BỘ Y TÊ
TRƯỜNG ĐẠI HỌC Dược HÀ NỘI
NGUYỄN MAI LINH
NGHIÊN CỨU ÁP DỤNG PHƯƠNG PHÁP ANTHRONE ĐỂ XÁC
ĐỊNH HÀM LƯỢNG GLYCOGEN TRONG GAN CHUỘT
(KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP D ược SỸ KHÓA 2001-2006)
Người hướng dẫn: Ths.Phùng Thanh Hương
Nơi thực hiện:
Thời gian:
Bộ môn Hóa sinh
Trường Đại Học Dược Hà Nội
Tháng 05/2005 đến 05/2006
Hà Nội, tháng 05 năm 2006.
_
_
LỜI CẢM ƠN
Tôi xỉn bày tỏ lời cảm ơn chân thành tói Thạc sĩ Phùng Thanh
Hương - Giảng viên bộ môn Hóa sinh đã hướng dẫn, giúp đỡ tôi trong
suốt quá trình học tập và làm khóa luận.
Tôi xỉn gửi lời cám ơn chân thành đến các thầy cô đã cho tôi những
kiến thức quý báu trong thời gian học tâp tại trường. Tôi cũng xin cảm ơn
sự giúp đỡ nhiệt tình và tạo mọi điều kiện thuận lợi của các thầy cô và các
kỹ thuật viên Bộ môn Hóa sinh Trường Đại học Dược Hà Nội dành cho
tôi trong qúa trình học tập và thực hiện khóa luận này.
Tôi xin chân thành cảm ơn cha mẹ, anh chị, những người thân và
bạn bè đã khuyến khích, động viên, giúp đỡ và tạo điều kiện thuận lợi cho
tôỉ trong quá trình học tập và hoàn thành khóa luận tốt nghiệp.
Hà nội, tháng 5 năm 2006
Sinh viên: Nguyễn Mai Lỉnh
MỤC LỤC
ĐẶT VẤN ĐỀ

2.2.6 Xem xét mức độ tổng họp glycogen từ glucose ngoại sinh

32
2.3 BÀN LUẬN .
7.

.7.

34
PHẦN III KỂT LUẬN VÀ ĐỀ XUẤT 36
DANH SÁCH NHỮNG CHỮ VIÉT TẮT
GIP
Glucose - 1 - phosphat
G6P
Glucose - 6 - phosphat
TCA
Acid tricloacetic
TPNH
Dạng khử của triphosphopyridin nucleotid
TPN^
Dạng oxy hóa của triphosphopyridin nucleotid
UDPG
Uridine diphosphate glucose
ƯTP
Uridine triphosphate
ĐẶT VẤN ĐÈ
•

theo phương pháp Anthrone.
2. Lựa chọn được một quy trình định lượng glycogen hợp lý.
3. Ảp dụng quy trình đã lựa chọn để xác định hàm lượng glycogen ở
gan của chuột bình thường khi đỏi và sau khi uống glucose.
PHẦN I: TỔNG QUAN
1.1 GLYCOGEN.
Glycogen là một polysaccharid, dạng dự trữ cơ bản của glucose trong tế
bào động vật. Glycogen được tìm thấy dưới dạng các hạt nhỏ, phân bố khắp
nơi trong nguyên sinh chất của tế bào động vật. xế bào gan chứa hàm lượng
glycogen cao nhất ( 6-8% khối lượng tươi), ở cơ, glycogen có hàm lượng
thấp hơn ( 1% khối lượng cơ), nhưng tổng lượng glycogen trong cơ cao hơn ở
gan do khối lưọng cơ chiếm một phần đáng kể trong cơ thể. Một lượng nhỏ
glycogen được tìm thấy ở thận, và lượng nhỏ hơn nữa được tìm thấy ở tế bào
thần kinh não và bạch cầu.
Ngoài ra glycogen còn được tìm thấy trong thực vật, nấm mốc và nấm men
bia. [32,1,2]
G ỉycoge n
Hình 1: Một đoạn phân tử glycogen
1.1.1 cấu trúc
Mỗi phân tử glycogen là một polymer gồm khoảng 10000 tới 120000 gốc
a - glucose liên kết với nhau. Phân tử glycogen có nhiều mạch nhánh, mỗi
nhánh gồm khoảng 1 đến 12 đơn vị glucose liên kết với nhau bằng liên kết a
(1-^4) glycosid trong mạch và các liên kết a (1—>6) glycosid ở điểm nhánh.
Trọng lượng phân tử từ 2,7.10^ - 3,5.10^ dalton. [32,1]
c HsO« CHjOM
H J
-
0. H H ,.ị

