BỘ Y TẾ
TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI
PHẠM ĐỨC VỊNH

TRIỂN KHAI MÔ HÌNH GÂY SỎI TIẾT
NIỆU TRÊN ĐỘNG VẬT THÍ NGHIỆM

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP DƯỢC SĨ

HÀ NỘI - 2013 BỘ Y TẾ

đỡ tôi trong quá trình thực hiện khóa luận tốt ngiệp.
- TS. Nguyễn Hoàng Anh, người thầy đã định hướng, giúp đỡ tôi hoàn thành khóa
luận này.
Lòng nhiệt huyết và say mê nghiên cứu của thầy cô là nguồn động viên, khích lệ
lớn lao đối với tôi trong công việc.
Tôi cũng xin gửi lời cảm ơn tới:
- Các thầy cô giáo, các anh chị kĩ thuật viên trong bộ môn Dược lực đã tạo mọi điều
kiện tốt nhất cho tôi trong suốt thời gian học tập và làm khóa luận tại Bộ môn.
- Ban giám hiệu cùng toàn thể các thầy cô giáo Trường Đại học Dược Hà Nội đã tạo
điều kiện cho tôi được học tập, rèn luyện và tiếp thu những kiến thức bổ ích trong
suốt 5 năm học vừa qua.
Cuối cùng tôi xin cảm ơn gia đình, bạn bè tôi, những người thân yêu đã luôn quan
tâm, chăm sóc, giúp tôi vượt qua mọi khó khăn trong học tập và cuộc sống.

Hà Nội, tháng 5 năm 2013
Sinh viên
Phạm Đức Vịnh
MỤC LỤC

DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CÁC CHỮ VIẾT TẮT i
DANH MỤC CÁC BẢNG ii

CHƯƠNG 3. KẾT QUẢ THỰC NGHIỆM 25
3.1. Kết quả thực nghiệm khảo sát nồng độ của hóa chất và thời gian gây sỏi 25
3.1.1. Thể trạng của chuột thí nghệm khi sử dụng hóa chất gây sỏi ở các nồng độ khác
nhau 25
3.1.2. Khối lượng cơ thể chuột thí nghiệm khi sử dụng hóa chất gây sỏi ở các nồng độ
khác nhau 25
3.1.3. Tinh thể calci oxalat trong nước tiểu khi sử dụng hóa chất gây sỏi ở các nồng độ
khác nhau 27
3.1.4. Sự kết tập tinh thể trong thận khi sử dụng hóa chất gây sỏi ở các nồng độ khác
nhau. 29
3.2. Kết quả triển khai mô hình gây sỏi tiết niệu bằng EG 1% và AC 0,5% 32
3.2.1. Ảnh hưởng của EG 1% và AC 0,5% đến khối lượng cơ thể chuột thí nghiệm 33
3.2.2. Ảnh hưởng của EG 1% và AC 0,5% đến thể tích nước tiểu của các nhóm 34
3.2.3. Ảnh hưởng của EG 1% và AC 0,5% đến pH nước tiểu của các nhóm 34
3.2.4. Ảnh hưởng của EG 1% và AC 0,5% đến sự hình thành tinh thể calci oxalat trong
nước tiểu 35
3.1.4. Ảnh hưởng của EG 1% và AC 0,5% đến các thông số hóa sinh nước tiểu 39
3.1.5. Ảnh hưởng của EG 1% và AC 0,5% đến các thông số liên quan tới thận 39
CHƯƠNG 4. BÀN LUẬN 43
4.1. Bàn luận về liều của hóa chất gây sỏi và thời gian gây sỏi 43
4.2. Bàn luận về việc triển khai mô hình gây sỏi bằng EG 1% và AC 0,5%. 45
KẾT LUẬN VÀ ĐỀ XUẤT 52
i

DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CÁC CHỮ VIẾT TẮT

COM Calci oxalat monohydrat
COD Calci oxalat dihydrat
EG Ethylen glycol
AC Amoni clorid

