BỘ Y TẾ
TRƢỜNG ĐẠI HỌC DƢỢC HÀ NỘI TRẦN ANH HOÀNG

NGHIÊN CỨU QUY TRÌNH
CHIẾT XUẤT VÀ TÁC DỤNG GIẢI
LO ÂU TRÊN THỰC NGHIỆM CỦA
CAO CHIẾT TỪ CÂY BAN DI THỰC
HYPERICUM PERFORATUM L. KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP DƢỢC SĨ

HÀ NỘI - 2015
BỘ Y TẾ
TRƢỜNG ĐẠI HỌC DƢỢC HÀ NỘI TRẦN ANH HOÀNG


người cô và người thầy luôn hết lòng giúp đỡ, tạo điều kiện và đóng góp quý báu để
em hoàn thành tốt khóa luận này.
Em xin chân thành cảm ơn đến các chị Nguyễn Thu Trang, chị Tạ Thị
Thủy- Khoa hóa thực vật 1 và các anh chị Khoa Dược lý Sinh hóa – Viện Dược liệu
đã động viên giúp đỡ em cả về vật chất lẫn tinh thần để em có thể hoàn thành tốt
khóa luận.
Em xin chân thành cảm ơn Ban giám hiệu nhà trường, Đảng ủy nhà trường
cùng toàn thể các thầy cô giáo Trường đại học Dược Hà Nội đã trang bị đầy đủ kiến
thức và động viên, giúp đỡ em trong suốt quá trình học tập và nghiên cứu tại
trường.
Cuối cùng em xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới gia đình và bạn bè đã luôn là
chỗ dựa tinh thần, là những nguồn động viên to lớn đối với em ttrong cuộc sống và
học tập.

Sinh viên
Trần Anh Hoàng
MỤC LỤC Trang
DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CÁC CHỮ VIẾT TẮT

16
2.3. Phương pháp nghiên cứu
16

16


17

19
Chƣơng 3. THỰC NGHIỆM, KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN
21
3.1. Xây dựng đường chuẩn định lượng hypericin
21
3.2. Khảo sát quy trình chiết cao Ban di thực
22

22

23

25

26

27
3.3. Đánh giá tác dụng giải lo âu trên chuột.

HIV
Human immunodeficiency virus (virus gây suy giảm miễn dịch ở người)
HPLC
High-Performance Liquid Chromatography (sắc ký lỏng hiệu năng cao)
IC50
nồng độ ức chế mức 50%
LT
Light therapy ( liệu pháp ánh sáng)
Rha
Rhamnosyl
SAD
Seasonal affective disorder (trầm cảm theo mùa)
SSRI
Selective serotonin reuptake inhibitor (nhóm thuốc ức chế tái hấp thu
chọn lọc serotonin)
USP
United States Pharmacopoeia (Dược điển Hoa Kỳ)

DANH MỤC CÁC BẢNG

Tên bảng
Trang
Bảng 3.1. Diện tích pic sắc ký của hypericin ở các nồng độ khác nhau
21
Bảng 3.2. Khối lượng và hàm lượng hypericin trong cao chiết bằng cồn
các nồng độ khác nhau.
23

Hình 1.5. Cấu trúc hóa học một số chất nhóm phenylpropanoid.
7
Hình 1.6. Sơ đồ quy trình chiết xuất cao chứa hypericin từ dược liệu
Ban Âu.
14
Hình 3.1. Đồ thị biểu diễn sự phụ thuộc tuyến tính giữa nồng độ và diện
tích pic sắc ký của hypericin.
21
Hình 3.2. Sơ đồ quy trình chiết xuất với các điều kiện đã khảo sát
29
Hình 3.3. Biểu đồ hình cột biểu diễn thời gian chuột ở vùng trung tâm
(giây).
31

1

ĐẶT VẤN ĐỀ

Cây Ban Âu là một cây thuốc quý được sử dụng ở Châu Âu từ cách đây 2000
năm. Trên thế giới đã có rất nhiều nghiên cứu về cây Ban Âu với các thành phần
chính như hypericin, hypeforin, flavonoid, [20][45][49][52][59] có tác dụng giải lo
âu qua đó làm mất các tình trạng u sầu, buồn chán, thất vọng lấy lại thăng bằng
cuộc sống, do đó cây Ban Âu đang được sử dụng để điều trị bệnh trầm cảm thể nhẹ
[15][30][37][40][42][54]. Ngoài ra cây Ban Âu còn có tác dụng chống viêm, kháng
khuẩn, kháng virus [9][21] Hiện nay tại Châu Âu, đã có rất nhiều sản phẩm từ cây
Ban Âu được phép lưu hành thị trường dưới nhiều dạng bào chế khác nhau như
thuốc mỡ, viên nén, viên nang
Cây Ban Âu khi di thực về Việt Nam với tên gọi là Ban di thực đã được Viện
Dược liệu trồng thử nghiệm tại trạm nghiên cứu Sa Pa, Tam Đảo, Hà Nội và Tân
Lạc - Hòa Bình cho thấy cây phát triển tốt, cho hàm lượng hypericin cao [1]. Đã có

