BỘ Y TẾ
TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI
NGUYỄN NGỌC TÚ NGHIÊN CỨU PHÂN LOẠI CÁC LOÀI
TRONG CHI GYMNEMA R.BR. THU Ở
VIỆT NAM SỬ DỤNG VÂN TAY HÓA
HỌC HPTLC KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP DƯỢC SĨ HÀ NỘI – 2013 BỘ Y TẾ
TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI NGUYỄN NGỌC TÚ

NGHIÊN CỨU PHÂN LOẠI CÁC LOÀI
TRONG CHI GYMNEMA R.BR. THU Ở
VIỆT NAM SỬ DỤNG VÂN TAY HÓA

viên trong Bộ môn Thực vật trường Đại học Dược Hà Nội đã luôn giúp đỡ, tạo điều
kiện thuận lợi để em hoàn thành tốt quá trình làm thực nghiệm tại Bộ môn.
Tôi cũng xin gửi tới các bạn cùng làm Nghiên cứu và Khóa luận tại Bộ môn
lời cảm ơn chân thành vì những giúp đỡ chân tình trong quá trình làm thực nghiệm.
Cuối cùng, con xin gửi lời cảm ơn sâu sắc tới ông bà, bố mẹ và xin gửi lời
cảm ơn tới em trai đã giúp đỡ và động viên tinh thần con trong suốt những năm
tháng học Đại học.
Hà Nội, tháng 5 năm 2013
Nguyễn Ngọc Tú MỤC LỤC
Danh mục từ viết tắt

Danh mục các bảng

Danh mục các hình

ĐẶT VẤN ĐỀ
1
CHƯƠNG 1. TỔNG QUAN
2
1.1. TỔNG QUAN VỀ CHI GYMNEMA R.BR.
2

2.2.2. Xây dựng quy trình phân tích HPTLC
20
2.2.3. Tiến hành phân tích hóa học một số mẫu trong chi Gymnema
R.Br.
20
2.3. PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
20
2.3.1. Định tính sơ bộ các nhóm chất trong các loài nghiên cứu
20 2.3.2. Xây dựng quy trình phân tích định tính bằng phương pháp sắc
ký lớp mỏng
27
2.3.3. Tiến hành phân tích định tính các phân đoạn dịch chiết một số
loài trong chi Gymnema R.Br.
28
CHƯƠNG 3. THỰC NGHIỆM, KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN
30
3.1. ĐỊNH TÍNH CÁC NHÓM CHẤT CHÍNH
30
3.2. QUY TRÌNH ĐỊNH TÍNH BẰNG PHƯƠNG PHÁP SẮC KÝ
LỚP MỎNG
31
3.2.1. Sàng lọc phương pháp chiết xuất
31
3.2.2. Định tính các phân đoạn dịch chiết
32
3.2.3. Sàng lọc hệ dung môi pha động
33

Deacylgymnemic acid
HL
Hồi lưu
HPTLC
High performance thin layer chromatography (Sắc ký lớp
mỏng hiệu năng cao)
NK
Ngấm kiệt
NL
Ngâm lạnh
STZ
Streptozotocin
TLC
Thin layer chromatography (Sắc ký lớp mỏng)
UPGMA
Unweighted Pair-Group Method with Arithmetical Averages
UV
Ultraviolet light (ánh sáng tử ngoại)
VIS
Visible spectrum (ánh sáng trắng)

DANH MỤC CÁC BẢNG

Bảng 1.1
Danh mục các loài thuộc chi Gymnema R.Br ở Việt
Nam theo Phạm Hoàng Hộ (2000)
2

Giá trị R
f
của các vạch đặc trưng chi Gymnema R.Br.
37
Bảng 3.5
Bảng hệ số tương đồng cặp đôi giữa các mẫu nghiên
cứu, sử dụng chỉ số Nei&Li
44

DANH MỤC CÁC HÌNH

Hình 1.1
Cấu trúc của các acid gymnemic phân lập từ
Gymnema sylvestre (Retz.) R. Br. ex Schult.
5
Hình 1.2
Cấu trúc của Gurmarin
6
Hình 1.3
Sơ đồ tách chiết phân đoạn sử dụng dung môi không
đồng tan
10
Hình 3.1
Sắc ký đồ dịch chiết NL, NK, HL với hệ dung môi
(S.2), hiện màu dưới đèn UV 366nm
32
Hình 3.2