0, H

phẩm có mầu từ nâu đến tím. [32]
1.1.4 Chuyển hóa glycogen trong cơ thể động vật.
1.1.4.1 Thoái hóa glycogen [2,5,23].
Quá trình thoái hóa glycogen bao gồm những giai đoạn như sau :
*Giai đoan cắt mach thẳng:
Glycogen phosphorylase xúc tác phản ứng cắt gốc glucose tận cùng ở đầu
không khử của mạch thẳng glycogen:
Glycogen (n mắt xích) + Pi ^ Glycogen ( n . 1 m ắ t x í c h ) + GIP
Phản ứng xảy ra tương tự như phản ứng thủy phân cắt liên kết a (1-^4)
glycosid với sự tham gia của phosphat vô cơ (Pi) tạo thành a-D-glucose-1-
phosphat và phân tử glycogen mất một gốc glucose. Quá trình này được lặp
lại nhiều lần, tách dần từng gốc glucose dưới dạng a-D-glucose-l-phosphat
cho tới khi mạch đang thoái hoá còn 4 đơn vị glucose tại điểm nhánh a (1-^6)
thì dừng lại.
*Giai đoan cắt mach nhánh : Giai đoạn này có sự tham gia của enzym
cắt nhánh (debranching enzyme) với 2 hoạt tính:
• Oligo a (1—>6) -a (1—>4) glucan transferase: chức năng vận chuyển
một chuỗi 3 gốc glucose từ nhánh tới một đầu không khử của một
nhánh khác cạnh nó và gắn lại bằng liên kết a (1—>4) glycosid.
• a (1—>6) glucosidase: (chức năng cắt nhánh) cắt gốc glucose còn lại tại
điểm nhánh a (1-^6), giải phóng glucose dưới dạng tự do.
Phản ứng cắt nhánh cho phép enzym glycogen phosphorylase tiếp tục hoạt
động để đi đến thoái hóa hoàn toàn phân tử glycogen .
1
Ufen k é t ÍX> ịiA i
a ««s * ĩ -OÍ'i<^ii iit^»i:.t:
■■ o <
Oeí %ợo /n > S
* •
m

gan. G6P được đồng phân hóa thuận nghịch thành GIP nhờ
phosphoglucomutase:
Glucose - 6 - phosphat Glucose - 1 - phosphat
Tiếp theo là phản ứng then chốt nhất trong quá trình tổng họp glycogen:
phản ứng tạo UDP- glucose (UDPG) xúc tác bởi UDPG pyrophosphorylase:
UTP + Glucose - 1 - phosphat ^ UDP- glucose + PPi
Phản ứng này xảy ra theo chiều tạo UDPG vì pyrophosphat bị thủy phân
rất nhanh thành orto phosphat nhờ pyrophosphatase.
Ư D P -G lucose Pỵrophosp ho rỹlase
Hình 5: Phản ứng tạo UDPG
UDPG là “chất cho” gốc glucose trong quá trình tổng họp glycogen dưới
tác dụng của glycogen synthase. Đến đây có thể xảy ra hai trường hợp:
•Trường hợp có sẵn chuỗi glucan
Enzym glycogen synthase: xúc tác việc chuyển gốc glycosyl từ UDPG tới
gắn vào đầu không khử (C4) của một phân tử glycogen gồm n gốc glucose có
sẵn để tạo thêm một liên kết mới a (1-^4) glycosid, nghĩa là tạo thành
glycogen có n +1 gốc glucose.
glycogen („ gốc) + UDP-glucose -> glycogen („+1 góc) + UDP
Khi tạo được thêm ít nhất 6 gốc glucose, enzym gắn nhánh : amylo(1^4 -
1—>6) - transglycosylase hay glycosyl (4 ^ 6 ) - transferase có tác dụng vừa
cắt đứt liên kết a (1^4) glycosid của đoạn glycogen vừa mới tạo ra, vừa
chuyển đến gắn vào OH ở C6 của gốc glucose trên cùng một chuỗi hay một
chuỗi khác tạo ra một điểm nhánh mới a (1^6) glycosid trong quá trình tổng
họp glycogen .(Hình 6)
Sau đó mạch nhánh mới tạo thành lại được kéo dài ra nhờ tác dụng của
glycogen synthase dẫn đến tạo các liên kết mới a (1^4) glycosid. Quá trình
trên được lặp lại nhiều lần làm cho số lượng mạch nhánh tăng lên dần cho đến
khi đạt được một phân tử glycogen có cấu trúc phù hợp với nhu cầu.
Tác dụng sinh học của sự gắn nhánh là làm cho phân tử glycogen dễ tan
hơn và số đầu không khử tăng lên, do đó phản ứng được nhiều hon với

