BỘ Y TẾ
TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI
NGUYỄN THỊ THÙY LINH

XÂY DỰNG PHƯƠNG PHÁP
PHÂN TÍCH PHÁT HIỆN NHANH
THUỐC GIẢ BẰNG PHỔ RAMAN
KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP DƯỢC SĨ HÀ NỘI – 2015 BỘ Y TẾ
TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI
NGUYỄN THỊ THÙY LINH

XÂY DỰNG PHƯƠNG PHÁP
PHÂN TÍCH PHÁT HIỆN NHANH
THUỐC GIẢ BẰNG PHỔ RAMAN

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP DƯỢC SĨ


Sinh viên Nguyễn Thị Thùy Linh MỤC LỤC
ĐẶT VẤN ĐỀ 1
CHƯƠNG 1. TỔNG QUAN 3
1.1. Tổng quan về thuốc giả 3
1.2. Tổng quan về Isoniazid và Ethambutol 5
1.2.2. Danh pháp 5
1.2.2. Các phương pháp định tính Isoniazid và Ethambutol 6
1.3. Tổng quan về phương pháp quang phổ Raman 7
1.3.1. Lịch sử phát triển 7
1.3.2. Nguyên lý cơ bản của quang phổ Raman 9
1.3.3. Nguyên tắc cấu tạo của thiết bị quang phổ Raman 12
1.3.4. Ưu nhược điểm của quang phổ Raman 13
1.3.5. Một số ứng dụng của quang phổ Raman trong thực tiễn 17
CHƯƠNG 2. ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 18
2.1. Nguyên vật liệu, thiết bị 18
2.1.1. Nguyên vật liệu 18
2.1.2. Thiết bị 18
2.2. Nội dung nghiên cứu 19
2.3. Phương pháp nghiên cứu 19
CHƯƠNG 3. THỰC NGHIỆM, KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN 21
3.1. Công thức bào chế viên nén và viên nang của các hoạt chất dùng
trong nghiên cứu 21
3.1.1. Công thức bào chế viên nén và viên nang của hoạt chất Isoniazid 21
3.1.2. Công thức bào chế viên nén và viên nang của hoạt chất

NIR Near Infrared Hồng ngoại gần
IR Infrared Hồng ngoại
S/N Signal-to-noise Tỷ lệ tín hiệu trên nhiễu
UV-VIS Ultraviolet–visible Tử ngoại-khả kiến
TLTK Tài liệu tham khảo
TT Thuốc thửDANH MỤC CÁC BẢNG
STT Bảng Nội dung Trang
1 Bảng 1.1 Tỉ lệ thuốc kém chất lượng qua các năm từ 2009 - 2013 3
2 Bảng 1.2
Tỉ lệ thuốc đông dược, dược liệu không đạt chất lượng từ
năm 2009-2013
3
3 Bảng 1.3 Tỉ lệ thuốc giả qua các năm từ 2009-2013 4
4 Bảng 3.1 Công thức bào chế viên nén Isoniazid 21
5 Bảng 3.2 Công thức bào chế viên nang Isoniazid 23
6 Bảng 3.3 Công thức bào chế viên nén Ethambutol 24
7 Bảng 3.4 Công thức bào chế viên nang Ethambutol 26
8 Bảng 3.5
Tỉ lệ cường độ Raman ở các đỉnh đặc trưng của phổ chuẩn
Isoniazid
32
9 Bảng 3.6
Các đỉnh đặc trưng của viên chứa hoạt chất Isoniazid thực
chế tạo
33
10 Bảng 3.7
Các đỉnh đặc trưng và tỉ lệ cường độ Raman ở các đỉnh


chứa Isoniazid so với thư viện phổ đã thiết lập.
18 Bảng 3.15
Bảng kết quả đo phổ Raman của chế phẩm khảo sát có
chứa Ethambutol so với thư viện phổ đã thiết lập
48

