ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN
TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM
LÊ THỊ QUỲNH HOA Tên đề tài:
“
THIẾT KẾ VECTOR BIỂU HIỆN CÁC GEN MÃ HÓA ENZYME
SINH TỔNG HỢP VANILLIN TRONG
ESCHERICHIA COLI”

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC

Hệ đào tạo : Chính quy

Chuyên ngành : Công nghệ Sinh học
Khoa : CNSH & CNTP
Lớp : 42 - CNSH
Khoá học : 2010 – 2014
Giảng viên hướng dẫn : TS. Dương Văn Cường
Khoa CNTP – CNSH - Trường ĐH Nông Lâm Thái Nguyên


Sinh viên

Lê Thị Quỳnh Hoa
MỤC LỤC

PHẦN 1: MỞ ĐẦU 1
1.1. Đặt vấn đề 1
1.2. Mục tiêu đề tài 2
1.3. Yêu cầu đề tài 2
1.4. Ý nghĩa khoa học và thực tiễn đề tài 2
1.4.1. Ý nghĩa khoa học 2
1.4.2. Ý nghĩa thực tiễn 2
PHẦN 2: TỔNG QUAN TÀI LIỆU 3
2.1. Giới thiệu về vanillin 3
2.1.1. Nguồn gốc 3
2.1.2. Cấu trúc, đặc điểm lí hóa 4
2.1.3. Đặc tính sinh học 4
2.1.4. Vai trò vanillin trong công nghiệp và đời sống 6
2.2. Các con đường sinh tổng hợp vanillin 9
2.2.1. Con đường sinh tổng hợp vanillin trong thực vật 9
2.2.2. Con đường sinh tổng hợp vanillin từ acid ferulic trong vi sinh vật 9
2.3. Các phương pháp sản xuất vanillin 14
2.3.1. Phương pháp tách chiết vanillin từ thực vật 14
2.3.2. Sản xuất vanillin bằng tổng hợp hoá học 15
2.3.3. Sản xuất vanillin bằng ứng dụng công nghệ sinh học 17
2 4. Tiềm năng ứng dụng công nghệ DNA tái tổ hợp trong sản xuất vanillin 20
2.4.1. Các gen mã hóa các enzyme sinh tổng hợp vanillin từ acid ferulic 20
2.4.2. Vi khuẩn E. coli và khả năng sử dụng làm vật chủ sản xuất vanillin. 22
2.5. Tình hình nghiên cứu sản xuất vanillin bằng ứng dụng công nghệ DNA tái tổ
hợp trong nước và ngoài nước 24

4.2.1. Kết quả gắn gen gltA vào pET22b+ tạo tổ hợp pET22-G 55
4.2.2. Kết quả gắn gen ech vào vector pET22-G tạo tổ hợp pET22-GE 57
4.2.3. Kết quả gắn gen fcs vào vector pET22-GE tạo tổ hợp pET22-GEF 60
PHẦN 5: KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 61
5.1. Kết luận 61
5.2. Kiến nghị 61
TÀI LIỆU THAM KHẢO 62
I. Tiếng Việt 62
II. Tiếng Anh 62

DANH MỤC CÁC BẢNG Bảng 2.1: Các đặc tính hóa lí của vanilin (Ravendra, Sharma et al. 2012) 4
Bảng 2.2: Mức độ sử dụng vanillin trong các hạng mục thực phẩm 7
Bảng 2.3: Hàm lượng vanillin có trong các mặt hàng thực phẩm và mỹ phẩm 8
Bảng 2.4: Các chủng vi sinh vật với khả năng sản xuất vanillin trên các cơ chất 19
Bảng 3.1: Các thành phần của vector pTZ57R/T 30
Bảng 3.2: Các thành phần của vector pET22b (+) 32
Bảng 3.3: Trình tự mồi khuếch đại gen ech, fcs 33
Bảng 3.4: Danh mục các thiết bị 36
Bảng 3.5: Thành phần phản ứng PCR 40
Bảng 3.6: Thành phần phản ứng cắt enzyme 44
Bảng 3.7: Thành phần phản ứng nối 45

DANH MỤC CÁC HÌNH

Hình 2.1: Sơ đồ phân bố vanila trên thế giới 3
Hình 2.2: Công thức cấu tạo 4
Hình 2.3: Vanillin dạng bột 4

giữa gen ech và pET22-G 58
Hình 4.13: Kết quả cắt plasmid đồng thời bằng 2 enzyme SacI và EcoRI 58
Hình 4.14: Minh hoạ cơ sở kiểm tra chiều gắn gen ech trong pET22-GE 59
Hình 4.15: Kết quả cắt các dòng đồng thời bằng EcoRI và BamHI 60
DANH MỤC CÁC TỪ, CỤM TỪ VIẾT TẮT 4-CL
: 4-hydroxycinnamate-CoA ligase
ATP : Adenosine triphosphate
Bp