nhưng cây thường được biết đến qua tên St. John’s Wort vì loại cây này nở hoa màu
vàng rất đẹp vào ngày kỷ niệm sinh nhật Thánh John, 24 tháng Sáu mỗi năm. Tên
chi Hypericum được bắt nguồn từ một từ Hy Lạp – Hyper là ở trên và eikon là bức
ảnh nói đến truyền thống sử dụng cây để phòng trừ quỷ dữ bằng cách treo cây trong
nhà trong ngày lễ Thánh John. Tên loài chỉ sự có mặt của tuyến dầu nhỏ trong lá,
mà khi giữ dưới ánh sáng nhìn nó giống như ô cửa sổ.
Vào thời Trung cổ, Ban Âu đã được dùng để trừ ma qủy, làm trong sạch
không khí. Từ nhiều thế kỷ trước, nó được coi như có thể chữa được bệnh u sầu,
nhiễm trùng đường tiểu, diệt vi trùng, làm lành vết thương ngoài da.
Vào thế kỷ 19, King (1876) đã viết trong American Dispensatory về việc dùng
Ban Âu để chữa ỉa chảy, bệnh vàng da, trầm cảm và u sầu. Một dạng cồn thuốc từ
Ban Âu đã được chính thức đưa vào sử dụng chữa đau cột sống, choáng, sốc, chứng
kích động. 3

Duke (1985) liệt kê các bệnh được điều trị bằng Ban Âu theo dân gian gồm có:
hen phế quản, ỉa chảy, lỵ, suy nhược thần kinh, trầm cảm, kích động, bệnh dại, thiếu
máu, giun sán, ung thư tử cung, ung thư đường niệu, ung thư dạ dày và u lympho.
Từ những năm 1970 trở lại đây, Ban Âu đã trở thành một trong những cây
thuốc được quan tâm nghiên cứu nhiều nhất cả trong phòng thí nghiệm và trên lâm
sàng. Hàng loạt các nghiên cứu về sinh lý thực vật, hóa học, dược lý, dược động
học đã được thực hiện. Các thành phần hoạt chất chính đã được xác định là
naphthodianthron, anthroglycosid, flavonoid và phloroglucin. Cây thuốc này đã trở
nên một cây thuốc phổ biến trong điều trị trầm cảm mức độ nhẹ và trung bình. Các
chế phẩm từ Ban Âu được bán ở khắp các siêu thị và nhà thuốc ở Mỹ và châu Âu.
1.2. Thành phần hóa học
Thành phần các chất đã được xác định có trong cây Ban Âu bao gồm:
naphthodianthron, phloroglucinol, flavonoid, biflavon, phenylpropanoid và

3
C
O HR
O HOH
O
O

Protohypericin R = CH
3

Pseudoprotohypericin R= CH
2
OH
1.1. 
Hypericin và pseudohypericin có chủ yếu trong hoa và lá ban Âu. Hàm lượng
của chúng thay đổi theo thời kỳ sinh trưởng của cây và cao nhất khi cây ra hoa (từ
0,03% - 0,3% so với dược liệu khô). Hàm lượng pseudohypericin thường cao hơn
hypericin 2 đến 4 lần [15].
Các hợp chất naphthodianthron này rất ít tan trong hầu hết các dung môi.
Hypericin tinh khiết hầu như không tan trong nước ở điều kiện thường. Hypericin
tan trong các dung dịch kiềm, các bazơ hữu cơ như pyridin và các dung môi hữu cơ
phân cực như aceton, methanol, ethyacetat, ethyl methyl ceton. Khi tan trong các
dung dịch này, hypericin tạo ra các dung dịch màu đỏ có bước sóng phát xạ là
600nm [2].
Hypericin và dẫn chất là thành phần đặc trưng và đáng chú ý nhất trong ban
Âu do chúng có tác dụng chống ung thư, chống virus và chống trầm cảm. Đặc biệt,
hypericin là một trong những hợp chất tự nhiên nhạy cảm ánh sáng nhất. Đặc tính
này đã được khai thác sử dụng trong liệu pháp quang động điều trị ung thư vì
hypericin kết hợp với ánh sáng rất hiệu quả trong việc gây chết theo chương trình
hoặc gây hoại tử tế bào ung thư [3][6].

