BỘ Y TẾ
TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI
LÊ NGUYỄN THANH NHÀN
NGHIÊN CỨU PHÂN LẬP VÀ
THỬ HOẠT TÍNH CHỐNG OXY HÓA
CỦA MỘT SỐ FLAVONOID
TỪ CỦ GẤU BIỂN
(Cyperus stoloniferus Retz.)

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP DƯỢC SĨ Hà Nội-2013
BỘ Y TẾ
TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI LÊ NGUYỄN THANH NHÀN

NGHIÊN CỨU PHÂN LẬP VÀ
THỬ HOẠT TÍNH CHỐNG OXY HÓA
CỦA MỘT SỐ FLAVONOID
TỪ CỦ GẤU BIỂN
(Cyperus stoloniferus Retz.)
KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP DƯỢC SĨ

Do thời gian có hạn nên khóa luận còn nhiều hạn chế, vì vậy tôi rất mong
nhận được sự góp ý quý báu của các thầy cô và các bạn.

Hà Nội, ngày tháng năm 2013
Sinh viên Lê Nguyễn Thanh Nhàn
MỤC LỤC
Trang
ĐẶT VẤN ĐỀ………………………………………… 1
Chương 1. TỔNG QUAN
1.1. Tổng quan về chi Cyperus
1.1.1. Đặc điểm thực vật chung của chi Cyperus…………………………….3
1.1.2. Thành phần hóa học của chi Cyperus………………………………….3
1.1.3. Tác dụng sinh học của chi Cyperus……………………………………5
1.2. Tổng quan về loài Cyperus stoloniferus Retz.
1.2.1. Vị trí phân loại của loài Cyperus stoloniferus Retz……………………8
1.2.2. Đặc điểm thực vật của loài Cyperus stoloniferus Retz……………… 9
1.2.3. Phân bố và sinh thái………………………………………………… 10
1.2.4. Bộ phận dùng, thu hái và chế biến……………………………………11
1.2.5. Tính vị, công năng và công dụng…………………………………… 12
1.2.6. Một số bài thuốc chứa củ gấu……………………………………… 12
1.2.7. Thành phần hóa học của loài Cyperus stoloniferus Retz…………… 14
1.2.8. Tác dụng sinh học của loài Cyperus stoloniferus Retz……………….15
Chương 2. NGUYÊN VẬT LIỆU, THIẾT BỊ, NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG
PHÁP NGHIÊN CỨU
2.1. Nguyên vật liệu, hóa chất và thiết bị……………………………… 18
2.2. Nội dung nghiên cứu…………………………………………………….19
2.3. Phương pháp thực nghiệm DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CÁC CHỮ VIẾT TẮT
br s Broad singlet
13
C NMR Phổ cộng hưởng từ hạt nhân cacbon-13 (Carbon-13 Nuclear
Magnetic Resonance Spectroscopy)
CC Sắc ký cột (Column Chromatography)
D Doublet
Dd doublet of doublet
DĐVN Dược điển Việt Nam
DEPT Distortionless Enhancemnt by Polarisation Transfer
DMSO Dimethyl sulfoxid
DPPH 2,2-Diphenyl-1-picrylhydrazyl
GS. Giáo sư
1
H NMR Phổ cộng hưởng từ hạt nhân proton ( Proton Magnetic
Resonance Spectroscopy)
HR-ESI-
MS
Phổ khối lượng phân giải cao ( High Resolution
Electron Spay
Ionization Mass Spectroscopy)
J (Hz) Hằng số tương tác tính bằng Hz
MS Phổ khối (Mass Spectroscopy)
PGS.TS Phó giáo sư tiến sĩ
P/ư Phản ứng
S Singlet

DANH MỤC CÁC HÌNH ẢNH, ĐỒ THỊ

Hình 1.1 Cây cỏ gấu biển
Hình 1.2 Củ gấu biển
Hình 1.3 Hoa cỏ gấu biển
Hình 2.1 Cột sắc kí
Hình 2.2 Cơ chế quét gốc tự do DPPH
Hình 3.1 Một số đặc điểm của bột hương phụ biển (Cyperus
stoloniferus Retz.)
Hình 3.2 Sơ đồ phân lập và chiết xuất
Hình 3.3 TLC của chất CSE1
Hình 3.4 TLC của chất CR2
Hình 3.5 Phổ
1
H-NMR của hợp chất CSE1
Hình 3.6 Phổ
13
C-NMR của hợp chất CSE1
Hình 3.7 Cấu trúc hóa học và một số tương tác HMBC chính của hợp
chất CSE1
Hình 3.8 Phổ
1
H-NMR của hợp chất CR2
Hình 3.9 Phổ
13
C-NMR của hợp chất CR2
Hình 3.10 Cấu trúc hóa học của hợp chât CR2

mẫu, Hoàn điều kinh, Cao ích mẫu. Đây là một trong những bài thuốc thiết
yếu để điều trị các chứng bệnh của phụ nữ [5, 22]. Những bài thuốc có thành
phần “hương phụ” ở Việt Nam, chủ yếu được khai thác từ loài củ gấu biển; do
hương phụ biển có nhiều hơn, củ to hơn, thu hái dễ dàng hơn so với hương
phụ vườn [4, 23]. Theo một số tài liệu nghiên cứu về hai vị thuốc này cho
thấy hương phụ biển được dùng làm thuốc với cùng công dụng như hương
phụ vườn [15, 26].
Về thành phần hóa học, theo một số nghiên cứu [19, 20, 26] đã xác định
được trong củ gấu biển có chứa : tinh dầu, alkaloid, flavonoid, glycosid tim,
tanin, saponin, acid hữu cơ, tinh bột….Tuy nhiên, đa phần chỉ nghiên cứu sâu
về thành phần và tác dụng của tinh dầu, còn các thành phần khác chỉ mới
nghiên cứu sơ bộ. Các nghiên cứu từ trước đến nay về flavonoid cho thấy
rằng flavonoid là một nhóm các chất chống oxy hóa rất mạnh, góp phần quan
trọng trong bảo vệ sức khỏe con người. Ví dụ, catechin là một flavonoid có
nhiều trong trà xanh và có hoạt tính chống oxy hóa mạnh. Theo F. Nanjo đã
chứng minh được catechin trong trà xanh có khả năng thu dọn gốc tự do đến
50% trong khoảng nồng độ từ 1 - 3 µM

[53, 63]. Vậy thành phần flavonoid
trong củ gấu biển có hoạt tính chống oxy hóa không ? và khả năng chống oxy
hóa như thế nào ? Xuất phát từ vấn đề trên, chúng tôi xin tiến hành đề tài
“

Nghiên cứu phân lập và thử hoạt tính chống oxy hóa của một số
flavonoid từ củ gấu biển (Cyperus stoloniferus Retz.) ” với các mục tiêu
như sau:
1. Phân lập và xác định cấu trúc hóa học của một số hợp chất flavonoid từ
củ gấu biển.
2. Thử hoạt tính chống oxy hóa của một số hợp chất flavonoid phân lập
được từ củ gấu biển.

có:
- Aurone đã được tìm thấy trong lá của 25% mẫu và trong các chùm hoa
là 40%.
- Sulphuretin đã được tìm thấy lần đầu tiên trong Carex appressa.
- Flavon như tricin, luteolin và các methyl este (luteolin-5-methylete,
luteolin-7-methyl ete, diosmetin, acacetin).
- Flavonol như myricetin ; flavone-C-glycosid.
- Các carexidin-3-desoxyanthocyanidin đã được tìm thấy trong các cụm
hoa của 8 loài.
J. B. Harborne đã khảo sát lá của 62 loài thuộc 11 chi của họ
Cyperaceae [48] thấy chứa tricin, luteolin, quercetin, kaempferol và các
glycoflavones như tricin - 5 - glucoside, luteolin - 7 - arabinosylglucoside,
quercetin - 3 - rutinoside.
J. B. Harborne và cộng sự đã nghiên cứu 92 loài thuộc chi Cyperus ở
Úc [58] và xác định được:
- Trong lá chứa luteolin - 5 - methylete, quercetin - 3 - monomethylete,
ete 7 - dimethyl của kaempferol và quercetin; 3, 7, ether - trimethyl của
quercetin; tricin, luteolin và quercetin ở dạng glycoside.
- Trong chùm hoa luteolin - 5 - methylete dường như được thay thế bằng
7, 3’, 4’ - trihydroxyflavone.
Theo một số tác giả ở Ai Cập [29], ngoài luteolin và 7 - methyl ete của
nó, ở loài Cyperus conglomerates còn xuất hiện hai prenylflavan mới là 7, 3’ -
dihydroxy - 5, 5’- dimetoxy - 8 - prenylflavan và 5, 7, 3’ - trihydroxy - 5’ –
methoxy - 8 - prenylflavan. Các cấu trúc được xác định dựa trên phân tích phổ
CIMS,
1
H-NMR,
13
C-NMR, H-H COSY, HMBC và DEPT.
Z. Zhou và W. Yin [67] đã xác định được hai hợp chất mới, 1α -

loài Cyperus có chứa flavonoid, đã xác định được glycosid apigenin, lutiolin,
tricin và quercetin.
1.1.3. Tác dụng sinh học của chi Cyperus
Theo Trương Phát Sơ, Trương Diệu Đức và Lưu Thiệu Quang (1935),
cao lỏng hương phụ 5% có khả năng ức chế sự co bóp của tử cung, làm dịu sự
căng thẳng của tử cung động vật. Năm 1959, một số tác giả ở Quý Dương y
học viện (Trung Quốc) đã chứng minh tác dụng giảm đau trên chuột nhắt
trắng [4].
Theo N. Prakas và B. Ragavan [54], các dịch chiết khác nhau của
Cyperus esculentus L. như acetone, ethanol 50%, chloroform, ether dầu hỏa
có hoạt tính kháng khuẩn với một số chủng vi khuẩn như Escherichia coli,
Staphylococcus aureus, Salmonella sp, Klebsiella pneumonia, Proteus
vulgaris, Pseudomonas aeruginosa và Citrobabacter freundii, bằng cách sử
dụng phương pháp khuếch tán đĩa. Dịch chiết aceton cho thấy hoạt động ức
chế mạnh nhất với S. aureus, K. pneumoniae và P. vulgaris. Dịch chiết
ethanol 50% ức chế mạnh nhất với E. coli, S. aureus và Salmonella sp. Dịch
chiết chloroform ức chế mạnh nhất sự tăng trưởng của S. aureus, trong khi đó
dịch ether dầu hỏa cho kết quả tích cực đối với Salmonella sp. Tất cả các dịch
chiết rất nhạy cảm với C. freundii.
Theo V. S. Rakotonirina và cộng sự [64] dịch chiết tổng từ thân rễ của
C. articulatus dường như không có tác dụng gây mê hoặc gây tê. Tuy nhiên,
khi so sánh với diazepam, C. articulatus dường như không có tác dụng giãn
cơ. Khi kết hợp với natri thiopental hoặc diazepam, dịch chiết tổng gây cảm
giác ngủ và tăng thời gian ngủ mà không có tác dụng giảm đau đồng thời. Các
nghiên cứu cho thấy thân rễ của C. articulatus có tính chất dược lí tương tự
như các thuốc an thần.
Theo H. G. Anwar và H. J. Khalid [44] dịch chiết nước - methanol của
C. scariosus có tác dụng bảo vệ gan với liều 500mg/kg. Thí nghiệm được tiến
hành trên chuột, gây tổn thương gan bằng acetaminophen và CCl
4

Theo C. Thebtaranonth và cộng sự [37] các chất được phân lập từ thân
rễ Cyperus rotundus là patchoulenone, caryophyllene α - oxit, 10, 12 -
peroxycalamenene và 4, 7 - dimethyl - 1- tetralone có hoạt tính chống sốt rét
với EC
50
= 10
-4
- 10
-6
M. Endoperoxide và 10, 12 - peroxycalamene có tác
dụng mạnh nhất tại EC
50
= 2.33 x 10
-6
M.
Theo J. S. Eun và cộng sự

[49] dịch chiết ethanol của C. rotundus có
tác dụng chống kết tập tiểu cầu và phụ thuộc vào nồng độ collagen, thrombin
và acid arachidonic. Trong tám hợp chất của C. rotundus, (+)-nootkatone có
tác dụng ức chế mạnh nhất trên collagen, thrombin và acid arachidonic.
A. R Nishikant và cộng sự [30] đã tiến hành đánh giá ảnh hưởng của
C. rotundus trên alloxan gây tăng đường huyết ở chuột. Kết quả cho chuột
uống 500mg/kg dịch chiết (một lần một ngày, trong 7 ngày liên tiếp) làm
giảm đáng kể lượng đường trong máu.
Theo S. J. Uddin

và cộng sự [60] dịch chiết methanol và ether dầu hỏa
của thân rễ C. rotundus, dùng đường uống với liều 250 và 500 mg/kg thể
trọng, cho thấy có tác dụng chống tiêu chảy rõ rệt trên mô hình chuột gây tiêu

Cyperus arenarius Hance ex C.B.Clarke, nom. Illeg
Cyperus bulbosostoloniferus Steud.
Cyperus conjunctus Steud.
Cyperus littoralis R.Br.
Cyperus mayeri Kük.
Cyperus spadiceus Lam.
Họ Cói: Cyperaceae
1.2.2. Đặc điểm thực vật của loài Cyperus stoloniferus Retz. Cây cỏ sống dai, cao 15-30cm. Thân rễ nằm bò dưới mặt đất, từng đoạn
phình thành củ hình trứng, từ củ mọc lên thân khí sinh.Thân nhẵn, hình 3
cạnh. Lá rộng 2-3mm, gốc có bẹ ôm thân, đầu lá thuôn nhọn, gân chính rõ,
cứng và bóng.
Cụm hoa ở đỉnh, phân nhánh nhiều thành những bông xếp dạng ngù,
bông kép hay cờ không đều, mỗi bông có trục nhẵn mang 3-20 bông nhỏ, các
bông nhỏ gồm nhiều hoa, trục bông nhỏ có cánh, mỗi hoa mọc ở kẽ một lá
Hình 1.2. Củ gấu biển Hình 1.1. Cây cỏ gấu biển
Hình 1.3. Hoa của cỏ gấu biển

bắc còn gọi là vảy, các vảy có màu nâu đỏ xếp thành dãy ở trên trục, hình trái
xoan tù, hoa không có đài và tràng, nhị 3, bao phấn hình dải thuôn; bầu
thượng, có một ô, một noãn, vòi nhụy hình chỉ, đầu nhụy dài và chẻ 3.
Quả bế có 3 cạnh, màu đen nhạt chứa 1 hạt.

Theo y học cổ truyền, trước khi sử dụng, củ gấu cần được chế biến. Có
thể chế biến theo lối tứ chế (tẩm sao lần lượt bằng 4 phụ liệu khác nhau) hoặc
thất chế (tẩm sao bằng 7 phụ liệu khác nhau). Tuy nhiên, phương pháp tứ chế
được dùng phổ biến hơn. Phương pháp thất chế tốt hơn nhưng do chế biến
phức tạp, nên ít được dùng.
Cách làm hương phụ tứ chế: Loại bỏ hết rễ con và tạp chất, rửa sạch,
phơi ráo nước, rồi chia đều làm 4 phần. Tẩm 1 phần bằng nước muối 5%, một
phần bằng nước gừng 5%, một phần bằng giấm và một phần bằng rượu 35-
40
0
. Tẩm vừa đủ ướt, ủ riêng mỗi phần trong 12 giờ, rồi sao vàng. Khi dùng,
để riêng từng phần hoặc trộn lẫn 4 phần với nhau tùy theo cách chữa bệnh (củ
gấu đã chế biến mang tên hương phụ) [4].
Tuy nhiên, theo GS.TS. Đỗ Tất Lợi, củ gấu không chế biến gì cả tác
dụng vẫn rất tốt.
1.2.5. Tính vị, công năng và công dụng
Củ gấu là một vị thuốc được dùng khá phổ biến trong y học cổ truyền,
trong dân gian có câu: “nam bất thiểu trần bì, nữ bất ly hương phụ” có nghĩa
là chữa bệnh cho nam giới không thể thiếu trần bì và chữa bệnh cho nữ giới
không thể thiếu hương phụ.
Theo đông y, củ gấu có vị cay, hơi đắng, tính bình, quy vào các kinh
can, tam tiêu. Có tác dụng lý khí, giải uất, kiện vị tiêu thực, thư can, điều
kinh, chỉ thống chữa kinh nguyệt không đều, đau bụng kinh, viêm tử cung
mạn tính, băng lậu đới hạ, chữa can vị bất hòa, đau dạ dày, ăn không ngon,
tiêu hóa kém, nôn mửa.
Vị củ gấu qua các phương pháp sao tẩm khác nhau, có tính năng công
dụng không giống nhau. Củ gấu sống (chưa qua chế biến) có tác dụng giải
cảm, thông khí trừ đờm. Củ gấu sao đen có tác dụng cầm máu dùng trong
trường hợp rong kinh. Củ gấu tẩm nước muối sao chữa bệnh về huyết; tẩm
đồng tiện (nước tiểu trẻ em) sao, có tác dụng giáng hỏa trong chứng bốc nóng;

chữa lý khí, thư can).
- Củ gấu 12g, thanh bì 12g, bồ công anh 12g, rau má 16g, lá khôi 16g,
chỉ xác 12g, khổ sâm 12g, ngải cứu 8g. Sắc nước uống, chia làm 3 lần trong
ngày (theo phép chữa thanh can, giáng hỏa).
- Củ gấu 12g, ngải cứu 12g, ô dược 12g, tô mộc 12g, uất kim 6g, hồng
hoa 6g, bồ công anh 12g. Sắc nước uống (theo phép chữa hành khí hoạt
huyết).
Chữa tùy vị hư nhược, tiêu hóa kém, bụng trướng đau, buồn nôn, tiêu
chảy:
- Củ gấu (sao) 12g, vỏ quýt (sao) 12g, vỏ vối (sao) 12g, mộc hương (sao)
16g, chỉ xác 12g. Sắc nước uống, nếu có kèm tiêu chảy, thêm củ riềng 8g, búp
ổi 12g.
- Hương phụ 8g, sa nhân 4g, mộc hương 6g, chỉ thực 8g, đậu khấu 6g,
hậu phác 12g, hoắc hương 8g, bạch truật 12g, trần bì 12g, phục linh 12g, bán
hạ 12g, cam thảo 4g, gừng tươi 12g, táo tàu 5 quả. Sắc với nước uống. (Bài
Hương sa dưỡng vị thang).
Chữa đau bụng, nôn mửa: Củ gấu, riềng, gừng khô, mỗi vị lượng bằng
nhau, tán bột, mỗi lần uống 6g. Ngày 3 lần. (Bài lương phụ hoàn).
Chữa đau nửa đầu: Rau má 12g, hương phụ 8g (sao, tẩm nước tiểu trẻ
em), thảo quyết minh 12g (sao thơm), vỏ bưởi 8g (phơi khô, sao), rễ nhào
12g. Cho 3 bát nước sắc lấy 1 bát, chia 2 lần uống trong ngày, dùng lúc nóng.
Chữa cảm cúm, gai rét, nhức đầu, đau nhức mình: Hương phụ 12g, tía
tô 10g, vỏ quýt 10g, cam thảo 4g, hành 3 cây, gừng tươi 3 lát. Sắc với nước
uống.
Chữa trẻ em gầy yếu: Hương phụ (sao vàng) 40g, vỏ chuối tiêu chín
còn tươi 240g, bột thịt cóc 40g. Sấy khô và tán nhỏ củ cói và vỏ chuối thành
bột; trộn đều với bột thịt cóc, thêm kẹo mạch nha vào làm thành viên. Mỗi
viên 4 g, ngày cho ăn 2-4 viên, chia làm 2 lần.
Kiêng kị: những người âm hư, huyết nhiệt không nên dùng.
1.2.7. Thành phần hóa học của loài Cyperus stoloniferus Retz.

của tinh dầu củ gấu biển là
12,1ml/kg.
- Tác dụng ức chế thần kinh trung ương:
Tinh dầu củ gấu, thí nghiệm trên chuột nhắt trắng bằng đường tiêm
phúc mạc với liều 0,03 ml/chuột, có tác dụng kéo dài thời gian gây ngủ của
pentobarbital. Trên thỏ thí nghiệm, tinh dầu củ gấu tăng cường tác dụng gây
mê của scopolamin. Về cơ chế tác dụng, qua thí nghiệm chứng tỏ tinh dầu củ
gấu ức chế chủ yếu quá trình dẫn truyền các xung thần kinh qua synap của tế
bào vùng hải mã và bó tháp, còn đối với dẫn truyền qua sợi trục thần kinh thì
không có tác dụng ức chế [23].
- Tác dụng chống oxy hóa:
Theo C. H. Lee và cộng sự [35] thì dịch chiết nước từ thân rễ củ gấu có
vai trò chống thoái hóa thần kinh nhờ tác dụng chống oxy hóa và dọn các gốc
tự do bằng mô hình dùng 6-hydroxydopamine gây bệnh Parkinson ở chuột,
với liều 50 và 100 mg/kg.
- Tác dụng trên cơ trơn:
Theo “Cây thuốc và động vật làm thuốc”, cao lỏng củ gấu 5%, thí
nghiệm trên tử cung cô lập chuột lang, thỏ, mèo và chó đều có tác dụng ức
chế sự co bóp tử cung, đồng thời làm giảm trương lực. Trên tử cung có thai
cũng như trên tử cung bình thường, cao củ gấu đều có tác dụng ức chế. So
sánh với đương quy, tác dụng ức chế co bóp tử cung của củ gấu yếu hơn.
Thành phần tinh dầu chiết từ củ gấu có tác dụng kiểu estrogen, nhưng không
mạnh [23].
Theo nghiên cứu của Vũ Văn Điền, nước sắc của củ gấu biển có tác
dụng giãn cơ tử cung cô lập trên chuột ở liều 0,5-2%; trên thỏ có chửa ở liều
5-6%; giãn cơ tử cung tại chỗ của thỏ ở liều 4-6g/kg [26].
- Tác dụng trên tim mạch:
Theo tác giả Trần Văn Bính, chế phẩm hương phụ biển có tác dụng làm
giảm biên độ co bóp và hơi giảm nhịp tim ếch cô lập ở liều 1-4%, ở liều 5%
tâm trương toàn bộ [20].