45 1

ĐẶT VẤN ĐỀ
Trong nền y học cổ truyền Ấn Độ Ayurveda, Dây thìa canh (Gymnema
sylvestre (Retz.) R. Br. ex Schult.) đã được sử dụng từ hơn 2.000 năm nay để điều
trị Đái tháo đường [41], [43]. Dựa trên kinh nghiệm này, hàng loạt các nghiên cứu
đã được tiến hành để chứng minh tác dụng sinh học của cây và xác định hoạt chất
chính trong cây, đó là acid gymnemic [36], [38] . Một hướng nghiên cứu mới đang
được các nhà khoa học quan tâm áp dụng là tìm kiếm và sàng lọc tác dụng điều trị
đái tháo đường tương tự Dây thìa canh từ các loài khác trong cùng chi Gymnema
R.Br. Phương pháp này dựa trên nguyên lý là các loài cùng một bậc taxon thực vật
thường có các thành phần hóa học tương tự nhau do đó có xu hướng có tác dụng
sinh học giống nhau [3]. Một số nghiên cứu trên thế giới đã chứng minh được tác
dụng hạ đường huyết tương tự trên các loài Gymnema montanum Hook.f. [15],
Gymnema inodorum (Lour.) Decnc [34], [33], Gymnema yunnanense Tsiang [44]…
Cho đến nay, các nghiên cứu trong nước được tập trung thực hiện trên 2 loài là
Gymnema sylvestre (Retz.) R.Br. ex Schult. [7] và Gymnema latifolium Wallich ex
Wight. [3], [11]. Trong các nghiên cứu này, tác dụng hạ đường huyết đã bước đầu
được chứng minh trên các mẫu thu hái ở trong nước. Tuy nhiên, chưa có nghiên cứu
nào được thực hiện một các hệ thống về sự tương đồng trong thành phần hóa học
của các loài trong chi Gymnema R.Br
Xuất phát từ thực tế này, đề tài “Nghiên cứu phân loại các loài trong chi
Gymnema R.Br. thu ở Việt Nam sử dụng vân tay hóa học HPTLC” được thực hiện
với các mục tiêu sau:
- Xây dựng quy trình định tính các thành phần hóa học một số loài thuộc
chi Gymnema R.Br. bằng phương pháp sắc ký lớp mỏng.
- Xác định sự tương đồng về thành phần hóa học của một số loài trong chi

3
Gymnema inodora (Lour.) Decne.
Lõa ty không mùi
4
Gymnema latifolia Wall. ex Wight.
Lõa ty lá rộng, Dây thìa canh lá
to
5
Gymnema sylvestre (Retz.) R. Br. ex
Schult.
Dây thìa canh, dây muôi, Lõa
ty rừng
6
Gymnema reticulatum (Moon) Alston
Cost.
Dây thìa canh gân mạng
7
Gymnema tingens (Roxb.) Spreng.
Rau mỏ, Lõa ty nhuộm

3

Tuy nhiên, theo tài liệu được công bố mới nhất về họ Thiên lý ở Việt Nam
của Trần Thế Bách (2007), có 5 loài thuộc chi Gymnema R.Br phân bố ở Việt Nam.
Đó là: Gymnema inodorum (Lour.) Decne, Gymnema latifolium Wall. ex Wight,
Gymnema yunnanense Tsiang, Gymnema reticulatum (Moon) Alst. và Gymnema
sylvestre (Retz) R. Br. ex Schult. [2].
1.1.1.2.Đặc điểm thực vật và phân bố:
Đặc điểm thực vật của chi Gymnema R.Br: Cây leo, không có rễ phụ trên
thân. Lá mọc đối, không nạc. Cụm hoa xim, dạng tán đến chùm. Hoa nhỏ. Thùy đài

betaglucoronide của gymemagenin [27]. Cấu trúc của Gymnemagenin và 17 loại
acid gymnemic được minh họa trong Hình 1.1 [36], [38].
Thành phần thứ hai được quan tâm nghiên cứu liên quan đến cơ chế hạ
đường huyết là Gurmarin (Hình 1.2), một polypeptid có khả năng làm mất cảm giác
ngọt mà không ảnh hưởng tới các vị giác khác, được phân lập từ lá Gymnema
sylvestre (Retz.) R.Br. ex Schult [25], [32].
5 Hình 1.1a. Cấu trúc của các acid gymnemic phân lập từ Gymnema sylvestre
(Retz.) R. Br. ex Schult.
6
Hình 1.2. Cấu trúc của Gurmarin Hình 1.1b.Cấu trúc của các acid gymnemic phân lập từ Gymnema sylvestre
(Retz.) R. Br. ex Schult. [37]
7

