chuyển hóa trung gian 6-MAM. Ở Việt Nam, hiện nay chưa có
công trình nghiên cứu toàn diện về vấn đề này [6]
, [11].
Xuất phát từ thực tế trên, chúng tôi tiến hành nhiệm vụ “xây dựng
phương pháp phát hiện 6-Monoacetylmorphintrong mẫu nước tiểu bằng
GC-MS” với các mục tiêu sau:
1. Xây dựng và thẩm định phương pháp phát hiện 6-
Monoacetylmorphintrong mẫu nước tiểu bằng phương pháp sắc ký khí – khối
phổ (GC-MS).
2. Ứng dụng phương pháp phân tích một số mẫu nước tiểu thực tế.
 2
Chương 1: TỔNG QUAN
1.1. Vài nét về các nhóm ma túy
1.1.1 Một số kh
ái niệm về chất ma túy
Trong quá trình phát triển, con người đã biết sử dụng một số loại cây cỏ
giúp cho tinh thần sảng khoái, chống mệt mỏi. Từ thế kỉ thứ 3 trước công
nguyên đã có tài liệu ghi nhận việc sử dụng thuốc phiện. Thuốc phiện được
coi như một loại thần dược chữa bách bệnh. Điều đó dẫn tới việc lạm dụng
thuốc phiện của loài người. Năm 1806, Serturner đã phân lập được một c
hất
tinh khiết đặc trưng cho tác dụng chính của thuốc phiện và gọi tên là
Morphine. Nó còn được gọi tên là Narcotic, nghĩa là mê mẩn, túy lúy. Ở Việt

- Các chất ức chế thần ki
nh trung ýõng, có tác dụng giảm ðau, gây
ngủ gồm thuốc phiện, các chất Opiat và các chất tác dụng kiểu Morphine.
- Các chất kích thích thần kinh trung ýõng nhý Amphetamin,
Methamphetamin, các dẫn chất mạch vòng của Amphetamin, Cocainm, cây
Khat
- Các chất gây ảo giác nhý Cần sa, LSD, nấm Peyote, Mescalin…
- Các chất an thần, gây ngủ nhý các chất nhóm Benzodiazepin, nhóm
Barbiturat.
- Một số các chất dung môi bay hõi nhý Ete, Etyl acetat…
 Phân loại theo tính chất hóa học:
- Nhóm alkaloid : Morphine, Codein, Cocain, Heroin
- Nhóm amin thõm: Amphetamin, Methamphetamin…
 Phân loại theo trạng thái vật lý: rắn, lỏng…
 4
Trên thực tế cách phân loại theo tác dụng tâm sinh lý được dùng phổ biến
nhất trên thế giới, cách phân loại theo trạng thái vật lý ít được sử dụng vì đa
số các chất ma túy ở trạng thái rắn dưới dạng tinh thể hoặc vô định hình, trừ
một số ít chất lỏng như cần sa và các dung môi bay hơi. Trong phạm vi đề tài
này Heroin và sản phẩm chuyển hóa của nó là đối tượng chính.
1.2. Các chất ma túy nhóm opiat.
1.2.1. Lịch sử

Thuật ngữ “opiat” được dùng để chỉ những chất có trong thuốc phiện,
là một sản phẩm tự nhiên thu được từ nhựa quả cây thuốc phiện, tên khoa học
là Papaver sonmiferum L, bao gồm morphine, codein, thebain, và các chất
bán tổng hợp từ chúng như heroin, oxycodone, hydromorphone.
Đầu thế kỷ XIX, lần đầu tiên morphinđược phân lập từ cây thuốc phiện,
vào năm 1874 việc tổng hợp diacetylmorphinđược báo cáo. Năm 1898, sản
phẩm thương mại được r

Các nhóm thế ở vị trí số

Dẫn chất opiat
3 6 17

Ghi chú
Morphin OH OH CH
3

Heroin OCOCH
3
OCOCH
3
CH
3

Codein CH
3
OH CH
3

Thebain OCH
3
OCH
3
CH
3

Nalorphin OH OH CH
2

ên, đồng thời sinh khả dụng đường uống cũng
t n
ơn, tác dụng giảm đau gây nghiện tăng, ví dụ diacetyl
morphin
nhưng thời gian tác dụng lại ngắn như
xy
o m
l –CH
2
-CH=CH
2

i morphin [5], [6].