3.8 Tỉ lệ khối lượng thận so với khối lượng cở thể của các nhóm 39
3.9 Nồng độ Ca, P trong dịch nghiền đồng thể thận của các nhóm 39
3.10 Mức độ và tỉ lệ kết tập sỏi tại thận của các nhóm 40
iii

DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ VÀ ĐỒ THỊ

Hình Nội dung Trang

1.1 Hình dạng tinh thể COD và COM dưới kính hiển vi quang học 3
2.1 Sơ đồ quy trình thực nghiệm thăm dò liều của hóa chất và thời gian gây sỏi 19
2.2 Sơ đồ quy trình triển khai mô hình gây sỏi tiết niệu 22
3.1 Khối lượng cơ thể chuột của 3 nhóm nghiên cứu trong 4 tuần thí nghiệm 25
3.2 Hình ảnh tinh thể calci oxalat niệu dưới kính hiển vi quang học (X 400) 27
3.3 Hình ảnh tiêu bản mô bệnh học thận dưới kính hiển vi phân cực (x 100 ) 29
3.4 Hình ảnh tiêu bản mô bệnh học thận dưới kính hiển vi phân cực (x 400) 30
3.5 Khối lượng cơ thể chuột của các nhóm trong thời gian thí nghiệm 32
3.6
Số lượng tinh thể COD và COM trong nước tiểu của các nhóm trong quá
trình thí nghiệm
36
3.7 Hình ảnh tinh thể calci oxalat trong nước tiểu của các nhóm 37
3.8 Hình ảnh vùng nhu mô thận dưới kính hiển vi phân cực (x100) 40
3.9 Hình ảnh vi thể vùng nhú thận dưới kính hiển vi phân cực ( x100) 41

1


CHƯƠNG 1
TỔNG QUAN
1.1. Sinh lí bệnh sỏi tiết niệu
1.1.1. Định nghĩa
Sỏi tiết niệu là sự hình thành và hiện diện sỏi trong đường tiết niệu. Khi sỏi ở vị trí
nào thì tên gọi theo vị trí giải phẫu (sỏi thận, sỏi niệu quản, sỏi bàng quang) [2].
1.1.2. Đặc điểm dịch tễ bệnh sỏi tiết niệu
Bệnh sỏi tiết niệu là bệnh phổ biến thứ ba trong các bệnh thuộc hệ thống đường
tiết niệu, ảnh hưởng đến 10 - 12% dân số thế giới [51]. Tỉ lệ mắc bệnh khác nhau theo
vùng phụ thuộc vào khí hậu, chế độ ăn, lối sống: 2 - 5% ở châu Á, 8-15% ở châu Âu và
châu Mĩ, khoảng 20% ở Trung Đông [42], [43]. Bệnh gặp ở nam nhiều gấp hai đến ba
lần ở nữ bởi vì khả năng thúc đẩy của testosteron và khả năng ức chế của oestrogen lên
quá trình hình thành sỏi tiết niệu [28], [42]. Sỏi tiết niệu là bệnh có tỉ lệ tái phát rất cao,
khoảng 40% trong vòng 3 năm đầu tiên, 75% trong vòng 10 năm tiếp theo và trong
vòng 25 năm, hầu hết bệnh nhân sẽ tái phát sỏi tiết niệu ít nhất một lần nếu không áp
dụng các liệu pháp phòng bệnh thích hợp [42], [51]. Tỉ lệ tái phát sỏi ở nam giới cũng
cao hơn nữ giới: 70 - 81% ở nam so với 47 - 60% ở nữ [38].
Tuổi mắc bệnh phổ biến là từ 35 - 55 tuổi, thời điểm mắc bệnh khác nhau tùy theo
loại sỏi, tuổi mắc bệnh trung bình đối với sỏi calci là 48,7 tuổi, sỏi struvit là 46,7 tuổi,
sỏi urat là 59,4 tuổi, sỏi cystein là 27,9 tuổi. Ở Việt Nam sỏi thận chiếm 40 %, sỏi niệu
quản chiếm 28,27%, sỏi bàng quang chiếm 28,3%, sỏi niệu đạo chiếm 5,4% trong tổng
số bệnh nhân bị sỏi thận nói chung, sỏi tiết niệu gặp ở nam nhiều gấp 2 lần ở nữ, gặp
nhiều ở người trên 30 tuổi. Sỏi struvit chiếm tỉ lệ cao kèm theo nhiễm khuẩn [1].
3
1.1.3. Phân loại sỏi tiết niệu
1.1.3.1. Phân loại theo thành phần sỏi
Dựa vào thành phần cấu tạo, sỏi tiết niệu được phân loại như sau [13], [26]:

- Các chất hòa tan trong nước tiểu như calci, oxalat, phosphat, urat… vượt quá
ngưỡng (cao hơn nồng độ hòa tan).
- Khi PH nước tiểu acid hóa hoặc kiềm hóa: khi nước tiểu acid hóa (pH < 6) thì dễ
kết tinh sỏi urat và sỏi acid uric; nước tiểu kiềm hóa (pH > 6,5) dễ kết tinh sỏi
oxalat và phosphat.
- Yếu tố di truyền, đặc biệt là sỏi cystin và sỏi acid uric.
 Yếu tố thuận lợi
Các yếu tố thuận lợi cho sự phát sinh bệnh sỏi tiết niệu bao gồm [26] :
- Những người có bệnh dị dạng đường tiết niệu.
- Chỉ có một thận chức năng.
- Bị sỏi thận sớm (dưới 25 tuổi) thường có nguy cơ tái phát cao.
- Uống ít nước.
5
- Nằm bất động lâu ngày.
- Bệnh mắc kèm : rối loạn chuyển hóa, loãng xương, gút, cường giáp trạng.
- Do dùng quá liều các thuốc : calci, vitaminC, vitamin D, acetazolamid, triamteren,
indinavir, sulphonamid.
1.1.4.2. Cơ chế hình thành sỏi tiết niệu
Quá trình hình thành sỏi tiết niệu tương đối phức tạp, bao gồm nhiều sự kiện hóa lí
diễn ra liên tiếp hoặc đồng thời. Mặc dù đã có nhiều nghiên cứu được thực hiện nhưng
cơ chế hình thành sỏi tiết niệu vẫn chưa hoàn toàn sáng tỏ. Nhìn chung, quá trình này
trải qua 5 giai đoạn chính, bao gồm: sự quá bão hòa nước tiểu, tạo nhân tinh thể, sự lớn
lên của tinh thể, kết tập các tinh thể và sự gắn các tinh thể vào mô thận [6], [16], [25] .
 Sự quá bão hòa nước tiểu
Nước tiểu trở thành quá bão hòa khi nồng độ các ion hòa tan của một chất trong
nước tiểu vượt quá giới hạn hòa tan của chất đó. Sự quá bão hòa nước tiểu là nhân tố
thúc đẩy quá trình tạo nhân và lớn lên của tinh thể. Do đó, đây là điều kiện tiên quyết