glycogen synthase và enzym gắn nhánh (glycogen branching enzyme). Cuối
cùng, glycogenin vẫn gắn vào một đầu của phân tử glycogen đã được tạo
thành.
1.2 NHỮNG BẤT THƯỜNG TRONG CHUYỂN HÓA GLYCOGEN
Những bất thường trong chuyển hóa glycogen được coi là bệnh về dự trữ
glycogen, do di truyền khuyết thiếu hoặc sai lệch cấu trúc enzym tham gia
chuyển hóa glycogen. Sự thiếu hụt enzym dẫn đến những bất thường về cấu
trúc hoặc hàm lượng glycogen trong các tổ chức.
Gl^pgl
Lysosom e
V -
Kìnast
Glycogen and IX.
Branching P h o s p h o is e (GSD Vỉ: «a n
Phosphorylase ịO SŨ V) cơ
'Bểbmnéĩi n
trong gan
Glticose^B-Phosphata $e
(GSD I)
Gkicose-6-Phosphâte
ĩrânsporler CGSD ỈB|
Glucose
I
Pho s phogìy comulase
> f
• Gìmm^S*P
- 1 - ^
Fnictose-4#
A
máu

máu. Chất béo cũng được dự trữ trong gan cùng với glycogen làm cho gan to
lên [11,14].
11
Typ II: Bệnh Pompe do thiếu hụt acid Maltase (enzym acid alpha-1,4-
glucosidase): Pompe là người đầu tiên mô tả bệnh này khi ông pháp hiện ra
một bé gái 7 tháng tuổi bị chết sau cơn cơ tim to tự phát.
Acid alpha-glucosidase là một enzym thủy phân của lysosom, cần thiết để
thoái hóa một phần nhỏ (1-3%) glycogen trong tế bào . Vì thế con đường
thoái hóa chính của glycogen ít bị ảnh hưởng ở typ II, cấu trúc glycogen
không bị bất thường và tình trạng hạ đường huyết không xảy ra. Tuy nhiên,
thiếu hoạt động của enzym này sẽ gây ra sự tích tụ glycogen trong lysosom và
tế bào chất. Sự tích tụ này có thể làm ảnh hưởng đến những chức năng thông
thường khác của tế bào dẫn tới tổn thương tế bào, và gây ra rối loạn toàn bộ tổ
chức, làm cho các cơ quan này to hơn bình thường . Những cơ quan hay bị
tổn thương nhất trong typ bệnh này là tim, xương và cơ hô hấp [12,30],
Typ III: Bệnh Cori do thiếu hụt enzym cắt nhánh :
Năm 1928, Snappes và van Creveld đã mô tả 2 bệnh nhân mắc bệnh này .
Cả 2 bệnh nhân đều có triệu chứng gan to và giảm khả năng huy động
glycogen dự trữ trong gan. Năm 1953, Forbes mô tả trường họp thứ ba mắc
bệnh và thấy rằng glycogen trong cả gan và cơ đều có cấu trúc không bình
thưÒTig. Illingworth và Cori tách glycogen từ mô ra và phát hiện thấy phân tử
glycogen này có mạch nhánh phía ngoài cực ngắn. Cori đặt tên cấu trúc này
là 1 dextrin giới hạn, và ông đã dự đoán nguyên nhân là do thiếu enzym cắt
nhánh. Năm 1964 van Creveld với sự giúp đỡ của Huijing đã chứng minh
được sự thiếu hoạt động của enzym cắt nhánh glycogen ở những bệnh nhân
này[8].
Hạ đường huyết là triệu chứng lâm sàng cơ bản của typ III. Đó là kết quả
của sự thiếu phân hủy glycogen do thiếu enzym cắt nhánh. Vì vậy chỉ có một
phần nhỏ glucose được tách ra, bệnh nhân gặp phải các cơn hạ đường huyết
ngay cả sau bữa ăn nhẹ. Các chỉ số hóa sinh trong máu thay đổi như: đường