(2): thêm OH vào C14
(3): giữa C4 và C5 không có O
1.2.2.2. Liên quan giữa cấu trúc và tác dụng

- Các chất trong nhóm đều có cấu trúc nhân phenan
m rp in, là cấu trúc quyết định tác dụng giảm đau của nhóm.
- Các nhóm chức có liên quan đến tác dụng là nhóm –OH phenol ở vị
trí 3, nhóm –OH alcol ở vị trí 6, và nhóm thế ở vị trí 17. Khi thay đổi nhóm –
OH ở vị trí C
3
,

C
6
trong phân
tí d ợc động học thay đổi:

ưới dạng hút, hít, tiêm để có tác dụng nhanh chóng, tăng sinh khả
nhau thai, sữa mẹ. Tuy nhiên heroin qua hàng rào máu não tốt hơn
ản phẩm t
hủy phân tách loại acetyl của tạp chất acetylcodein có
sinh khả dụng đường uống cao hơn cả. Chúng thường được người nghiện sử
dụng d
dụng.

Phân bố: khoảng 30% morphin liên kết với protein huyết tương, trong
khi heroin chỉ liên kết với protein khi đã được chuyển hóa thành morphin.
Tập trung nhiều ở cơ vân, gan, phổi, thận. Các chất này qua được hàng rào
máu não,
m
orphin.
Chuyển hóa và thải trừ: các chất opiat chủ yếu chuyển hóa ở gan. Quá
trình chuyển hóa bao gồm rất nhiều phản ứng, trong đó phổ biến nhất là các
phản ứng thủy phân được nối tiếp bởi các phản ứng liên hợp với acid
glucuronic, đồng thời có cả các phản ứng loại nhóm alkyl gắn vào Nitơ.
Trong quá trình chuyển hóa, heroin nhanh chóng bị thủy phân, loại acet
yl tạo
6-monoacetylmorphin, chất này tiếp tục bị loại acetyl, nhưng với tốc độ chậm
hơn tạo morphin. Phần lớn lượng morphin tạo ra được chuyển hóa dưới dạng
liên hợp với acid glucuronic tạo thành 2 dạng sản phẩm, dạng có hoạt tính
morphin-6-glucuronic (M-6-G) và dạng không có hoạt tính morphin-3-
glucuronic (M-3-G). M-6-G giữ vai trò rất quan trong đối với tác dụng trên hệ
thần kinh của morphin. Đối với codein, xảy ra quá trình l
oại acetyl ở C
3
tạo
morphin, các giai đoạn còn lại giống nhau đối với cả heroin và morphin. Bên

Tên gọi:
6-m
onoacetylmorphin,
6-acetylmorphin, 6-MAM
Công thức phân tử: C
19
H
21
NO
4Phân tử lượng: 327,374 g/mol

Hình 1.3. Công thức cấu tạo 6-MAM

3-hydroxy-6-acetyl-(5α,6α)-7,8-Didehydro-4,5-epoxy-17-methylmorphinan
- Tính chất:
6-MAM tồn tại ở 2 dạng: dạng base và dạng muối ngậm 1 phân tử
hydroclorid hoặc hydrat ngậm 3 phân tử nước.
Dạng base có nhiệt nóng chảy 200
0
C, 190
0
C (DSC), tan rất ít trong
nước, tan tốt trong methanol, ethanol, chloroform.
Dạng muối có nhiệt nóng chảy 265- 267
0
C, 313
0

dụng nhiều hơn cả [22]
, [24].
Xung quanh việc 6-MAM có phải là dấu hiệu đặc hiệu trong phân tích,
phát hiện đối tượng sử dụng heroin cũng có nhiều nghiên cứu:
Năm 1997, Carol L.O’Neal và Alphonse Poklis nghiên cứu về việc bổ
sung acetylcodein (AC) như một dấu hiệu phát hiện người sử dụng heroin.
AC là một tạp được tìm thấy trong heroin, có lượng thay đổi p
hụ thuộc vào
nguồn gốc heroin, độ ổn định trong nước tiểu cao hơn so với 6-MAM. Trong
nghiên cứu này độ nhạy của AC với GC-MS cũng rất tốt. Giới hạn phát hiện
(LOD) của AC là 0,5µg/L, giới hạn định lượng (LOQ) là 1.0µg/L. Trong khi
 12
đó LOD và LOQ của 6-MAM là 2,0µg/L. Tuy nhiên hai tác giả cũng kết luận
rằng AC được tìm thấy ở ít mẫu và nồng độ ít hơn 6-MAM. Vì vậy, nghiên
cứu năm 1998 của 2 tác giả chỉ ra AC không phải là dấu hiệu đáng tin cậy để
kết luận đối tượng sử dụng heroin [20].
Năm 2006, hai tác giả Sue Paterson và Rosa Cordero có nghiên cứu so
sánh giữa chất chuyển hóa của tạp chất heroin và 6-MAM trong việc sử dụng
làm dấu hiệu phát hiện đối tượng sử dụng heroi
n. Nghiên cứu này chỉ ra phân
tích chất chuyển hóa của papaverine nhạy cảm hơn 6-MAM, lượng mẫu tìm
thấy chất chuyển hóa của papaverine cao hơn 6-MAM rất nhiều lần. Nhưng,
cũng bởi papaverine là một tạp chất của heroin, thay đổi lượng theo nguồn
gốc, cách sản xuất heroin nên sự vắng mặt chất chuyển hóa papaverine trong
mẫu không đủ để kết luận đối tượng không sử dụng heroin [21].
Cho
tới nay, 6-MAM vẫn là dấu hiệu duy nhất chứng minh việc sử
dụng heroin của các đối tượng. Ở Việt Nam, heroin chủ yếu là loại heroin
Đông Nam Á có hàm hượng diacetylmorphincao, các tạp chất liên quan rất ít.
Do vậy việc phát hiện Heroin thông qua phân tích 6-MAM càng trở lên đặc