thước đủ lớn để được giữ lại ở thận bằng quá trình lớn lên đơn thuần [16], [55].
 Sự gắn các tinh thể sỏi vào mô thận
Quá trình các tinh thể sỏi bị giữ lại trong thận được giải thích theo các giả thuyết
khác nhau. Thuyết thứ nhất cho rằng các tinh thể sỏi được hình thành tại các ống thận,
tại đó chúng kết tập, lớn lên đến kích thước đủ để làm tắc ống thận và bị giữ lại. Theo
thuyết thứ hai, các tinh thể sỏi cũng được hình thành ở ống thận nhưng cho rằng tinh
thể được gắn chặt vào một vị trí nào đó tại bề mặt tế bào biểu mô ống thận hoặc tại cấu
trúc nằm trên bề mặt của nhú thận [9]. Các nghiên cứu gần đây xác nhận vai trò quan
trọng của sự tổn thương tế bào biểu mô thận đối với cơ chế hình thành sỏi thận, các tổn
7
thương này đã được phát hiện khi gây sỏi tiết niệu bằng mô hình gây tăng bài tiết
oxalat niệu [49].
1.1.5. Diễn tiến của bệnh sỏi tiết niệu
Sau khi đã hình thành, nếu kích thước nhỏ, sỏi có thể được đào thải một cách tự
nhiên qua đường tiết niệu. Tuy nhiên, nếu sỏi bị vướng lại trong đường tiết niệu sẽ gây
ảnh hưởng đến đường tiết niệu và trải qua các giai đoạn sau [1], [4]:
- Giai đoạn chống đối: Đường tiết niệu phía trên viên sỏi sẽ tăng co bóp để tống sỏi
ra ngoài. Niệu quản và bể thận phía trên viên sỏi chưa bị giãn nở. Có sự tăng áp lực
đột ngột ở đài bể thận gây cơn đau quặn thận.
- Giai đoạn giãn nở: Thông thường sau khoảng 3 tháng, nếu sỏi không di chuyển
được, niệu quản, bể thận và đài thận phía trên viên sỏi sẽ bị giãn nở, nhu động của
niệu quản bị giảm.
- Viên sỏi nằm lâu sẽ không di chuyển được vì bị bám dính vào niêm mạc, niệu quản
bị xơ dày, có thể bị hẹp lại. Chức năng thận sẽ bị giảm dần, thận ứ nước, ứ mủ nếu
có nhiễm trùng. Sỏi còn tồn tại trong đường tiết niệu là một yếu tố thuận lợi cho
việc nhiễm trùng tái diễn, lâu ngày sẽ gây viêm thận mạn tính và suy thận mạn. Sỏi
niệu quản hai bên có thể gây vô niệu do tắc nghẽn.

không quá 3g/ngày), các thức ăn giàu oxalat như bột mì, cacao, chè xanh …
- Đối với bệnh nhân sỏi urat, cần hạn chế thức ăn giàu acid uric (gan, thận, một số
loại cá…. )
9
 Chế độ dùng thuốc
Trong trường hợp đã điều chỉnh chế độ ăn và lượng nước uống thích hợp nhưng
chưa đủ để kiểm soát sự tái phát sỏi tiết niệu, hoặc những bệnh nhân có nguy cơ tái
phát cao, cần kết hợp sử dụng thêm các thuốc như: lợi tiểu thiazid, kali citrat,
orthophosphat … [17], [26].
1.2. Các phương pháp và mô hình nghiên cứu thuốc điều trị sỏi tiết niệu
Các phương pháp nghiên cứu in vitro và các mô hình in vivo được sử dụng trong
nghiên cứu cơ chế và quá trình hình thành sỏi tiết niệu, các yếu tố ảnh hưởng đến sự
phát sinh bệnh sỏi tiết niệu (chế độ ăn, giới tính, bệnh mắc kèm…) và đánh giá tác
dụng dự phòng và điều trị sỏi tiết niệu của các thuốc.
1.2.1. Các phương pháp in vitro trong nghiên cứu thuốc điều trị sỏi tiết niệu
1.2.2.1. Phương pháp đánh giá tác dụng ức chế của thuốc lên quá trình hình thành sỏi
calci oxalat
 Nguyên tắc
Tạo sỏi calci oxalat trong môi trường nước tiểu nhân tạo (nước tiểu nhân tạo được
chuẩn bị theo công thức của Kanavagh và cộng sự ). Khả năng ức chế hình thành sỏi
của thuốc được đánh giá dựa trên số lượng và thành phần sỏi calci oxalat [30].
 Thiết kế thí nghiệm
Chuẩn bị song song mẫu trắng sỏi và mẫu thử. Mẫu trắng sỏi là dung dịch nước
tiểu nhân tạo, được cho thêm dung dịch natri oxalat ở nồng độ thích hợp. Mẫu thử
được chuẩn bị trong cùng điều kiện nhưng cho thêm dung dịch thuốc cần nghiên cứu.
Các mẫu nghiên cứu được ủ ở nhiệt độ 37
o