18 Hình 3.14 Phổ Raman của viên nén placebo Ethambutol CT2 38
19 Hình 3.15 Phổ Raman của viên nang placebo Ethambutol CT3 38
20 Hình 3.16 Phổ Raman của viên nang placebo Ethambutol CT4 39
21 Hình 3.17 Phổ Raman của viên nén Ethambutol CT1 39
22 Hình 3.18 Phổ Raman của viên nén Ethambutol CT2 40
23 Hình 3.19 Phổ Raman của viên nang Ethambutol CT3 40
24 Hình 3.20 Phổ Raman của viên nang Ethambutol CT4 41
25 Hình 3.21 Phổ Raman của viên nang chứa 50% Ethambutol CT3 43 26 Hình 3.22 Phổ Raman của viên nén chứa 50% Ethambutol CT1 44
27 Hình 3.23
Hình ảnh chồng phổ của nguyên liệu Isoniazid với phổ
chuẩn
46
28 Hình 3.24
Hình ảnh chồng phổ của nguyên liệu Ethambutol với phổ
chuẩn
46
29 Hình 3.25 Phổ Raman của một số chế phẩm khảo sát 48


của thế kỷ trước nhưng do hạn chế về khoa học kỹ thuật nên nó còn phát triển
khá chậm. Ngày nay, với sự phát triển mạnh mẽ về công nghệ laser, phổ
Raman ngày càng phát triển và có rất nhiều ưu thế, đặc biệt được ứng dụng
vào việc phát hiện nhanh thuốc giả trong ngành Dược. Với ưu điểm nổi bật là
phân tích nhanh, không làm hỏng mẫu, kỹ thuật đơn giản, dễ sử dụng, phổ
Raman đang được khai thác và đưa vào nhiều lĩnh vực nghiên cứu, một trong
số đó là công tác phân tích, kiểm tra, giám sát chất lượng thuốc với độ tin cậy,
chính xác cao.
Isoniazid và Ethambutol là các thuốc chống lao thiết yếu. Chương trình
chống lao Việt Nam luôn cung cấp đầy đủ, liên tục thuốc chống lao có chất
lượng. Tuy nhiên các thuốc này dễ bị làm giả vì tung ra thị trường dễ tiêu thụ.
2 Mặt khác số lượng các thuốc này lớn nên dễ trà trộn vào thị trường mà cơ
quan quản lý khó kiểm soát được hết. Vì vậy rất cần các biện pháp phát hiện
nhanh để kiểm soát chất lượng thuốc, góp phần nâng cao hiệu quả điều trị,
nâng cao sức khỏe cộng đồng. Nhằm nâng cao chất lượng thuốc chống lao,
nhóm nghiên cứu chúng tôi thực hiện đề tài: “Xây dựng phương pháp phân
tích phát hiện nhanh thuốc giả bằng phổ Raman” với 2 mục tiêu:
1. Xây dựng bộ dịch chuyển Raman cơ bản của 2 hoạt chất Isoniazid và
Ethambutol.
2. Xác định khoảng dao động về vị trí và cường độ của các giá trị dịch
chuyển Raman dưới ảnh hưởng của một số tá dược thường dùng trong
viên nén và viên nang để xây dựng quy trình định tính các viên nén có
hoạt chất trên.