Hy Lạp [20].
Hyperforin rất kém bền, đặc biệt trong dung dịch nước và khi tiếp xúc ánh
sáng và nhiệt độ cao [32]. Không thấy có hoặc có rất ít chất này trong các loại chế
phẩm và trà từ Ban Âu.
Hyperforin có tác dụng ức chế hoặc điều hòa một số hệ dẫn truyền thần kinh,
ức chế mạnh serotonin, dopamin và noradrenalin với IC
50
khoảng 0,5mg/L [18]. Do
đó có thể nó cũng có vai trò trong tác dụng chống trầm cảm của dược liệu Ban Âu.
Ngoài ra, hyperforin còn được chứng minh là chất chống ung thư [48], chống ký
sinh trùng sốt rét [55].

6

1.2.3. Flavonoid
Flavonoid là một nhóm hoạt chất có hàm lượng 2-4% trong dược liệu Ban Âu.
Các flavonol aglycon đã phân lập được gồm có kaempferol, luteolin, myricetin và
quercetin [20][35][36][45]. Trong các glycosid phân lập được từ Ban Âu có
hyperosid (hyperin) rutin, quercitrin, isoquercitrin, miquelianin và astilbin
[16][20][45][46].
Các flavonoid trong Ban Âu cũng góp phần vào tác dụng chống trầm cảm của
dược liệu này và được chứng minh là các chất hiệp đồng tăng cường tác dụng của
các hoạt chất như hypericin [15][59].
Ngoài ra, các flavonoid trong Ban Âu cũng có hoạt tính kháng khuẩn [35].
OHO
OH
OH

OHO
OH O
OH
O
HO
OH O
OHAmentoflavon
OHO
OH
OH
O
O
HO
OH O
OH

3,8’’-Biapigenin
1.4. 
1.2.5. Phenylpropanoid
Acid chlorogenic được xác định có khoảng 1% trong cao chiết Ban Âu [20]
[36]. Ngoài ra còn có acid caffeic, acid p-coumaric, acid ferulic, acid isoferulic, acid
gentisic và acid shikimic [24].
O
O
OH
HO
HO COOH

- Hợp chất xanthon: 1,3,6,7-tetrahydroxyxanthon và kielcorin C (0,01%).
- Carotenoid, choline, nicotinamid, -sitosterol, acid béo, aminoacid, vitamin
C, pectin, tannin hydroperoxycadiforin [24].
1.3. Tác dụng dƣợc lý
Cây Ban Âu có rất nhiều tác dụng điều trị bệnh khác nhau. Những tác dụng
dược lý của cây do các thành phần đa dạng của cây đem lại, đặc biệt là hai thành
phần hypericin và hyperforin.
1.3.1. 
Một trong những tác dụng rõ rệt nhất của Ban Âu phải kể đến là tác dụng
chống trầm cảm, trong đó 2 thành phần hypericin và hyperforin được cho là những
hoạt chất đóng vai trò quan trọng trong việc điều trị bệnh này.
Cơ chế tác dụng chống trầm cảm của hypericin là do ức chế sự tạo thành
cytokine interleukin 6 và 1β ở bạch cầu đơn nhân, dẫn đến làm giảm giải phóng
corticotropin, do đó giảm sự tạo thành cortisol [55]. Hypericin cũng có thể ức chế tái
thu hồi serotonin, norepinephrine và dopamine dẫn đến giảm mức độ biểu hiện của
beta adrenoreceptor và tăng mức độ biểu hiện của receptor serotonin 5-HT2A và 5-
HT1A [37][42][54].
Những nghiên cứu gần đây cũng đã chỉ ra rằng hyperforin cũng có thể là thành
phần có tác dụng chống trầm cảm [15][30]. Rất nhiều cơ chế chống trầm cảm khác
nhau của hypeforin đã được giả định, bao gồm ức chế sự tái thu hồi serotonin,
norepinephrine và acetylcholine. Một số nghiên cứu khác lại chỉ ra rằng hyperforin
tác động đến serotonin, dopamin, norepinephrine, acid γ-aminobutyric, và L-
glutamate, mặc dù serotonin được cho là đóng vai trò quan trọng nhất [43]. Ngoài ra
còn có một số cơ chế khác như giảm biểu hiện beta adrenoreceptor ở vỏ não và
receptor 5-HT2 và giải phóng synaptosome [42].
Một số thành phần khác của Ban Âu như flavonoid cũng có tác dụng ức chế
monoamine oxidase A [10][42][56]. 9