Chuẩn bị song song mẫu trắng sỏi và mẫu thử. Mẫu trắng sỏi là dung dịch nước
tiểu nhân tạo có nồng độ calci xác định và được thêm một lượng thích hợp dung dịch
oxalat. Mẫu thử được chuẩn bị trong cùng điều kiện nhưng cho thêm dung dịch thuốc
cần nghiên cứu. Đo mật độ quang OD tại bước sóng 620 nm, bắt đầu từ thời điểm phối
hợp dung dịch oxalat với dung dịch nước tiểu nhân tạo.
11
Xây dựng đồ thị của OD theo thời gian. Từ đồ thị, xác định t
i
, là điểm tại đó OD
bắt đầu tăng, và t
s
, là độ dốc của đoạn tuyến tính trên đồ thị. Khả năng ức chế sự tạo
nhân của thuốc được tính toán dựa vào t
i
, t
s
của mẫu trắng sỏi và mẫu thử.
- Áp dụng phương pháp
Phương pháp này này đã được áp dụng để nghiên cứu khả năng ức chế tạo nhân
tinh thể của dịch chiết dược liệu Hernaria hirsuta [21], protein Tamm-Horsfall [31].  Phương pháp đánh giá tác dụng ức chế của thuốc lên giai đoạn lớn lên của tinh thể
- Nguyên tắc
Tốc độ lớn lên của tinh thể calci oxalat tỉ lệ với tốc độ tiêu thụ oxalat trong dung
dịch chứa các tinh thể calci oxalat ở trạng thái cân bằng về động học [12].
- Thiết kế thí nghiệm

thể calci oxalat của dịch chiết dược liệu Hernaria hirsuta [21], Origanum vulgare[18].
1.2.2.3. Phương pháp đánh giá tác dụng hòa tan sỏi tiết niệu in vitro của thuốc
 Thiết kế thí nghiệm
Sỏi tiết niệu lấy từ bệnh nhân được đặt trong môi trường nước tiểu nhân tạo có mặt
chất thử hoặc không có mặt chất thử. Sau một khoảng thời gian thích hợp, lấy sỏi ra và
đem xác định khối lượng. Chất đang nghiên cứu được cho là có tác dụng khi nó làm
giảm khối lượng của viên sỏi ban đầu trong khi mẫu chứng không làm giảm khối lượng
sỏi hoặc giảm ít hơn đáng kể so với mẫu chứng.
13
 Áp dụng mô hình
Phương pháp trên đã được áp dụng trong nghiên cứu tác dụng hòa tan sỏi in vitro
của dịch chiết rễ chuối hột [36] và bài thuốc ngũ linh tán [5].
1.2.2. Các mô hình gây sỏi tiết niệu in vivo và đánh giá tác dụng điều trị sỏi tiết niệu
của thuốc
Do sỏi calci oxalat là loại sỏi phổ biến nhất (chiếm 80% các trường hợp sỏi tiết
niệu) nên hầu hết các mô hình gây sỏi tiết niệu hiện nay đều hướng tới việc gây sỏi
calci oxalat [26].
1.2.2.1. Mô hình gây sỏi tiết niệu thông qua gây tăng bài tiết oxalat niệu bằng hóa
chất tạo sỏi
 Nguyên tắc
Gây tăng bài tiết oxalat niệu bằng cách cho chuột uống hoặc tiêm oxalat hoặc các
chất tiền chuyển hóa của oxalat như natri oxalat [47], amoni oxalat [36], ethylen glycol
[8], [10], [15], [19], glycolat, glyoxylat, hydroxy-L-prolin [34], [46], [48]. Các tiền
chất của oxalat khi vào cơ thể bị chuyển hóa tại gan tạo thành oxalat. Oxalat bài tiết ra
nước tiểu gây quá bão hòa oxalat và tạo ra các tinh thể calci oxalat niệu. Trong các
chất kể trên, ethylen glycol là chất được sử dụng phổ biến nhất trong các mô hình gây
sỏi tiết niệu trên động vật [7], [11], [33], [48].