: Base pair

CCl
4

: Carbon tetrachloride
CoA

: Coenzyme Acetoacetyl

ĐHQGHN

: Đại học quốc gia Hà Nội

DNA

: Deoxyribonucleic acid
DNA-PK

LB
: Lauria Broth
NCBI

: Nation Center for Biotechnology
Information

PCR
:
Polymerase Chain Reaction
SDS : Sodium doecyl sulfat
TAE

: Tris acetate EDTA

TCA

: Tricarboxylic acid

VAO
: Vanillyl alcohol oxidase

X-gal

5-bromo-4chloro-3indoly-β-D-
galactoside


vanillin như Amycolatopsis sp. strain HR167 (Achterholt, Priefert, & Steinbuchel,
2000), Delftia acidovorans (R. Plaggenborg, Steinbuchel, & Priefert, 2001),
Pseudomonas putida (R. Plaggenborg, Overhage, Steinbüchel, & Priefert, 2003),
Streptomyces setonii (Sutherland, Crawford, & Pometto, 1983), Pseudomonas 2
fluorescens (Narbad & Gasson, 1998),… Vanillin mặc dù được tổng hợp từ các vi
sinh vật trên song nó bị phân hủy thành các hợp chất khác, do vậy làm giảm nồng
độ vanillin tạo ra. Đồng thời quá trình lên men một số xạ khuẩn thường gặp khó
khăn bởi dịch nuôi cấy có độ nhớt cao do sự sinh trưởng của hệ sợi nấm và bào tử.
Dưới sự phát triển của khoa học công nghệ, các nhà khoa học trên thế giới
đã thành công trong việc tổng hợp vanillin trong các vi khuẩn không mang gen sinh
tổng hợp cũng như không có con đường phân hủy vanillin bằng kĩ thuật DNA tái tổ
hợp. Trong số đó, E. coli được xem là một ứng cử viên tiềm năng cho sản xuất
vanillin bằng các hệ thống vector biểu hiện chứa các gen liên quan tới con đường
chuyển hóa sinh học từ acid ferulic đến vanillin (fcs, ech) và gen tham gia vào sự
tăng cường tổng hợp vanillin (gltA).
Ở Việt Nam, sản xuất vanillin bằng ứng dụng công nghệ DNA tái tổ hợp còn
là một vấn đề mới, các nghiên cứu chỉ dừng lại ở tổng hợp hoá học. Xuất phát từ
thực tiễn, tôi thực hiện đề tài: “ Thiết kế vector biểu hiện các gen mã hóa enzyme
sinh tổng hợp vanillin trong E. coli”, sử dụng gen fcs và ech được tách dòng từ
Pseudomonas fluorescens VTCC-B-668 được phân lập tại Việt Nam và gen gltA từ E. coli.
1.2. Mục tiêu đề tài
- Tách dòng và giải trình tự 2 gen ech và fcs từ chủng Pseudomonas
fluorescens VTCC-B-668 được phân lập tại Việt Nam.
- Thiết kế vector biểu hiện 3 gen mã hóa cho các enzyme sinh tổng hợp vanilin.
1.3. Yêu cầu đề tài
- Tách dòng và giải trình tự được gen fcs, ech từ chủng Pseudomonas fluorescens
VTCC-B-668
Hình 2.1: Sơ đồ phân bố vanila trên thế giới 4
2.1.2. Cấu trúc, đặc điểm lí hóa
Vanillin có dạng bột kết tinh màu trắng với mùi thơm mạnh, dễ chịu. Về mặt
hóa học vanillin là một phenolic aldehyde (3-methoxy-4-hydroxybenzaldehyde), có
công thức phân tử là C
8
H
8
O
3,
bao gồm các nhóm aldehyte, ete, phenol (Converti,
Aliakbarian, Dominguez, Bustos Vazquez, & Perego, 2010).