10

Hiện nay ở Hoa Kỳ, Ban Âu được rất nhiều người dùng để chữa trầm cảm vì
được coi là an toàn, công hiệu, rẻ tiền và không cần bác sĩ kê đơn.
1.3.2. 
Trong những năm gần đây, nhiều người cho rằng quá nhiều gốc tự do trong cơ
thể hoặc một số yếu tố môi trường khác như các thuốc diệt côn trùng, đặc biệt là
rotenon có thể dẫn đến Parkinson. Vì vậy, với đặc tính chống oxi hóa, cây Ban Âu
được lựa chọn thử nghiệm trên mô hình động vật mắc bệnh Parkinson gây ra bởi
rotenon. Để xác định thành phần nào trong cây có hoạt tính chống oxi hóa thần kinh,
nhóm nghiên cứu ở Đại học Complutense tại Madrid (UCM) đã tiến hành nhiều thí
nghiệm với các chiết xuất từ ban Âu. Kết quả cho thấy dịch chiết từ loài thực vật này
có tác dụng làm giảm tác hại của rotenon trên mô hình động vật. Các thông số về
nồng độ các enzym chống oxy hóa như superoxid dismutase, catalase, glutathione
peroxidase chứng tỏ dịch chiết từ Ban Âu làm tăng nồng độ các loại enzym này. Tác
động bảo vệ neuron thần kinh ở vùng chất đen trong não (Substantia Nigra) cao nhất
ở lô thí nghiệm với dịch chiết chứa 0,3% hypericin. Điều này cho thấy hoạt tính
chống oxi hóa của cây do nhiều thành phần hợp thành [1].
1.3.3.  
Hypericin là thành phần có tác dụng điều trị ung thư. Cơ chế tác động của
hypericin là kính thích hình thành các gốc tự do dưới tác dụng của ánh sáng và chính
sự sản xuất các gốc tự do này dấn tới phản ứng gây độc cho tế bào ung thư. Do đó, nó
được dùng trong liệu pháp quang động điều trị ung thư [3][5][6][25].
Hypericin có tác dụng chống ung thư trong liệu pháp quang động dưới sự có
mặt của ánh sáng [6], hoạt động chống ung thư trong bóng tối của hypericin cũng đã
được nghiên cứu [11][25][56].
Những nghiên cứu về hyperforin cũng đã chứng minh rằng hoạt chất này có tác
dụng chống khối u trên động vật và in vitro [25]. Hyperforin có tác dụng ức chế sự
sinh trưởng đối với ung thư vú ở người và ở động vật in tro cũng như trên các dòng tế
bào ung thư tế bào sừng, ung thư hắc tố, ung thư hạch bạch huyết tốt hơn hoặc bằng

dược liệu này đều cho tác dụng tốt.
Do hiệu quả điều trị chống trầm cảm của cây Ban Âu và thực tế cho thấy cả
trầm cảm và chứng nghiện rượu đều có chung những chất dẫn truyền thần kinh nên
loại thực vật này cũng đã được nghiên cứu về tác dụng có lợi đối với những người 12

nghiện rượu. Những khảo sát trên người tình nguyện đã cho thấy mức độ uống rượu
ở những đối tượng này đã giảm đáng kể sau khi dùng cao chiết Ban Âu[44].
1.3.6. 
Khi sử dụng Ban Âu để điều trị trầm cảm, có thể sẽ có một số tác dụng phụ
không phổ biến hoặc nhẹ như khô miệng, chóng mặt, táo bón, vấn đề về dạ dày -
ruột, và nhầm lẫn [51].
Hypericin là chất có tính nhạy cảm với ánh sáng mạnh vì vậy một số nghiên
cứu đã chỉ ra rằng Ban Âu có thể gây ảnh hưởng đến da và mắt do tính nhạy cảm
với ánh sáng [13][23][31].
Ngoài ra, dịch chiết của Ban Âu có xảy ra tương tác thuốc khi sử dụng một số
liệu pháp điều trị khác. Tương tác của những thuốc này thông qua enzyme CYP-
450-3A4 trong gan làm giảm hoạt tính của một vài thuốc như warfarin, cyclosporin,
thuốc tránh thai, theophylline [7][35][36]. Do vậy, cảnh báo đối với những bệnh
nhân dương tính với HIV đang điều trị chất ức chế protease, bệnh nhân ung thư
đang được điều trị hóa trị liệu, và những bệnh nhân ghép cơ quan đang điều trị
thuốc ức chế miễn dịch không nên dùng kết hợp với Ban Âu. Không nên dùng kết
hợp giữa Ban Âu với thuốc chống trầm cảm ức chế chọn lọc thu hồi serotonin SSRI
[26].
1.4. Các quy trình chiết xuất Ban Âu trong và ngoài nƣớc
1.4.1. 
Viện Dược liệu đã nghiên cứu di thực thành công cây Ban Âu Hypericum
perforatum L. trong đề tài cấp Bộ Y tế “Nghiên cứu di thực và quy trình trồng