2009 5672 518 9,13%
2010 6511 625 9,60%
2011 5801 353 6,09%
2012 6345 524 8,26%
4 2013 8040 576 7,16%
Số lượng mẫu giả được phát hiện trong năm 2013 là 8 mẫu, chiếm 0,02% mẫu
lấy kiểm tra chất lượng.
Bảng 1.3: Tỉ lệ thuốc giả qua các năm từ 2009 - 2013
Năm 2009 2010 2011 2012 2013
Tỉ lệ (%) 0,12% 0,08% 0,09% 0,10% 0,02%
Các loại thuốc giả, thuốc kém chất lượng phần nhiều là thuốc tân dược như:
thuốc điều trị sốt rét, thuốc chống lao, thuốc tránh thai hỗn hợp, thuốc chống
cúm H5N1, thuốc kháng virus viêm gan và thuốc AIDS; một số thuốc thông
thường, tiêu thụ nhiều như: hạ nhiệt giảm đau, kháng sinh …
Đặc biệt gần đây, thuốc đông y vốn là lĩnh vực được coi là an toàn cũng
đã có dấu hiệu bị làm giả. Việc trộn các thuốc tân dược vào đông dược để
tăng tác dụng tức thì của thuốc đông dược. Nếu thuốc đông dược thành phần
có trộn hoạt chất hoá dược (tân dược) nhưng không công bố trên nhãn hoặc
tân dược mà ghi nhãn là thuốc đông dược, thực chất là thuốc tân dược thì
được coi là thuốc giả. Đây không chỉ là vấn đề riêng của nước ta mà các nước
trên thế giới cũng rất quan tâm. Trong những năm gần đây, ở nước ta, cùng
với sự phối hợp của các cơ quan công an, thanh tra dược, hệ thống kiểm
nghiệm từ Trung ương đến địa phương đã phát hiện nhiều loại thuốc này.
Trong số đó, bao gồm cả thuốc có hoặc không có nguồn gốc, thuốc sản xuất
trong nước hay nhập từ nước ngoài nhưng nhiều nhất là chưa được cấp số
đăng ký.
Các thuốc này ngày càng được làm giả một cách khéo léo và tinh vi: ví

O
Khối lượng phân tử: 137,1
Tính chất: Bột kết tinh màu trắng hay tinh thể không màu, không mùi. Dễ tan
trong nước, hơi tan trong ethanol 96%, khó tan trong chloroform, rất khó tan
trong ether.
6 Ethambutol hydroclorid

Tên khoa học: (2S,2’S)-2,2’- (ethylenediimino)dibutan -1-ol dihydrochloride
Công thức: C
10
H
26
Cl
2
N
2
O
2
Khối lượng phân tử: 277,2
Tính chất: Bột kết tinh màu trắng, dễ tan trong nước, tan trong ethanol 96%.
Nhiệt độ nóng chảy khoảng 202
0
C.
1.2.2. Các phương pháp định tính Isoniazid và Ethambutol [3], [4]

sắc và kích thước.
C. Hòa tan 0,1g chế phẩm trong 10ml nước, thêm 0,2ml dung dịch đồng
(II) sulfat 12,5 % (TT). Thêm 0,5 ml dung dịch natri hydroxyd 2M
(TT), dung dịch có màu xanh da trời.
D. Chế phẩm cho phản ứng định tính (A) của ion clorid (phụ lục 8.1)
Các phương pháp định tính Isoniazid và Ethambutol hydroclorid ở trên
là các phương pháp dùng các phản ứng hóa học và phương pháp sắc ký lớp
mỏng phải sử dụng nhiều dung môi, thuốc thử vừa tốn nhiều thời gian, vừa
độc hại. Ngoài ra phương pháp thường được sử dụng rộng rãi để định tính
là phương pháp phổ hồng ngoại. Phương pháp phổ hồng ngoại rất nhạy với
các chất hút ẩm và các hợp chất nhạy trong không khí vì thế không thể đo
phổ hồng ngoại trong dung dịch nước. Mặt khác, khi đo phổ hồng ngoại
của một hoạt chất trong viên thì phải chuẩn bị mẫu rất phức tạp như hòa
tan, lọc, chiết, tách, bốc hơi đến khô, chứ không thể đo trực tiếp phổ hồng
ngoại trên nền tá dược. Phương pháp phổ Raman là một phương pháp phân
tích hiện đại và mới bắt đầu được triển khai để ứng dụng trong Dược và
phương pháp này đã khắc phục được hạn chế của các phương pháp trên và
có nhiều ưu điểm vượt trội.[5]
1.3. Tổng quan về phương pháp quang phổ Raman
1.3.1. Lịch sử phát triển. [11], [18]
Năm 1928, chỉ với các thiết bị đo đạc thô sơ, sử dụng ánh sáng mặt trời
làm nguồn kích thích, kính hiển vi làm bộ phận hội tụ ánh sáng tán xạ,
8 “detector” bằng mắt thường, Chandrasekhra Venkata Raman đã phát hiện ra
một hiệu ứng tán xạ ánh sáng yếu, hiệu ứng này sau đó được đặt theo tên ông,
hiệu ứng Raman. Với điều kiện thiếu thốn như thế, sự phát hiện ra một hiện
tượng yếu như tán xạ Raman là một thành quả rất đáng khâm phục và nó đã
giúp ông đạt được giải Nobel vật lý năm 1930. [11]