13
phosphorylase cơ ở một bệnh nhân nữ 52 tuổi. Những đặc trưng của typ bệnh
này được McArdle mô tả bao gồm: không chịu được tập luyện vì chứng đau
cơ, mau mệt mỏi, co cứng cơ khi tập luyện, và tình trạng đau sẽ giảm khi
nghỉ ngơi. Cơ vận động là nhờ vào glucose lấy từ sự phân hủy glycogen do
phosphorylase. Glucose chuyển thành ATP nhờ con đường đường phân. Các
triệu chứng xuất hiện ở typ bệnh này là do không sử dụng được nguồn năng
lượng từ glycogen của cơ. Khoảng một nửa số bệnh nhân phải chịu cơn hoại
tử cơ cấp sau khi tập luyện mạnh. [7,8,14]
Typ VI :Bệnh Hers do thiếu enzym phosphoĩylase gan:
Enzym phosphorylase giữ vai trò quan trọng giúp thoái hóa glycogen
thành glucose. Nếu thiếu enzym này ở gan, glycogen không thể thoái hóa
được thành glucose, và lắng đọng glycogen ở gan làm gan to. ở hầu hết
những bệnh nhân mắc typ bệnh này, enzym khuyết thiếu không hoàn toàn và
sự hình thành glucose vẫn diễn ra. Các triệu chứng lâm sàng của typ bệnh này
tương tự với typ I nhưng nhẹ hơn. Gan có kích thước rất lớn , và hạ đường
huyết nhẹ là những biểu hiện chính [12].
Typ VII: Bệnh Tarui do thiếu enzym phosphofructokinase cơ :
Enzym phosphofructokinase cần thiết để thoái hóa glycogen tạo năng
lượng cho hoạt động của cơ. Bệnh nhân mắc typ bệnh này là do thiếu một
lượng phosphofructokinase ở mô cơ. Thiếu enzym này ảnh hưởng đến quá
trình thoái hóa của glycogen, dẫn đến không cung cấp đủ năng lượng cho cơ
hoạt động bằng con đường thoái hóa glycogen. Bệnh nhân phải chịu những
cơn đau cơ và mệt mỏi khi tập luyện vì suy nhược cơ khi nỗ lực thu năng
lượng. Vì vậy gây ra chứng đau cơ, mỏi cơ, và co cứng cơ[35].
Typ IX: Thiếu hụt enzym phosphorylase kinase:
Bệnh nhân mắc typ bệnh này là do thiếu enzym phosphorylase kinase.
Enzym này điều khiển quá trình thoái hóa glycogen, vì vậy thiếu enzym này
gây lắng đọng glycogen. Những triệu chứng lâm sàng của typ này tương tự
14

lên màu sau đó. Nhưng phương pháp này có nhược điểm là tổ chức mô khó
được phá vỡ hoàn toàn vì vậy khó lấy được toàn bộ glycogen ra. Quá trình
nghiền phải được thực hiện nhiều lần.[6].Có thể dùng nhiều hóa chất khác để
loại tạp protein thay cho acid tricloacetic như acid perchloric[25], thủy ngân
nitrat[10]
(2).Tách và tinh chế glycogen từ dich chiết mô:
- Ethanol là dung môi làm kết tủa glycogen vì vậy được lựa chọn để tách
glycogen ra khỏi dịch chiết mô. Ngoài ethanol ra có thể lựa chọn dung môi
khác như methanol. Để kết tủa được triệt để và nhanh hơn nhiều tác giả đề
xuất sử dụng thêm NaCl hoặc LiCl [25],
- Để tinh chế glycogen thu được, có thể dùng nước cất hoà tan glycogen và
cho kết tủa lại bằng ethanol, lặp lại nhiều lần. Good và cộng sự trong nghiên
cứu năm 1932 đã sử dụng than hoạt để tinh chế glycogen[10].
(3). Định lương glycogen sau khi đươc tách ra: Glycogen thu được có
thể được định lượng bằng nhiều phương pháp khác nhau.
a. Glycogen được thuỷ phân thành glucose rồi định lượng glucose bằng
các thuốc thử khác nhau:
- Dùng thuốc thử Anthrone [25, 6]: Nguyên tắc của phương pháp là
glycogen được thuỷ phân thành glucose trong acid sulíìiric đặc ở nhiệt độ cao,
và phản ứng lên màu với thuốc thử anthrone. Đo quang ở bước sóng 620nm.
- Dùng thuốc thử : glycogen cũng được thủy phân thành glucose và sau
đó glucose sẽ phản ứng với tạo màu.
- Dùng các thuốc thử khác như diphenylamin, phenol,
b. Định lượng trực tiếp glycogen bằng thuốc thửlod:
Dựa vào tính chất của glycogen cho sản phẩm mầu nâu đỏ khi phản ứng với
lod. Dùng phép so màu để định lượng glycogen. Nhưng theo Daniel Luzon
Moris, phương pháp này khó ổn định vì màu của phản ứng thu được phụ
16
thuộc không chỉ vào hàm lượng glycogen mà còn phụ thuộc vào nhiệt độ tiến
hành phản ứng, hàm lượng lod và thậm chí phụ thuộc cả vào nguồn gốc của