ôi sau, trong đó
hệ A,B,C,D thường hay được sử dung hơn:
Hệ A: Toluene/ Aceton/ Ethanol/ NH
4
OH đặc theo tỷ lệ thể tích tương
ứng: 45/45/7/3
Hệ B: Ethylacetat/Methanol/NH
4
OH: 85/10/5.
Hệ C: Methanol/NH
4
OH : 100/1,5
Hệ D: Chloroform/Methanol : 90/10
Hệ E: Ethanol/ Isopropanol/ Xylen/ Chloroform : 12,5/12,5/25/50
Hệ F: Toluen/ Dioxan/ Ethanol/NH
4
OH: 50/40/5/5
 14
vv…
Chất chuẩn: 6-MAM
Phát hiện:
Thuốc thử Dragendroff: cho các vết da cam trên nền vàng.
Thuốc thử Iodoplatinate: cho các vết màu xanh tím [12], [13].
Soi đèn tử ngoại ở bước sóng 254nm cho vết phát quang
 Ưu điểm của phương pháp phân tích bằng TLC:
Thiết bị sử dụng đơn giản, rẻ tiền, nhanh.
Phát hiện được tất cả các chất kể cả các chất không di chuyển theo pha
động
Có thể thực hiện tách các mẫu có nhiều thành phần: Có thể thực hiện
sắc ký đồng thời 10-20 mẫu hoặc hơn.

OH/ Methanol tỷ lệ ½
Dung dịch B: Hỗn hợp acid acetic băng/ Methanol tỷ lệ 1/1
Tốc độ dòng: 1,3 ml/phút
Detector: 218 nm.
Phương pháp này có một số những hạn chế như: cần dùng nhiều dung
môi, hóa chất có độ tinh khiết cao nên bất lợi về kinh tế, thời gian phân tích
dài [12], [13]
 16
1.3.2.4. Phương pháp sắc ký khí- khối phổ [3], [4]
a. Đại cương về sắc ký khí.
- Định nghĩa
Sắc ký khí là kĩ thuật chia tách trong đó các thành phần của mẫu phân
tích phân bố giữa hai pha: pha tĩnh với diện tích tiếp xúc rất lớn, pha động có
bản chất khí. Mẫu được hóa hơi và mang bởi pha động (khí mang) đi qua cột.
Mẫu phân bố trên pha tĩnh lỏng dựa vào độ hòa tan ở nhiệt độ nhất định. Các
thành phần của mẫu phân tách khỏi nhau dựa trên áp suất hơi tương đối và ái
lực khác n
hau của chúng đối với pha tĩnh.
- Thiết bị sắc ký khí
Máy sắc ký khí được mô tả như sơ đồ hình. Nó bao gồm các bộ phận
sau:
- Pha động: Khí mang đưa mẫu đi qua cột.
- Pha tĩnh: Cột sắc ký đặt trong lò cột.
- Hệ thống tiêm mẫu: Đưa mẫu vào cột.
- Detector: Phát hiện chất phân tích trong mẫu
- Hệ thống thu nhận và xử lý số liệu.
- Hệ cấp pha động.
Trong sắc ký khí pha động thường là khí trơ như: heli, argon, nitơ hoặc
khí carbonic và khí hydro. Lựa chọn khí
trơ nào phụ thuộc vào detector cần