trong dự phòng sỏi tiết niệu. Mô hình này đã được áp dụng để nghiên cứu tác dụng dự
phòng sỏi tiết niệu của dịch chiết các dược liệu Cynodon dactylon [19], Musa AAB
[45], Hernaria hirsuta [20], Trigonella foenumgraecum [8]…
Trong mô hình nghiên cứu tác dụng hòa tan sỏi tiết niệu của thuốc, lô điều trị được
sử dụng hóa chất gây sỏi để gây sỏi tiết niệu trước, sau đó mới cho sử dụng thuốc cần
15
nghiên cứu trong thời gian thích hợp. Mô hình này đã được áp dụng để nghiên cứu tác
dụng hòa tan sỏi tiết niệu của dịch chiết các dược liệu Cynodon dactylon [19],
Origanum vulgare [10].
1.2.2.2. Mô hình gây sỏi tiết niệu thông qua điều chỉnh chế độ ăn liên quan đến
vitamin B6
 Nguyên tắc
Vitamin B6 ức chế enzym oxy hóa các tiền chất oxalat như glycin, glyoxylat thành
oxalat. Khi thiếu vitamin B6, quá trình tổng hợp oxalat nội sinh tăng lên, oxalat tăng
bài tiết ra nước tiểu kết hợp với calci hình thành các tinh thể calci oxalat [54], [40].
 Thiết kế thí nghiệm
Chuột được chia thành lô chứng trắng, lô chứng bệnh và lô điều trị. Lô chứng bệnh
và lô điều trị được cho ăn thức ăn hoàn toàn không có vitamin B6, lô chứng trắng được
cho ăn với thức ăn tương tự nhưng bổ sung thêm 6mg/kg vitamin B6 vào thức ăn. Lô
điều trị được sử dụng thêm thuốc cần nghiên cứu. Thí nghiệm gây sỏi được tiến hành
trong vòng 12 tuần. Tiến hành lấy mẫu nước tiểu và mẫu thận ở cuối thí nghiệm để xét
nghiệm các chỉ số hóa sinh nước tiểu, đánh giá sự kết tập sỏi calci oxalat trong thận.
 Áp dụng của mô hình
Mô hình gây sỏi tiết niệu bằng chế độ ăn thiếu vitamin B6 đã được áp dụng trong
nghiên cứu tác dụng dự phòng sỏi tiết niệu của pentosan polysulfat [53].
1.2.2.3. Mô hình gây sỏi calci oxalat trên chuột tăng bài tiết calci do di truyền
 Nguyên tắc

tạo quá trình kết tập bằng cách duy trì trạng thái ổn định ở 37
o
C trong vòng 2 tuần. Hạt
17
sỏi calci oxalat được tạo ra có đường kính khoảng 4 mm. Cấy hạt sỏi calci oxalat vào
bàng quang của chuột thông qua phẫu thuật mở bàng quang.
Tất cả chuột sau phẫu thuật cấy sỏi được chia thành lô chứng bệnh và lô được điều
trị bằng thuốc đang nghiên cứu. Sau thời gian thí nghiệm, lấy mẫu máu và mẫu nước
tiểu để xét nghiệm các chỉ số hóa sinh, đồng thời sỏi được lấy ra từ bàng quang để phân
tích kích thước, hình thái, thành phần cấu tạo. So sánh lô điều trị với lô chứng bệnh để
đánh giá tác dụng hòa tan sỏi tiết nệu của thuốc.
 Áp dụng mô hình trong nghiên cứu thuốc điều trị sỏi tiết niệu
Mô hình gây sỏi tiết niệu bằng cách cấy sỏi trực tiệp vào bàng quang của chuột cống
trắng được áp dụng để nghiên cứu tác dụng hòa tan sỏi tiết niệu của dịch chiết dược
liệu Phyllanthus niruri [41].
CHƯƠNG 2
ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
2.1. Nguyên liệu và thiết bị
2.1.1. Hóa chất
- Ethylen glycol ( C
2
H
6
O
2
), 1,111 - 1,115 g/ml, Xilong chemical.
- Amoni clorid ( NH