ứng (3).
17 'v /
Định lượng TPNH bằng phương pháp đo huỳnh quang. Hàm lượng glycogen
được so với chất chuẩn.
Phương pháp này có độ nhạy cao cho phép định lượng trực tiếp được
glycogen có mặt trong mô não với hàm lượng SOịLig, trong gan với hàm lượng
0,3 ụg. [24].
Các phươns pháp khác: Glycogen trong mô có thể được định lượng bằng
phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC) [13] hoặc bằng phương pháp
đo phổ cộng hưởng từ hạt nhân (*^C-MRS)[22].
18
Bảngl; Các phương pháp định lượng glycogen
Pflüger
(1905) [34]
Good và cộng sự
(1933) [ÌO]
Moưis
(1948) [34]
Boettiger
(1946) [34]
Seifter và
cộng sự
(1950) [28]
Van Wagtendonk
và cộng sự
(1946) [36]
Van der
Kleij
(1951) [34]
Phương pháp

glycogen
Rửa bằng
ethanol 66,
85 và 96%
và ether
Không làm
Không làm
Rửa bằng ethanol
66; 85 và 96%
và ether
Không làm Không làm Không làm
Trạng thái lúc
định lượng
Glucose
Glucose
Glucose
Glucose
Glucose Glycogen Glucose
Chuyển thành
glucose
Thủy phân
bằng HCl
(3h)
Thủy phân băng
HCl
(2h)
Trong quá
trình lên màu.
Trong quá trình lên
màu

Viện Vệ sinh dịch tễ cung cấp, được nuôi bằng thức ăn tổng hợp .
• Chuột cống trắng khỏe mạnh, thuần chủng, trọng lượng 100 - 125g do
Học viện Quân Y cung cấp, được nuôi bằng thức ăn tổng họp.
2.1.2 Hóa chất
• Ethanol
• Thioure
• Anthrone
• Acid tricloacetic
• Acid sulfuric
• Glucose tinh khiết
• Kali hydroxyd
• Thuốc thử Anthrone:
Thêm cẩn thận 180 ml acid sulfuric vào 70 ml nước cất. Đến nhiệt độ
khoảng 80°c thêm vào 2,5g thioure, hòa tan và thêm tiếp 125mg thuốc thử
Anthrone, khuấy cho tan hoàn toàn, để mát. Bảo quản trong tủ lạnh. Không để
lâu quá hai tuần[6].
• Các hóa chất tinh khiết khác.
<♦ Hóa chất do bộ môn hóa sinh cung cấp đạt tiêu chuẩn tinh khiết
hóa học.
20
2.1.3 Máy móc thí nghiệm
• Máy li tâm thường (3000 vòng / phút) (Clay Adams - Anh)
• Máy li tâm lạnh Heraeus sepatech
• Máy đo quang Spectro ƯV-VIS Auto - LaboMed, Inc.
• Máy đo đường huyết One touch Basic (Jonhson & Tonhson).
• Kít đo đường huyết One touch Basic Ợonhson & Jonhson).
• Tủ điều nhiệt.
2.1.4 Phương pháp nghiên cứu
2.1.4.1 Cơ sở thực nghiệm:
Hiện nay bệnh liên quan đến rối loạn chuyển hóa glucid ngày càng phát