5
Các nhà nghiên cứu đã phát hiện ra những đặc tính của vanillin như chống
oxy hóa, kháng khuẩn, chống ung thư, chống bệnh hồng cầu lưỡi liềm,…(Sinha et
al., 2008).
2.1.3.1. Hoạt tính kháng vi sinh vật
Vanillin và dẫn xuất thể hiện mức độ khác nhau về hoạt tính kháng nấm bao
gồm các loại nấm men, nấm mốc gây hư hại thực phẩm (Fitzgerald, Stratford,
Gasson, & Narbad, 2005). Vanillin còn ức chế sự sinh trưởng của nấm men và nấm
mốc trong nước hoa quả ép, thạch hoa quả (López-Malo, Alzamora, & Argaiz,
1995) và trong bảo quản xoài chế biến tươi (Ngarmsak et al., 2006) và chống lại
một số nấm men gây bệnh quan trong trong y học như Candida albicans,
Cryptococcus neoformans (Boonchird & Flegel, 1982).
Vanillin đóng vai trò như một tác nhân kháng khuẩn chống lại Escherichia
coli, Lactobacillus p lantarum, Listeria innocua. Schiff bases (thuốc nhuộm
fuchsin) có nguồn gốc từ vanillin được đánh giá là một chất kháng khuẩn chống lại
một số chủng Gram dương và gram âm như Pseudomonas pseudoalcaligens,
Proteus vulgaris, Citrobacter freundii, Enterobacter aero-gens, Staphylococcus
subfava, Bacillus megaterium (Vaghasiya, Nair, Soni, Baluja, & Shanda, 2004).
Tuy nhiên cần có hướng nghiên cứu xác định nồng độ nhỏ nhất mà ở đó vanillin
hoạt động như một chất kháng vi sinh vật cũng như chất bảo quản tự nhiên.
2.1.3.2. Hoạt tính kháng oxy hóa
Vanillin đã được công nhận với khả năng chống oxy hóa cũng như hoạt tính
phân hủy các gốc tự do. Vanillin có khả năng chống lại các tổn thương ở não dưới
sự cảm ứng của carbon tetrachloride (CCl
4
) tác nhân gây oxy hóa ở chuột (Makni,
Chtourou, Barkallah, & Fetoui, 2012), bảo vệ lớp màng ty thể gan khỏi quá trình
oxy hóa được cảm ứng bởi sự nhạy cảm ánh sáng trên ty thể gan chuột (Kamat,
Ghosh, & Devasagayam, 2000). Sự có mặt của vanillin với lượng nhỏ trong thực
phẩm cũng giúp chống lại oxy hóa, ức chế sự tự oxy hóa ở sữa béo.

2.1.4. Vai trò vanillin trong công nghiệp và đời sống
Vanillin được sử dụng nhiều trong công nghiệp thực phẩm, sản xuất nước
hoa, mỹ phẩm và dược phẩm (Sinha et al., 2008). 7
Trong công nghiệp thực phẩm, vanilla là một phụ gia rất thông dụng, đặc
biệt trong sản xuất kem đá lạnh (ice cream). Ngoài sử dụng trong sản xuất kem,
vanillin còn được dùng rất nhiều để làm tăng hương vị và tạo mùi thơm cho bánh,
kẹo, cho các loại đồ uống.
Hương thơm đặc trưng của vanillin được sử dụng trong lĩnh vực mỹ phẩm
như tạo mùi cho nước hoa, kem, sữa dưỡng ẩm, nước hoa xịt phòng, xà phòng ,….
Bảng 2.2: Mức độ sử dụng vanillin trong các hạng mục thực phẩm
Nguồn: CAS N°: 121-33-5
Sản phẩm
Mức độ sử dụng (ppm)
Bình thường Tối đa
Đồ nướng 74.5 106.0
Ngũ cốc 353.0 353.0
Chất béo, tinh dầu 96.0 100.0
Nước sốt ngọt 358.0 363.0
Bánh pudding 47.7 117.0
Đồ ăn nhẹ 200.0 200.0
Đồ uống loại I 39.4 97.4
Các sản phẩm sữa 221.0 314.0
Đồ uống loại II 26.7 55.2
Bơ sữa đông lạnh 1.5 2.7
Các sản phẩm sữa 247.0 408.0
Kẹo mềm 30.1 47.1


