BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ Y TẾ
SINH
STREPTOMYCES 21.123
4 BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ Y TẾ
Tôi cũng xin chân thành cảm ơn tới các thầy cô giáo, cán bộ kỹ thuật
viên môn C
lý Hóa lý trường Đại học Dược Hà Nội đã tạo điều kiện, giúp đỡ tôi trong quá
trình thực hiện luận văn.
Tôi cũng xin cảm ơn đến ban giám hiệu cùng các thầy cô giáo trong
trường Đại học Dược Hà Nội đã tạo điều kiện thuận lợi cho tôi trong suốt quá
trình học tập và hoàn thành đề tài cao học.
Tôi cũng xin gửi lời cảm ơn tới gia đình, đồng nghiệp, bạn bè đã quan
tâm động viên tôi trong suốt thời gian qua.
Do thời gian có hạn, nên trong luận văn này không tránh khỏi những
thiếu sót. Rất mong được sự đóng góp ý kiến của thầy cô và bạn bè để đề tài
hoàn thiện hơn.
Tôi xin chân thành cảm ơn!
Hà Nội, ngày 25 tháng 8 năm 2014
Học viên Tạ Thu Lan N
DANH
1
CH 2
2.2.3. Phương pháp cải tạo giống 18
2.2.4. Phương pháp lên men sinh tổng hợp kháng sinh 20
2.2.5. Phương pháp chiết xuất kháng sinh bằng dung môi hữu cơ 20
2.2.6. Thu bột kháng sinh bằng phương pháp cất quay 21
2.2.7. Phương pháp tinh chế kháng sinh bằng sắc ký 21
CH 23
23
23
24
25
26
tr 28
29
29
30
34
3.4.1. Kết quả phổ tử ngoại và đo nhiệt độ nóng chảy 34
3.4.3. Phổ khối và phổ cộng hưởng từ hạt nhân 36
CH 45
Streptomyces
21.123. 45
46
48
48
48
49
54
Bảng 2.1: Môi trường nuôi cấy vi sinh vật kiểm định
Bảng 2.2: Môi trường nuôi cấy xạ khuẩn
Bảng 3.1: Kết quả thử hoạt tính KS sau SLNN chủng Streptomyces
21.123
Bảng 3.2: Kết quả thử hoạt tính KS sau đột biến lần 1
Bảng 3.3: Kết quả thử hoạt tính KS sau đột biến lần 2
Bảng 3.4: Kết quả thử hoạt tính KS sau đột biến lần 3
Bảng 3.5: Kết quả thử hoạt tính KS chọn biến chủng lên men chìm
tốtnhất
Bảng 3.6: Kết quả thử hoạt tính KS chọn dung môi
Bảng 3.7: Kết quả thử hoạt tính KS của các phân đoạn sau chạy cột lần
1
Bảng 3.8: Kết quả SKLM các phân đoạn có hoạt tính KS lần 1
Bảng 3.9: Kết quả thử hoạt tính KS của các phân đoạn sau chạy cột
lần2
Bảng 3.10: Kết quả SKLM các phân đoạn có hoạt tính KS lần 2
Bảng 3.11: Thành phần kháng sinh tinh khiết thu được
Bảng 3.12: Kết quả phổ UV
Bảng 3.13: Các đặc trưng của phổ NMR của chất 2 so với actinomycin D
Bảng 3.14: Các đặc trưng của phổ NMR của chất 1 so với actinomycin D
sinh để điều trị các bệnh nhiễm trùng, kể cả các bệnh ung thư là công
nghệ gốc, các nước phát triển sở hữu loại công nghệ này, còn các nước
đang phát triển trong đó có Việt Nam gặp nhiều khó khăn trong việc làm
chủ, phát triển công nghệ kháng sinh. Nghiên cứu kháng sinh ngày nay
phát triển theo 3 hướng chính bao gồm lên men sinh tổng hợp, bán tổng
hợp và tổng hợp toàn phần, trong đó hướng sinh tổng hợp kháng sinh với
nhiều ưu điểm được sử dụng chủ yếu để tìm ra kháng sinh mới.
Bộ môn Vi sinh – Sinh học trường Đại học Dược Hà Nội trong nhiều
năm qua đã đầu tư nghiên cứu và phát hiện nhiều chủng xạ khuẩn phân
lập từ đất, bùn, … có khả năng sinh tổng hợp kháng sinh, trong đó có
chủng xạ khuẩn Streptomyces 21.123 có khả năng sinh tổng hợp
actinomycin D một kháng sinh chống ung thư. Năm 2007-2011, bộ môn
đã thực hiên đề tài nghiên cứu về chủng xạ khuẩn này và thu được một
số kết quả nhất định, kháng sinh tổng hợp được có tác dụng tốt trên
nhiều vi khuẩn nhưng hiệu suất sinh tổng hợp kháng sinh còn thấp,
kháng sinh cuối cùng thu được độ tinh khiết chưa cao. Bởi vậy, chúng tôi
lựa chọn đề tài Nghiên cứu nâng cao khả năng sinh tổng hợp
actinomycin D của Streptomyces 21.123” làm luận văn thạc sĩ để tiếp
tục nghiên cứu sâu hơn về chủng xạ khuẩn này. Luận văn mong muốn
đạt được những mục tiêu sau đây:
1. Chọn lọc, cải tạo giống để nâng cao hiệu suất sinh tổng hợp
actinomycin D.
2. Cải thiện khả năng chiết xuất và tinh chế actinomycin D từ hỗn
hợp kháng sinh thu được. 2
Xạ khuẩn chi này có khả năng tạo thành số lượng lớn các kháng
sinh ức chế vi khuẩn, vi nấm, các tế bào ung thư, virus và nguyên sinh
động vật. [1], [3], [4], [5], [9].
Vào tháng 2 năm 2007, tại Hàn Quốc các nhà khoa học đã phân
lập được chủng xạ khuẩn Streptomyces sp CS684 có khả năng sinh ra
chất kháng sinh laidlomycin có khả năng tiêu diệt các tụ cầu đã kháng lại
chất kháng sinh methicillin và các tụ cầu đã kháng vancomycin. [23]
Vào năm 2009, các tác giả Ấn Độ, phân lập mẫu đất nông nghiệp
ở Đông Uttar Pradesh, Ấn Độ được dòng xạ khuẩn chi Streptomyces có
khả năng sản xuất kháng sinh kháng khuẩn và kháng nấm tốt. [31]
1.1.3. Phân loại chi Streptomyces
Có nhiều khóa phân loại chi Streptomyces như khóa phân loại của
Waksman, Gauze…Khóa phân loại Streptomyces quốc tế (ISP) do
Shirling và Gottlieb đề xuất năm 1970 đã được sử dụng rộng rãi để phân
loại xạ khuẩn thuộc chi này. Khóa phân loại này dựa trên những đặc
điểm về màu sắc khuẩn lạc, màu sắc khuẩn ty cơ chất, sắc tố melanoid,
sắc tố hòa tan, hình dạng chuỗi bào tử, bề mặt bào tử, khả năng tiêu thụ
nguồn hydratcarbon. Ngoài ra, kỹ thuật xác định trình tự gen đã và đang
được áp dụng để phân loại Streptomyces. [21]
Vi sinh vật sinh tổng hợp kháng sinh phân lập được từ các cơ chất
tự nhiên thường có hoạt tính thấp. Vì vậy, muốn thu được chủng có hoạt
tính cao để đưa vào sản xuất công nghiệp cần phải sử dụng một cách
khéo léo các phương pháp cải tạo, tuyển chọn giống, đồng thời nghiên
cứu cải tạo môi trường nuôi cấy.
1.2.1. Sàng lọc ngẫu nhiên
Các vi sinh vật có sự biến dị tự nhiên theo các tần số khác nhau
trong đó có các cá thể có hoạt tính kháng sinh mạnh hơn từ 10-20% so
với các cá thể khác.
đòi hỏi thiết bị phức tạp.
* Nhược điểm: Khó cơ giới hóa, tự động hóa, khó vô trùng, tốn diện
tích, tốn nhân công, hiệu suất sử dụng trường không gian thấp.
5
Do nhược điểm đó nên ngày nay, phương pháp này không được ứng
dụng trong công nghiệp sản xuất kháng sinh mà chỉ áp dụng trong
nghiên cứu cải tạo giống trong phòng thí nghiệm.
Trong nghiên cứu về tối ưu hóa các thông số dinh dưỡng trong lên
men bề mặt sản xuất neomycin từ S.marinesis NUV-5 với thiết kế nghiên
cứu hai thông số trung tâm. Trong điều kiện nhân giống cấp I ở 30ºC,
nuôi lắc với tốc độ 220 vòng /phút trên môi trường có nguồn carbon là
tinh bột. Sau 48 giờ lên men ly tâm thu lấy tế bào cho vào 25 ml nước
muối sinh lý. Hỗn dịch này được bổ sung vào môi trường lên men bề mặt
trong điều kiện các yếu tố môi trường tối ưu, và nguồn carbon và nitơ có
ảnh hưởng tới sinh tổng hợp kháng sinh. Nồng độ kháng sinh cao nhất
đạt được là 17.150 mg/kg cơ chất đi kèm với bổ sung dung dịch vi lượng
để sinh tổng hợp kháng sinh đạt mức trên.
+ : Vi sinh vật (hiếu khí và kị khí) được nuôi cấy trong môi
trường lỏng
* Ưu điểm: Dễ cơ giới hóa, tự động hóa, dễ kiểm soát toàn bộ qui
trình, tốn ít diện tích, chi phí nhân lực thấp, hiệu suất quá trình lên men
cao.
* Nhược điểm: Đầu tư trang thiết bị kỹ thuật ban đầu lớn.
Các phương pháp lên men chìm: Lên men mẻ, lên men có bổ sung, lên
men bán liên tục, lên men liên tục. [4] [8]
+ Kháng sinh là những sản phẩm trao đổi chất thứ cấp. Tùy theo đặc
tính của loài mà kháng sinh được tiết vào môi trường nuôi cấy hay giữ
lại trong tế bào. Để thu lấy các chất có độ tinh khiết cao cần tìm phương
qua pha tĩnh nhờ áp suất hoặc trọng lực. Quá trình rửa giải được thực
hiện bằng cách thêm liên tục lượng mới của pha động. [2], [16]
+ Tinh chế
Thực hiện các phương pháp tinh chế để thu được kháng sinh tinh
khiết. Một trong các phương pháp tinh chế là sắc ký trên cột. Trong
phương pháp này một cột chứa chất nhồi cột làm pha tĩnh. Chất nhồi cột
có thể là celluose, dạng gel của acid silic không hoạt hóa, oxit nhôm,
7
silicagel , CaCO3…đó đều là các chất đã chuẩn hóa để đảm bảo kích
thước chuẩn. Dung môi trong phương pháp này là dung môi pha động.
Dựa vào kết quả thăm dò tách các thành phần kháng sinh bằng sắc ký
lỏng trên cột cho thích hợp. Ngoài ra các yếu tố ảnh hưởng đến kích
thước cột, kích cỡ hạt nhồi, dung tích mỗi phân đoạn cần lấy…
Một phương pháp khác đã được sử dụng để tinh sạch kháng sinh là
điện di mao quản. Các kháng sinh nhóm macrolid, erythromycin,
josamycin, và oleandomycin được phân tách trên cột silica hoặc styren –
divinylbenzen sắc ký pha đảo (erythromycin), tại pH tối ưu 5 -9, nồng độ
dung dịch điện phân tối ưu là 20 mM trong đệm phosphat 7.5, đường
kính mao quản tối ưu là 75 µm, chiều dài ống thích hợp nhất là 100 cm.
Nồng độ mẫu tiêm trong hỗn hợp methanol/nước = 1 / 4. Phương pháp
này mở ra hướng mới về phân tích các chất có tính chất hóa học khá
giống nhau, hoặc các đồng phân quang học. Kháng sinh từ chủng mới
phân lập S. violaceusniger HAL64 được tinh sạch theo phương pháp sắc
ký lỏng trên cột với chất nhồi cột là silicagel (kích thước đường kính
trong 3 cm *25 cm chiều dài), dung môi chạy là hỗn hợp gradien
ethylacetat : methanol (tỷ lệ 10:1 đến 1:10), thu được 2 phân đoạn trên
tổng số 8 phân đoạn có hoạt tính thứ nhất (A) và phân đoạn thứ 4 (D).
Phân đoạn A tinh sạch tiếp trên cột cephadex LH - 20 và rửa giải bằng
hỗn hợp ethylacetat : methanol (1 : 5) và thu được 5 phân đoạn từ A1
ung thư lá nuôi ở thời kỳ thai nghén, u Wilm, sarcom Kaposi, sarcom
Ewing, sarcom cơ vân, carcinoma tinh hoàn…
9
Đường dùng tiêm tĩnh mạch, liều lượng tùy thuộc vào thể trạng của
bệnh nhân. [7], [19].
1.6.
Trong nghiên cứu STH KS, người ta thường sử dụng các phương
pháp đo phổ sau để nghiên cứu cấu trúc KS.