Những năm 1900, đã có một cuộc cách mạng mới trong quang phổ
Raman. Nhờ sự phát triển của một loạt các bộ phận như nguồn laser, sự tiến
bộ về công nghệ của detector, sự phát triển vượt bậc của các bộ lọc quang, sự
cải tiến đáng kể về công nghệ phần mềm và ứng dụng của nó trong các
phương pháp phân tích dữ liệu … mà quang phổ Raman được ứng dụng rộng
rãi hơn. Đặc biệt, với sự phát triển công nghệ nano, ngoài máy quang phổ
Raman để bàn với hiệu lực phân tích rất cao, máy quang phổ Raman cầm tay
đã ra đời và rất thuận tiện cho việc phân tích nhanh, đánh giá sơ bộ, khảo sát
tại thực địa các mẫu cần phân tích.[18]
1.3.2. Nguyên lý cơ bản của quang phổ Raman [11], [18]
Trong khi quang phổ hồng ngoại dựa trên sự hấp thụ, phản xạ và phát xạ
ánh sáng, quang phổ Raman dựa trên hiện tượng tán xạ. Tán xạ này xảy ra do
va chạm giữa các photon và các phân tử. Ánh sáng tới với tần số 
0
trên một
phân tử nhất định mang một lượng các photon với năng lượng E=h
0
. Ví dụ
nguồn laser có bước sóng 500nm và công suất 1W chứa khoảng 2.5x10
18
photon trong một giây. Các photon này gồm cả các photon tương tác cũng
như những photon truyền qua mà không tương tác với các phân tử.
Hầu hết các photon trong số này va chạm đàn hồi với phân tử và không
thay đổi năng lượng sau khi va chạm, các bức xạ phát ra sau đó được gọi là
tán xạ Rayleigh. Vì vậy, tán xạ Rayleigh gồm những photon có cùng tần số
với ánh sáng tới.
Một số lượng rất nhỏ của photon va chạm không đàn hồi với các phân tử
và trao đổi năng lượng sau va chạm. Nếu phân tử nhận năng lượng h từ
photon tới thì năng lượng của photon tán xạ sẽ giảm còn h(
0

sự thay đổi các mức năng lượng trong phân tử. Quá trình trao đổi năng lượng
11 có thể xảy ra giữa các mức năng lượng của điện tử, các mức năng lượng của
dao động hoặc quay, nhưng khi khảo sát quang phổ Raman chúng ta chỉ khảo
sát năng lượng dao động phân tử, cụ thể hơn đó là dao động dọc theo trục của
các liên kết.
Hình 1.2 minh họa tán xạ Stokes và đối Stokes. Tán xạ Stokes xảy ra khi
một photon tương tác với một phân tử ở trạng thái năng lượng cơ bản, còn tán
xạ đối Stokes xảy ra khi photon tương tác với một phân tử ở trạng thái năng
lượng kích thích. Ở điều kiện thường, hầu hết các phân tử đều ở trạng thái
năng lượng cơ bản, nên tán xạ Stokes dễ xảy ra hơn và chiếm đa số. Vì vậy,
trong các phép đo phổ Raman, người ta thường đo tán xạ Stokes.