Tối đa: 0.03%
Xà bông
Bình thường:0.01%
Tối đa: 0.1%
9
Vanillin còn được sử dụng trong tổng hợp thuốc một số loại thuốc như:
Aldomet (thuốc chống tăng huyết áp), L-dopa (điều trị di chứng của bệnh
Parkinson) và Trimethoprim (điều trị chứng viêm đường hô hấp cấp và một số biến
dạng của bệnh hoa liễu) (Converti et al., 2010).
Vanilin còn là một chấl khử mùi hữu hiệu để che giấu mùi khó chịu của
nhiều loại mặt hàng như đồ may mặc, sản phẩm cao su, giấy và chất dẻo,…Thông
thường chỉ cần đến một lượng nhỏ, vì mùi của vanilin có thể cảm nhận được ngay ở
độ pha loãng khoảng 0,0000002 mg trong 1 m
3
không khí (Đinh Thị Ngọ và cộng
sự, 1991). Ngoài ra, vanillin còn được sử dụng ngăn chặn tạo bọt trong sự bôi trơn
nhiều loại dầu, làm sáng trong lớp phủ kẽm bồn tắm, hỗ trợ sự oxi hóa tinh dầu hạt
lanh, hấp dẫn côn trùng, ngăn chặn xỉn màu răng gây ra bởi khói thuốc lá, hòa tan vitamin
B1 và xúc tác phản ứng trùng hợp methyl methacrylate (Kirk & Othmer, 1983).
2.2. Các con đường sinh tổng hợp vanillin
2.2.1. Con đường sinh tổng hợp vanillin trong thực vật
Quả vanilla được thu hoạch khoảng từ 6 đến 8 tháng sau qua trình thụ phấn
và ở giai đoạn này chúng chưa bộc lộ ra hương vanilla (Walton, Mayer, & Narbad,
2003).
Mùi hương chỉ được giải phóng ra trong quá trình lên men, được gọi là
“curing”. Khi glucoside, glucovanillin, các ß-glucoside liên quan bị thủy phân bởi
enzyme ß-D-glucosidase sẽ giải phóng ra vanillin tự do và các chất liên quan

Các nhà nghiên cứu đã đưa ra 5 con đường chuyển hóa acid ferulic thành
vanillin, đó là con đường Non-β-oxidative deacetylation (CoA-dependent), β-
oxidative deacetylation (CoA-dependent), Non-oxidative decarboxylation, CoA-
Independent Deacetylation, Side-Chain Reductive .
2.2.2.1. Con đường Non-β-oxidative deacetylation (CoA-dependent)
Các gen mã hóa enzyme cần cho con đường Non-β-oxidative deacetylation
đã được xác định và xác nhận hoạt tính của chúng (Gasson et al., 1998).
Hình 2.4 : Con đường Non-β-oxidative deacetylation (CoA-dependent)
(D. Havkin-Frenkel & Belanger, 2010) 11
Con đường này có ba bước xúc tác với sự tham gia của hai enzyme: 4-
hydroxycinnamate-CoA ligase (4-CL) hay feruloyl-CoA synthetase
,
mã hóa bởi gen
fcs và 4-hydroxycinnamate CoA-hydratase/lyase (HCHL) hay enoyl-CoA
hydratase
/
aldolas được mã hóa bởi gen ech. Đầu tiên, enzyme HCHL chuyển acid
ferulic thành feruloyl-ScoA, sau đó 4-CL xúc tác thủy phân feruloyl-ScoA thành

Bước đầu là sự hình thành feruloyl-ScoA từ acid ferulic được xúc tác bởi
enzyme 4-CL. Bước thứ hai enzyme HCHL xúc tác phản ứng cộng nước để tạo
thành 4-hydroxy-3-methoxyphenyl-b-ketopropionyl-ScoA và trải qua quá trình lưu
phân (thyolytic) thành vanillyl-SCoA và acetyl-ScoA. Tiếp theo, vanillyl-ScoA
cộng nước (hydrate) và loại CoASH hình thành vanilin, bước này được xúc tác bởi
enzyme b-ketoacyl-CoA-thiolase (aat).
2.2.2.3. Con đường non-oxidative decarboxylation
Đầu tiên là sự tham gia của enzyme decarboxylase xúc tác phản ứng đồng
phân hóa acid ferulic thành một chất quinoid trung gian và sau đó loại gốc cacboxyl
tạo thành 4-vinylguaiacol (Huang, Dostal, & Rosazza, 1993b).

Hình 2.6: Con đường Non-oxidation decarboxylataion
(D. Havkin-Frenkel & Belanger, 2010)
Các chất trung gian của các phản ứng xuôi dòng tiếp theo giữa 4-
vinylguanicol và vanillin chưa được xác định. Đặc trưng của mỗi loại enzyme
decarboxylase phụ thuộc vào từng vi sinh vật (Barthelmebs, Divies, & Cavin,
2000). Trong số đó ở nấm men Brettanomyces anomalus, enzyme được sản xuất ở
mức độ thấp và được cảm ứng nhờ sự bổ sung của cơ chất (Edlin, Narbad, Gasson,
Dickinson, & Lloyd, 1998).
Rhodotorul aglutinis và Rhodotorula

rubra đã được báo cáo về cơ chế trao
đổi chất acid ferulic qua quá trình loại nhóm cacboxyl (Huang et al., 1993a).
2.2.2.4. Con đường CoA-Independent Deacetylation
14
Đồng thời với phản ứng loại nhóm cacboxyl, acid ferulic bị đồng phân hóa
thành một chất quinoid trung gian tạm thời mà chính nó bị khử thành acid
dihydroferulic (4-hydroxy-3-methoxyphenylpropionic acid) (Rosazza, Huang, Dostal,
Volm, & Rousseau, 1995). Hình 2.8: Con đường Side-Chain Reductive
(D. Havkin-Frenkel & Belanger, 2010)
Con đường này đã được đề xuất cho sự biểu hiện cuả S. cerevisiae dưới điều
kiện yếm khí (Huang et al., 1993b) hoặc Lactobacillus plantarum (Barthelmebs et
al., 2000). Tuy nhiên, sự khử chuỗi bên này còn được báo cáo dưới điều kiện hiếu
khí ở Phanerochaete chrysosporium (Gupta, Hamp, Buswell, & Eriksson, 1981).
Phụ thuộc vào vi sinh vật mà acid dihydroferulic được trao đổi chất tiếp theo thành
homovanillic hoặc acid vanillic. Sau đó, acid vanillic có thể được hoàn nguyên
thành vanillin.
Acid ferulic ngoài là một cơ chất thích hợp cho sản xuất vanillin mà còn biểu
hiện nhiều chức năng sinh lí bao gồm các hoạt tính chống oxi hóa, kháng khuẩn,
chống viêm, chống nghẽn mạch, chống ung thư. Acid ferulic chống lại các chứng
động mạch vành, cholesterol thấp, tăng cường khả năng sống của tinh trùng và còn
được đánh giá là chất có khả năng chống lại các gốc tự do làm giảm thiểu các tác
động gây hại của quá trình oxi hóa (Kanski, Aksenova, Stoyanova, & Butterfield, 2002).

chiết phải cần tới 500 kg vỏ quả tương đương với gần 40000 hoa được thụ phấn
(Ramachandra Rao & Ravishankar, 2000). Do vậy, số lượng vanillin tách chiết tự
nhiên chỉ đáp ứng 1% nhu cầu thị trường (Zamzuri & Abd-Aziz, 2013).
2.3.2. Sản xuất vanillin bằng tổng hợp hoá học 16
Quá trình hóa học đầu tiên để thu vanillin được thực hiện bởi Tiemann vào
năm 1876. Nguyên liệu là eugenol có trong tinh dầu cây đinh hương và được sử
dụng thương mại cho đến những năm 1920. Sau đó vanillin được tổng hợp bằng
dịch kiềm sunphit giàu lignin là sản phẩm phụ của ngành công nghiệp giấy. Quá
trình tổng hợp vanillin bao gồm xử lí dung dịch lỏng chứa lignin bằng các chất oxi
hóa, pH kiềm, nhiệt độ và áp suất cao. Các chất oxi hóa có thể là không khí, oxi,
nitrobenzene hoặc không có sự hỗ trợ của các chất xúc tác. Lignin bị phân hủy và
oxi hóa, vanillin được tạo thành kèm theo các sản phẩm phụ khác (Bjørsvik &
Liguori, 2002).
Sự có mặt cuả các chất tạp nhiễm đòi hỏi phải sử dụng các quá trình tinh
sạch cao. Ngày nay sản xuất vanillin từ lignin không phổ biến nữa bởi vì tác động
xấu tới môi trường. Hơn nữa, dù là cơ chất có nguồn gốc từ tự nhiên song tổng hợp
vanillin từ lignin vẫn bị ghi nhãn là vanillin nhân tạo bởi vì có sự biến đổi hóa học
để thu được sản phẩm cuối cùng (Hopp & Rabenhorst, 2000).
Ngày nay hầu hết vanillin tổng hợp được sản xuất từ nguyên liệu hóa dầu
guaiacol và acid glyoxylic (Kumar, Sharma, & Mishra, 2012). Đây là một quá trình
gồm hai bước bắt đầu với phản ứng ngưng tụ trong môi trường kiềm giữa guanicol
và acid glyoxylic tạo thành acid vanillylmandelic và tiếp đó được chuyển thành
vanillin bởi quá trình loại nhóm CO
2
oxi hóa. Thứ tự của các phản ứng được chỉ ra
ở hình 2.9