1.1.3.Tác dụng sinh học
Cho đến nay, các nghiên cứu về hóa học và tác dụng sinh chủ yếu được thực
hiện trên loài Gymnema sylvestre (Retz.) R.Br. ex Schult và đã được công bố. Bên
cạnh đó, một số nghiên cứu cũng được tiến hành trên các loài khác như Gymnema
inodorum (Lour.) Decne, Gymnema latifolium Wall. ex Wight và Gymnema
yunnanense Tsiang (Bảng 1.2)
Bảng 1.2. Một số tác dụng sinh học đã được công bố của các loài trong chi
Gymnema R.Br.

đường huyết bằng STZ. Các phân đoạn dịch chiết n-hexan, chloroform
không có tác dụng trên cả 2 mô hình thí nghiệm. Phân đoạn n-buthanol chỉ
có tác dụng hạ glucose huyết trên mô hình chuột gây tăng đường huyết bằng
STZ.
Năm 2009, Lương Thúy An công bố các kết quả nghiên cứu sau [1]:
₋ Flavonoid tập trung chủ yếu trong phân đoạn ethylacetat và n-buthanol.
Saponin triterpenoid có trong 3 phân đoạn: chloroform, ethylacetat và n-
buthanol, trong đó tập trung chủ yếu trong phân đoạn ethylacetat và n-
buthanol.
₋ Phân lập được 1 flavonoid tinh khiết kí hiệu là A
1
từ phân đoạn ethylacetat
dự kiến là Kaempferol.
Năm 2010, Nguyễn Hương Giang đã công bố các kết quả nghiên cứu sau [6]:
₋ Xây dựng và mô tả được quy trình chiết xuất dạng cao thuốc tinh chế từ dịch
chiết Dây thìa canh (GS4) tối ưu với các điều kiện: kích thước của dược
liệu, phương pháp chiết xuất, nồng độ cồn và pH trong phản ứng acid hóa.
₋ Lựa chọn được 2 hệ dung môi định tính GS4 bằng sắc ký lớp mỏng:
 Hệ 1: Chloroform : Methanol : Acid formic (10 : 1.1 : 0,02) cho 10
vết với thuốc thử hiện màu là H
2
SO
4
10%.
 Hệ 2: Chloroform : Aceton : Acid formic (3.3 : 1 : 0,02) cho 9 vết với
thuốc thử hiện màu là H
2
SO
4
10%.

nhau [22], [10], [5].
a. Chất hấp phụ:
Hiện tượng hấp phụ là sự tích tụ một chất ở thể khí hoặc trong dung dịch trên
bề mặt một chất rắn. Các chất hấp phụ được dùng trong sắc ký lớp mỏng hầu hết là
các oxid không tan, các oxid hydrat hóa và các muối. Các chất hấp phụ thường dùng
là silica, alumina, octadecasilica, cellulose, dextran gel, polyamid, hoặc các resin
trao đổi ion khác. Silicagel là chất hấp phụ thường gặp nhất. Khả năng hấp phụ của
silicagel là do các nhóm silanol có nhóm hydroxyl. Khi bảo quản trong điều kiện
thường, silicagel dễ dàng hấp phụ nước trong không khí, làm giảm khả năng hấp
phụ của nó. Do vậy, silicagel thường được sấy ở 100-120
o
C để loại nước hấp phụ
10

mà không làm mất đi nhóm hydroxyl của đơn vị silanol. Khả năng hấp phụ của
silicagel cao nhất khi được hoạt hóa ở 105
o
C trong 2 giờ [10]. Hình 1.3. Sơ đồ tách chiết phân đoạn sử dụng dung môi không đồng tan [22]
b. Dung môi:
Tốc độ di chuyển của một chất trên bề mặt chất hấp phụ, phụ thuộc vào
dung môi. Tiêu chuẩn quan trọng nhất để lựa chọn một dung môi chính là độ phân
cực của dung môi và pH của dung môi. Chọn lựa dung môi cho sắc ký, cách tốt nhất
Dược liệu
Dịch chiết
methanol
Phân đoạn
n-hexan