1.6.1. Phổ hồng ngoại (IR)
Trong phân tử khi có nhóm nguyên tử nào đó hấp thụ
năng lượng và thay đổi trạng thái dao động thì tạo nên một dải hấp thụ
trên phổ IR. Có mối tương quan giữa nhóm nguyên tử và dải hấp thụ nên
có thể dựa vào sự có mặt của dải hấp thụ để nhận biết một nhóm chức
nào đó.
1.6.2. Phổ tử ngoại (UV-VIS)
Dựa trên sự hấp thụ năng lượng các bức xạ ánh sáng
vùng UV - VIS bởi các phân tử của chất nghiên cứu làm thay đổi mức
năng lượng điện tử (E
0
,
E
1
,
E
2
). Giữa cấu trúc hóa học và quang phổ
hấp thụ có mối quan hệ chặt chẽ, chỉ có những phân tử nào có điện tử dễ
ta quan tâm tới: Đội bội của tín hiệu cộng hưởng; Tỷ lệ cường độ của
các vạch tín hiệu; Hằng số tương tác spin-spin.
* Diện tích dưới tín hiệu: cho biết số lượng tương đối của proton cho
tín hiệu.
+
13
C-NMR: Về nguyên lý cũng giống như
1
H-NMR nhưng ở đây
hạt nhân cho tín hiệu cộng hưởng là
13
C. Thang độ chuyển dịch hóa học
từ 0-200ppm.
1.6.4. Khối phổ (MS)
Khối phổ là kỹ thuật đo trực tiếp tỷ số khối lượng và
điện tích của ion (m/z) được tạo thành trong pha khí từ phân tử hoặc
nguyên tử của mẫu. Dùng chùm điện tử có năng lượng trung bình (50-
100eV) để bắn phá phân tử hữu cơ ở chân không cao (10
-6
mmHg). Trong
quá trình đó chất hữu cơ bị ion hóa và bị phá vỡ thành mảnh. Các tín
hiệu thu được tương ứng với các ion sẽ thể hiện bằng một số vạch (pic)
có cường độ khác nhau tập hợp thành một khối phổ đồ.
11
Khối phổ cung cấp thông tin định tính (khối lượng phân tử, nhận
dạng các chất) xác định cấu trúc và định lượng các chất. [2], [6], [16].
1.7. Các nghiên cu v chng x khun Streptomyces 21.123
Trong khóa luận “ Góp phần nghiên cứu lên men sinh tổng hợp
kháng sinh từ Streptomyces 21.123” năm 2007 của tác giả Nguyễn Thị
HPO
4
1,5 g/l và CaCO
3
2 g/l. Đối với thí nghiệm được thực hiện trong bình lên
12
men, tối ưu hóa với các thành phần sau: fructose 30 gam/L, sữa đậu nành
30 g/l và CaCO
3
2 g/l. Trong tất cả các thí nghiệm, độ pH được điều
chỉnh từ 7,0-7.2.
S. parvulus ATCC 12434 sinh ra actinomycin, có hoạt tính sinh
học lớn nhất (152mg/l) và chỉ cung cấp actinomycin D. Nghiên cứu
nhằm cải thiện khả năng sản xuất kháng sinh trong các bình lắc bằng
việc thay thế glucose bằng fructose nồng độ 20, 30 và 40g/l. Sự thay thế
này làm gia tăng khả năng sản xuất kháng sinh, đạt nồng độ cao nhất
635mg/l với nồng độ fructose 30g/l. Thí nghiệm trong bình lên men với
các mức cấp khí khác nhau (0,5; 1 và 1,5vvm), tốc độ khuấy khác nhau
(300 và 500 rpm). Môi trường lên men cho thấy hoạt động lưu biến của
dung dịch dạng chất dẻo.
Kết quả cho thấy lượng kháng sinh được sản xuất lớn nhất (1530
mg/l) với vận tốc cấp khí là 1,5vvm và tốc độ khuấy 500rpm phần lớn
sản phẩm thu được từ chủng S.parvulus
DAUFPE 3124 khi nuôi cấy trong
trong bình lắc. [27].
Trong một nghiên cứu được công bố bởi nhóm tác giả thuộc Bộ
Khoa học và Công nghiệp của Ấn Độ, bằng phương pháp giải trình tự
trong bình lên men 5 lít và 500 lít được thực hiện và kết quả là lên men
trên máy lắc cho kết quả tốt nhất, còn lên men trong bình 5 lít và 500 lít
cho kết quả tương đương tuy nhiên kém hơn lên men trên máy lắc nhiều.