Hình 1.2 .Tán xạ Raman Stokes và đối Stokes.m, n, r: các mức năng lượng
Một đại lượng quan trọng trong quang phổ Raman đặc trưng cho sự thay đổi
tần số trong hiệu ứng Raman được gọi là “Raman shift”. Đối với một chất,
cường độ của các bức xạ tương ứng trên Raman shift là khác nhau, chúng tạo
nên phổ Raman đặc trưng và duy nhất cho chất đó, đồng thời mỗi nhóm chức
thì cho đỉnh phổ ở các số sóng đặc trưng khác nhau. Vì vậy, phân tích phổ
Raman, chúng ta có thể xác định được chính xác một chất và nghiên cứu cấu
trúc của chất ấy.[18]
12 1.3.3. Nguyên tắc cấu tạo của thiết bị quang phổ Raman
1.3.3.1. Nguyên tắc hoạt động [17],[18]
Mẫu phân tích sau khi được kích thích bởi bức xạ laser sẽ phát ra ánh sáng
tán xạ. Tán xạ Raman được thu lại cùng với các bức xạ khác qua hệ kính hiển

đến mẫu đo và vì vậy mà không làm gián đoạn hoặc gây hao phí trong
quá trình sản xuất. Điều này rất thuận tiện trong việc theo dõi và kiểm
soát chất lượng sản phẩm trong các khâu của quá trình sản xuất dược
phẩm.[17]
 Phương pháp quang phổ Raman có thể phân tích được chỉ với một
lượng mẫu nhỏ. Điều này rất quan trọng trong việc đánh giá sự đồng
nhất của mẫu đo, phân tích để phát hiện các chất chỉ với một lượng mẫu
nhỏ. Ngoài ra, nó còn có ý nghĩa trong quá trình theo dõi các phản ứng
hóa học, bởi vì ở giai đoạn đầu của phản ứng thì sản phẩm tạo ra là rất
ít và khó để nhận biết được.[11]
 Phép phân tích vừa đơn giản, không phải chuẩn bị mẫu và vừa cho kết
quả nhanh. Điều này giúp tiết kiệm thời gian phân tích, do đó chúng ta
sẽ sớm có kết luận trong các phép phân tích định tính xác định mẫu đo;
14 còn trong sản xuất dược phẩm thì việc cho kết quả sớm giúp chúng có
những điều chỉnh kịp thời nhằm được những sản phẩm như ý
muốn.[18]
 Việc đo quang phổ Raman khá là dễ dàng, vì vậy mà việc đào tạo để sử
dụng được một thiết bị quang phổ Raman sẽ rất đơn giản, áp dụng được
cho nhiều loại đối tượng phổ thông khác nhau mà không nhất thiết phải
có kiến thức chuyên sâu. Việc sử dụng dễ dàng như vậy giúp cho máy
quang phổ Raman ngày càng được phổ cập hơn, phương pháp phân tích
phổ Raman được ứng dụng trong nhiều ngành nghề khác nhau hơn,
nhất là trong công tác Hải quan và Pháp y, những ngành cần phải cho
kết quả sàng lọc nhanh, độ tin cậy cao.
 Sự ra đời của thiết bị FT-Raman với độ lặp lại cao tạo điều kiện cho sự
phát triển các đầu thu có khẩu độ lớn, cho phép tia laser tập trung được
vào một lượng mẫu lớn hơn, tín hiệu Raman thu được nhiều hơn, và

phí cho các thiết bị quang phổ Raman còn rất cao, nên nó rất khó để được sử
dụng rộng rãi như một phép phân tích thông thường. Những yếu tố quan trọng
nhất ảnh hưởng đến phép đo phổ Raman đó là hiện tượng huỳnh quang, sự
nóng lên của mẫu đo, sự hấp thu tán xạ Raman bởi nền mẫu hoặc mẫu và ảnh
hưởng của độ phân cực.
Nếu nền mẫu đo cho huỳnh quang, tín hiệu của phép đo sẽ có những thành
phần huỳnh quang trong đó.
Tín hiệu huỳnh quang xuất hiện khi bước sóng laser kích thích trùng lặp
với một dải cường độ của mẫu đo. Huỳnh quang thường phủ lên tín hiệu
Raman, nó như là một nền dốc khá phẳng, có thể gây ra một đường nền ảo với
độ nhiễu thấp và làm giảm tỉ lệ S/N của các tín hiệu Raman. Dải bước sóng và