Phân cực kém
(hexan, toluen, benzen )
Phân cực mạnh
(glycosid, polyphenol )
Phân cực kém
(silicagel RP )
Phân cực mạnh
(AcCN, methanol, nước )

Mặt khác, pH của dung môi cũng đóng vai trò quan trọng. Khi sắc ký các
polyphenol có tính acid, nếu cho thêm acid (acid formic, acid acetic băng) vào dung
môi sẽ làm giảm tương tác giữa polyphenol và silanol, mẫu sẽ di chuyển nhanh hơn
và vết gọn hơn. Ngược lại, khi sắc ký các alcaloid base có tính kiềm, người ta
thường thêm một ít kiềm (amoniac, triethylamin, diethylamin, dimethyl,
fornamid ) vào dung môi khai triển. Các chất này được gọi là chất điều chỉnh [22],
[10], .
Bảng 1.4. Một số hệ dung môi dùng trong phân tích TLC [22]
Hệ dung môi
Chất hấp phụ
Ứng dụng
Hexan:ethyl acetat
Silica gel
Tách chất ít phân cực hoặc phân
cực trung bình
Petroleum ether :
Chloroform
Silica gel
Tách chất ít phân cực, ví dụ như
các dẫn xuất acid cinamic,
coumarins

Tách chất phân cực nhiều như
đường hoặc glycosid.

1.2.2.2. Ý nghĩa - Ứng dụng
Sắc ký lớp mỏng là một phương pháp đơn giản, kinh tế và nhanh gọn có thể
được dùng cho phân tích định tính và định lượng cũng như là tinh chế hợp chất từ
thiên nhiên. Thực tế, phương pháp này rất hữu ích trong nhận dạng một hợp chất đã
biết và phát hiện sự có mặt của nhiều loại hợp chất khác trong cây cỏ, ví dụ như
phenols, steroids, alkaloids, flavonoid, và coumarin. TLC còn đóng vai trò như một
công cụ bổ trợ tối ưu hóa điều kiện của sắc ký cột, bao gồm lựa chọn pha động và
pha rắn, xác định chất phân lập từ sắc ký cột, cũng như là xác nhận sự tinh khiết của
phân đoạn phân lập được [22].
1.2.2.3. Phương pháp tiến hành
a. Chuẩn bị bản mỏng:
Bản mỏng nên được rửa sạch trước khi tiến hành khai triển do lớp hấp phụ
silicagel có thể dễ dàng bị nhiễn bẩn bởi thời gian và điều kiện bảo quản kém. Bản
mỏng được nhúng vào một bể mở. Dịch rửa có thể là methanol, methanol –
dichloromethan (1:1) hoặc isopropanol, được chạy qua hết bản mỏng. Bản mỏng đã
rửa, sau đó được hoạt hóa lại trong tủ sấy [18].
b. Chấm mẫu:
Chấm mẫu bằng phương pháp thủ công, bán tự động, hay tự động đều có thể
được dùng. Về mặt cơ bản, dịch thử và dịch chuẩn được chấm bằng ống mao quản.
Tuy nhiên, nên sử dụng phương pháp bán tự động hoặc tự động để phun mẫu.
Khoảng cách từ vị trí chấm mẫu đến rìa dưới của bản mỏng phụ thuộc vào kích
13

thước của bản mỏng. Nhìn chung, khoảng cách nên là 10-15mm đối với bản tiện
dùng (conventional plate) và 8-10mm đối với bản hiệu năng cao (high performance
plate). Phần lớn sử dụng bản có kích thước 10mm. Ngày nay, người ta thường chấm
theo băng, độ dài băng khoảng từ 8-10mm đối với bản tiện dùng và 5-8mm đối với

dịch thử nên có độ hòa tan chọn lọc đối với chất phân lập và độ nhớt thấp hơn cũng
như là điểm sôi thấp hơn. Trong trường hợp này, methanol và ethanol thường được
coi là một dung môi tối ưu cho chiết mẫu trong TLC. Sau đó, tinh chế hoặc rửa dịch
chiết toàn phần thường được tiến hành để tách hợp chất mong muốn ra khỏi nhiều
tạp chất không mong muốn [18].
b. Kỹ thuật chấm mẫu
Đây là một bước quan trọng trong phân tích sắc ký lớp mỏng để có được bản
sắc ký có độ phân giải cao. Độ chính xác của các phân tích định lượng cũng bị ảnh
hưởng nhiều bởi bước này và chấm mẫu không đạt yêu cầu chính là một trong
những nguyên nhân gây sai số. Trong kỹ thuật chấm mẫu, cần chú ý một số điểm
như sau:
Lượng mẫu chấm: Khả năng chứa mẫu của bản mỏng là có giới hạn. Nếu
lượng mẫu vượt quá khả năng này thì khả năng tách sẽ giảm đáng kể. Đặc biệt là
các bản mỏng thương mại hiện nay, được tráng sẵn bởi các tiểu phân silicagel mịn
(11-12m và 5-7m), cải thiện được khả năng tách nhưng lại giới hạn khả năng
chứa mẫu. Do đó, cần thăm dò lượng mẫu chấm hợp lý để có được độ phân giải và
độ lặp lại cao nhất [18].
Độ hút ẩm của dung môi dịch chiết sẽ có thể làm thay đổi khả năng khai
triển. Nếu dung môi dịch chiết thân nước, thì sau khi chấm, điểm chấm sẽ hấp phụ
độ ẩm từ không khí đặc biệt là trong điều kiện khí hậu ẩm ướt và ảnh hưởng lớn tới
phân tích sắc ký lớp mỏng. Do đó, sau khi chấm cần sấy khô loại bỏ ẩm ngay từ đầu
nhưng tránh nhiệt độ quá cao làm biến đối chất phân tích.
Hỏng cơ học trên bề mặt bản mỏng do thiết bị chấm mẫu cũng là một trong
những nguyên nhân gây nên kết quả sắc ký không tốt trong phân tích định lượng.
Tuy nhiên, các bản mỏng thương mại có độ chắc cao và thiết bị phun mẫu bán tự
15

động hay tự động có thể hoàn toàn loại bỏ khả năng làm hỏng bề mặt bản mỏng
[18].
c. Ảnh hưởng của sự hấp phụ và độ ẩm tương đối đến sắc ký

f
nói chung không
16

vượt quá ±0.02 nếu thay đổi trong nhiệt độ khai triển rơi vào trong khoảng ±5
0
C.
Như vậy, ảnh hưởng của nhiệt độ trong sắc ký lớp mỏng không quá lớn. Tuy vậy,
nếu sự dao động nhiệt độ khai triển đạt tới mức cao thì kết quả sắc kí bản mỏng sẽ
bị ảnh hưởng lớn. Thứ nhất, điểm sôi, áp suất hơi và khối lượng riêng của mỗi dung
môi trong pha động thay đổi dẫn đến thay đổi trong tỷ lệ mỗi phần trong dung môi
khai triển. Thứ hai, nhiệt độ thay đổi chắc chắn sẽ thay đổi phần nước trong pha
động hai pha dẫn đến thay đổi độ phân cực của pha động và thay đổi phân tích sắc
ký [18].
f. Vật liệu làm bản mỏng và vật liệu tráng bản mỏng.
1.2.3. Sắc ký lớp mỏng hiệu năng cao (High performance thin layer
chromatography – HPTLC)
Sắc ký lớp mỏng hiệu năng cao (HPTLC) là một hình thức tân tiến nhất của
công cụ TLC nhưng nó không đơn giản ám chỉ TLC công cụ tiến hành trên bản
mỏng có hiệu suất đặc biệt cao. HPTLC là một khái niệm lớn bao gồm phương
pháp luận được tiêu chuẩn hóa dựa trên cơ sở khoa học và những phương pháp định
tính, định lượng chính thống. Dụng cụ tinh vi được điều khiển bởi một phần mềm
tích hợp đảm bảo tính ứng dụng, độ tin cậy và độ lặp lại cao nhất của các số liệu
đưa ra. Trong phân tích HPTLC, các thông số của quá trình phân tích được ghi lại
và được kiểm soát chặt chẽ, do đó, đảm bảo được độ lặp lại cao. Đồng thời, các
bước của quá trình phân tích bao gồm phun mẫu, khai triển mẫu và nhận diện vết
được tiến hành bán tự động, giảm thiểu tối đa các sai số có thể gặp phải. Quá trình
phun mẫu được tiến hành bán tự động, đảm bảo chính xác thể tích mẫu phun, tốc độ
phun và không có nguy cơ hỏng cơ học bản mỏng. Trong quá trình khai triển, điều
kiện khai triển về nhiệt độ và độ ẩm được kiểm soát chặt chẽ và ghi lại đầy đủ, đảm