Từ dịch lọc lên men kháng sinh chiết được tốt nhất bằng ethylacetat ở
pH 5,0. Sắc ký lớp mỏng và sắc ký cột cho thấy hỗn hợp kháng sinh có ít
nhất 4 thành phần. Trong đó thành phần chính được tinh chế bằng sắc ký
cột Silica gel, cột oxit nhôm, và cột Shephadex có hiệu suất 66%. Bước
đầu các tác giả đã xác định giá trị MIC của kháng sinh này khá thấp: từ
0,11-0,30 µg/ml đối với S. aureus, P. mirabilis, S. flexneri, S. typhi.
Tác giả sử dụng dịch chiết ethyl acetat của dịch lên men kháng sinh
Streptomyces microflavus được loại dung môi (5,0 gam cặn chiết) và
phân lập bằng các phương pháp sắc ký kết hợp sử dụng chất hấp phụ là
14
silica gel pha thường, pha đảo, với các hệ dung môi thích hợp thu được
chất kháng sinh chính 1 (1,0 g).
Tác giả tiến hành đo phổ cộng hưởng từ hạt nhân và biện giải phổ,
tác giả xác định được hợp chất 1 là actinomycin X
2
, một hợp chất cũng
được phân lập từ chủng Streptomyces spp. và có hoạt tính chống ung thư
cũng như hoạt tính kháng sinh rất mạnh.[13], [14]
Actinomycin X2 cũng được công bố năm 2006 bởi các nhà khoa
học Mỹ, một kháng sinh chống ung thư bạch cầu mạnh hơn actinomycin
D gấp nhiều lần. Actinomycin X2 thu được từ chủng xạ khuẩn thuộc
Streptomyces sp có ký hiệu MITKK 103 phân lập từ đất của một chậu
hoa. Dựa vào kết quả giải trình tự gen các tác giả đưa đến kết luận chủng
MITKK 103 có trình tự gen tương đồng (98,5-100%) với Streptomyces
galbus, Streptomyces griseofuscus, Streptomyces padanus. Trên cơ sở
các nghiên cứu tiếp theo nhóm tác giả đã đưa ra kết luận MITKK 103 là
butyl acetate, n hexan, methanol, propanol, triethylamin
2.1.3. Một số dụng cụ, máy móc
* Máy lắc Taitec Bio – Shaker BR 300 Lf
* Tủ ấm Memmert, Binder
* Tủ cấy vô trùng Aura VF 48
* Tủ sấy SL shellab, tủ lạnh
* Nồi hấp vô trùng Hirayama Model HL 3030
* Máy cất quay Buchi Waterbath B480
* Cân kỹ thuật, cân phân tích Sartorius
Các tác nhân gây đột biến: ánh sáng tử ngoại, HNO
2
.
2.1.4. Môi trường
Môi trường nuôi cấy VSV kiểm định: môi trường canh thang,
môi trường thạch thường.
16
ng 2.1 [g/100ml]
Thành phần
MT
NaCl
(%)
Cao thịt
(%)
Pepton
0,1
0,1
NaCl
0,05
0,05
K
2
HPO
4
0,05
0,05
MgSO
4
.7H
2
O
0,05
0,05
Thạch
1,8
0,0
Nước (ml)
100
100
pH
7,0-7,2
6,8-7,2
Các môi trường đều được tiệt trùng bằng hơi nước ở 1atm / 30 phút
đường kính 6mm lên bề mặt môi trường đã cấy vi khuẩn kiểm định.
- Phương pháp khoanh giấy lọc: khoanh giấy lọc đường kính 6 mm
đã tẩm 3 lần dịch chiết chứa mẫu thử (dịch chiết bằng dung môi hữu cơ,
dịch hòa tan bột kháng sinh) và sấy khô ở nhiệt độ 50
0
C được đặt lên bề
mặt môi trường đã cấy VK kiểm định.
- Phương pháp giếng thạch: nhỏ dịch nước chứa mẫu thử vào các
giếng 6 mm đã được đục trên bề mặt môi trường đã cấy vi khuẩn kiểm
định, với thể tích 0,05ml.
Nuôi cấy các đĩa Petri ở 37
0
C trong tủ ấm 18-24 giờ. Đo đường
kính vòng vô khuẩn bằng thước kẹp Palmer có độ chính xác đến
0,02mm.
* Bước 4: Đánh giá kết qủa dựa vào đường kính vòng vô khuẩn và
được đánh giá theo công thức:
Copyright: Tài liệu đại học ©