hyperforin, 0,9% hypericin và 1% diapigenin với hiệu suất 8% so với dược liệu ban
đầu [12]. Một phương pháp loại tạp và tinh chế khác đã được Koch et al. (2007) sử
dụng là đưa cao toàn phần lên cột Diaion HP-20, rửa giải bằng ethanol 92% và
aceton 100% thu được sản phẩm chứa 6,3% hyperforin, 0,5% hypericin và 6,4%
flavon [28].
Các biện pháp ổn định sản phẩm, chống oxy hóa hoạt chất đã được Erdelmeier
et al. (2001), Koch et al. (2007) sử dụng gồm có: sục khí trơ cho dung môi chiết,
tránh ánh sáng, dùng chất phụ gia chống oxy hóa như acid ascorbic [19][28].14


đến dịch đặc
Cao đặc
Sản phẩm
Sấy chân không, tº<60ºC đến khô 15

Chƣơng 2. ĐỐI TƢỢNG VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
2.1. Nguyên vật liệu, thiết bị

Phần trên mặt đất của cây Ban di thực từ Nhật Bản được trồng tại Trạm nghiên
cứu cây thuốc Tam Đảo mùa vụ 2013-2014 được thu hoạch khi cây bắt đầu ra hoa
vào tháng 8/2014. Dược liệu sau khi phơi khô có:
- Độ ẩm 9,77%.
- Tro toàn phần 6,4%.
- Hàm lượng hypericin (%) phương pháp HPLC so với chất chuẩn ( phytolab-
Đức) là 0,19%.

Chuột nhắt trắng chủng Swiss, trọng lượng trung bình 20 -22 g cung cấp bởi
Viện Vệ sinh Dịch tễ Trung ương được nuôi ổn định ít nhất 1 tuần trước khi tiến
hành thí nghiệm.
2.1.3
- Dung môi chiết xuất được sử dụng để chiết suất là EtOH công nghiệp cất lại.
- Dung môi dùng để pha chế định lượng là dung môi tinh khiết Trung Quốc:
acetonitril, methanol
- Dung dịch Hypericin chuẩn của phytolab – Đức.
2.1.4
- Dụng cụ bình cầu, bình nón, bình chiết quả lê, phễu lọc, của các hãng
Bomex, IsoLAB.

đến khối lượng m
1
bằng hỗn hợp dung môi chiết. Tiến hành lọc thu được dịch chiết,
dịch chiết được lọc qua màng cellulose 0,45 µm thu được dịch phân tích HPLC có
nồng độ chính xác khoảng 20 mg/ml.
- : Cân chính xác khoảng 0,2g cao, cho vào bình định mức 10ml.
Bổ sung chính xác hỗn hợp dung môi Acetonitril : methanol (tỷ lệ 1:1). Lọc qua
màng lọc cellulose 0,45 µm thu được dung dịch phân tích.

17

*Chuẩn bị mẫu chuẩn
Cân chính xác khoảng 5 mg chất chuẩn Hypericin, hòa tan hoàn toàn trong
chính xác 5 ml hỗn hợp Acetonitril : methanol (tỷ lệ 1:1), lắc đều, thu được dung
dịch Hypericin chuẩn có nồng độ chính xác khoảng 1 mg/ml. Từ dung dịch này, tiến
hành pha loãng bằng hỗn hợp Acetonitril : methanol (tỷ lệ 1:1) để thu được các
dung dịch chuẩn với nồng độ nhỏ hơn.
Tất cả các dung dịch này đều được lọc qua màng cellulose 0,45 µm trước khi
tiến hành phân tích HPLC.
*Điều kiện sắc ký
- Cột: C18 (150 mm x 4,6 mm; 5 µm)
- Pha động: Acetonitril : methanol : nước (50 : 20 : 30)
- Tốc độ dòng: 0,5 ml/phút
- Chế độ rửa giải: đẳng dòng
- Thể tích mẫu tiêm vào cột: 10 µl
- Bước sóng định lượng: 590 nm.
*Xử lý kết quả: