DẠI n ọ c QU Ổ C G IA HÀ N ỘI
VIỆN VI SINH VẠT VÀ CÔNG NGHỆ SINH HỌC
BÁO CÁO KÉT QUẢ THỤ C HIỆN
ĐÈ TÀI KHCN NHÓM B CẤP ĐẠI HỌC QUỐC GIA
Tên đề tài: Thiết kế vector biểu hiện gen (rong vi khuẩn Bacillus subtilis
Mã số: QG.10. 22
Chủ trì đề tài: TS. Nguyễn Quỳnh Uyển
Co' quan: Viện Vi sinh vật & Công nghệ Sinh học
Hà Nội. năm 2012
PHẦN I. BÁO CÁO TÓM TÁT 3
Bằng tiếng Việt 3
Bằng tiếng Anh 8
PHẦN II. BÁO CÁO TỐNG KÉT 12
Giải thích chữ viết tắt 13
Danh sách những ngưòi tham gia thực hiện đề tài 14
Danh inục các bảng và hình 15
MỞ ĐẦU 17
CHƯƠNG I. TỎNG QUAN TÀI L IỆU 18
1.1 Vi khuẩn B. subtilỉs 18
1.1.1. Tóm tắt vè B. subtiỉis 18
1.1.2. Tính an toàn của B. subíilis 18
1.1.3. Những ứng dụng của B. subtilis
19
1. 2 Vector bieu hiện và cài nhập gen vào nhiễm sắc thể của vi khuân B. subtilỉs

22
1.2.1. Vector biêu hiện ở E. coli ĩ

22
1.2.2. Vector biểu hiện trong B. subtilis và cài Iiliập gen đích vào nhiễm sắc thể của vi
kliuẩn B. subtiỉis 23

48
3.2.1. Cài nliập gen vào nhiễm sắc thể của vi khuẩn B. subtiỉis PY79.

48
3.2.2. Địnlì lượng hoạt dộ p-galactosidase bằng cơ chất ONPG 50
KẾT LUẬN 53
KIÉN NGHỊ 54
TÀI LIỆU THAM KHẢO 55
1
PHÀN I. BAO CAO TOM TA']
Báo cáo tóm tắt bằng tiếng Việt
1. Tên đề tài: Thiết kế vector biếu hiện gen trong vi khuẩn B. subtiỉis
2. Mã số: QG.10.22
3. Thòi gian thực hiện: 2 năm (2010 - 2012)
4. Cấp quản lý: Đại học Quôc gia Hà nội
5. Chủ trì đề tài: TS. Nguyễn Quỳnh Uyển
Viện Vi sinh vật và Công nghệ sinh học - ĐHQGHN
Điện thoại: 37547694; Fax: 37547407; Email:
6. Cán bộ tham gia: - ThS. Phan Thị Hà
- ThS. Hoàng Văn Vinh
- CN. Hoàng Thu Hà
7. Mục tiêu và nội dung nghiên cửu
Mục tiêu của nghiên cứu là thiết kế vector biểu hiện gen trons tế bào sinh dưỡng của vi
khuẩn B. su b tilis mà không cần sử dụne chất căm ứng.
a. Vector dược thiết kế sẽ phải có đầy đủ các yếu tố sau:
• Promotor: m ạnh, hoạt độna liên tục cùa B. subtilis để gen được cài đặt có
thè biêu hiện mà không cân sử dụna chât cảm ứng (inđucer)
• Vị trí bám của ribosome: vị trí bám tốt của een biểu hiện mạnh trong vi
khuấn B. subtilis
• VỊ trí cắt da diêm: có vị trí căt đa điêm của các enzyme giới hạn thương

su btilis PY79 mà không cần sử dụng chất cảm ứng và hoạt độ này là tương đối cao.
8.2. Kết quả đào tạo
01 T hạcsỹ:
Nguyễn Thị Thúy: Đã bảo vệ ngày 18 tháng 7 năm 2012
Tên khóa luận: “Biểu hiện gen mã hóa cho p-galactosidase trong vi khuẩn B. su b tilis"
5
02 cử nhãn:
1. Nguyễn Thị Hoa: Đã bảo vệ naày 13 thánụ 6 năm 2012
Tên khóa luận: “Thiết kế vector chứa promoter rrnO và vị trí bám ribosome cua gen
sp o V G của B. s u b tilis và tách dòng gen mã hóa cho P-galactosidase trong vector này”
2. Trần Tlíị Trang: Đã bảo vệ ngày 6 tháne, 6 năm 2012
Tên khóa luận: “Biểu hiện gen mã hóa cho p-galactosidase trong vi khuẩn B. su b tilis"
8.3. Bài báo
❖ Nguyễn Quỳnh Uyển, Trần Thị Trang, Phan Thị Hà, Nguyễn Huỳnh Minh Quyên,
Biểu hiện gen mã hóa cho (3-galatosidase trong tế bào sinh dưỡng của vi khuẩn
B a c illus su b tilis, Tạp c h í K h oa họ c và C ô ng n ghệ, Đại học Quốc gia Hà Nội (đã nhận
đăng)
❖ Hoàng Thu Hà, Phan Thị Hà, Nguyễn Quỳnh Uyển. (2011), Thiết kế vector có chứa
promoter và vị trí bám ribosome của vi khuẩn B a cilìus su b tilis và tách dòng gen la cZ
trong vector trên, T ạp c h í D i tru yề n h ọc và ử n g dụ ng , chuyên san Công nghệ Sinh
học, 7. trang 1 -6
9. Tình hình sử dụng kinh phí
- Tổng kinh phí của đề tài được duyệt: 140.000.000 VNĐ
(Tiết kiệm chi 5.100.000 đ), còn thực nhận: 134.900.000 VNĐ
- Tổng kinh phí của đề tài đã quyết toán: 134.900.000 VNĐ, bao gồm các mục:
+ Chi phí thuê mướn: 62.000.000
6
+ Chi phí nghiệp vụ chuyên môn: 66.954.000
+ Photo tài liệu, văn phòng phẩm, chi khác: 3.446.000
+ Quản lý phí: 2.500.000

expression vector
- Successful creating the vector expressed a target gene in bacterium B. su b tilis PY79
with special features as follows:
• Promoter: rrnO P2 is a strong and constitutive one o f B. su btilis, and it regulates
synthesis o f rRNA
• RBS is known sequence RBS o f gene sp o V G , strongly expressed at exponential
phase
• Containing the start codon ATG
• Containing the codon encoding for His Tag behind the start codon to satisfy the
purification o f the target protein by using His Tag column, and behind is the
position of specific cleaving o f thrombin (Leueine-Valine-Proline-Arginine-
Glycine-Serine) which can be used to remove His effectively from the target
protein.
• Selectable cat encoding for chloramphenicol acetyltransferase to select
transformants
9
• Fragments a m v E f and a m yE b homologous with a m yE o f chromosome of B.
su b tỉlis PY79 to participate in double crossover
• MCS composed of: N h e i, E co R V . S a d . Sa il and H in d ìỉì
s Using the combination o f Nhe\. E c o R V and SacI, S a il, H in diU to insert a
target gene into this vector in order to intergrate and express the target gene
in B. sub til is PY79
- Successful expressing o f the gene encoding for ß-galactosidase in the vegetative cells
o f B. s u b tilis PY79 without the use o f inducer and the activity of ß-galactosidase is
relatively high.
9.1. Education results
01 Master student:
Nguyen Thi Thuy: Graduated on July. 18th 2012
Dissertation theme: “Expression o f the gene encoding for ß-ealactosidase in the
vegetative cells o f B. s u b tilis”

Gen mã hóa cho chloramphenicol acetyltransferase
DNA:
Deoxyribonucleic acid
DSM (Difco Sporulation Medium): Môi trường tạo spore của Difeo
IPTG:
Isopropyl thiogalactoside
His: Histidine
M CS (multiple cloning site):
Vị trí đa điểm tách dòng
ONPG:
o-nitrophenyl-(3-D-galactopyranoside
PCR (Polymerase chain reaction):
Phản ứng chuồi trùng hợp
RBS (ribosome binding site): Vị trí bám của ribosome
RNA:
Ribonucleic acid
rRNA: Ribosomal ribonucleic acid
U (Unit):
Đon vị hoạt độ
X-gal:
5-bromo-4-chloro-3-indolyl-p-D-galactopyranoside
DANH SÁCH NHỮ NG NGƯỜI THAM GIA TH Ụ C HIỆN ĐÈ TÀI
1. Chủ trì: TS. Nguyễn Quỳnh Uyển
2. Những nguòi thực hiện:
ThS. Phan Thị Hà
- ThS. Hoàng Văn Vinh
- CN. Hoàng Thu Hà
14
DANH MỤC CÁC BẢNG VÀ HÌNH
Danh mục bảng


45
Hình 14. Cắt kiểm tra plamid pUL2 có chứa đoạn DNA gồm PrrnO-RBS cua gen spoV G -lacZA 6
Hình 15. Bản đồ vector pUL2 47
Hình 16. Vùng chức năng cùa vector pUL2 47
Hình 17. Ket quả xác định hoạt tính amylase cùa các chùng B. subtilis PY79 được biến nạp với
vector pUL2 50
Hình 18. Hoạt độ P-galactosidase 51
Hình 19. Hoạt độ enzyme Ịỉ-galactosidase của các thể tái tổ hợp tại các thời điểm khác nhau 52
Hình 11. Kết qua cắt plamid pULl có chửa gen lacZ chèn thêm 44
I
16
MỎ ĐẦU
B a c illu s su b tilis. đại diện tiêu biêu cua nhóm vi sinh vật Gram dương, là một Irons nhừna
đối tượng được chú trọng nghiên cứu từ lâu do những ưu điêm nổi bật so với E sch erich ia
coli. Khả năng không gây bệnh (B. su btilis được Hiệp hội Thuốc và Thực phẩm của Mỹ
FDA coi là „generally regarded as safe“ - GRAS) và khả năng chịu đựng các điều kiện
nuôi cấy, bảo quản khắc nghiệt hơn của B. su b tilis là nhữníĩ ưu điểm nổi trội của vi sinh
vật này so với E. coli. Trong nghiên cứu cơ bản, B. su b til is đã được sử dụng như mô hình
để nghiên cứu khả năng biệt hoá và cơ chế điều hoà hoạt động của gen trone tế bào.
Trong hướng phát triển các vacxin thế hệ mới, B. su btilỉs đã được phát hiện và nghiên
cứu như một công cụ chuyển kháng nguyên an toàn và tiềm năne. Mặc dù hệ gen của B.
su b tìlis đã được nghiên cứu đầy đủ, nhưne việc chuyển gen vào B. s u b tilis vẫn là vấn đề
khó khăn.
Theo hiểu biết của chúng tôi, một số các vector thương phẩm dùng cho việc tách dòng và
biểu hiện gen trong vi khuân B. su b tilis đã xuất hiện trên thị trường thế giới. Tuy nhiên,
phần lớn các loại vector dùng cho vi sinh vật B. sub tilis thường chỉ dược thiết kế trong
các phòng thí nghiệm chuyên nghiên cứu về B. su b tilis và chỉ phục vụ cho mục đích
nghiên cứu đặc biệt của phòng thí nghiệm đó. Có lẽ cũng vi lý do đó mà ở Việt Nam mới
chỉ có rất ít các công trình nghiên cứu sử dụne B. su b tilis như tế bào chủ để biểu hiện geil.

khoảng 10% trong số chúng chịu,trách nhiệm về việc tône hợp năng lượng tê bào. Các
gen mã hóa cho những chức năng cần thiết nhưng chưa được biêt rõ là 4% [ỉ. 26],
1.1.2. Tính an toàn của B. subtilis
B. su b tilis được coi là sinh vật không gây bệnh và được Hiệp hội Dược phâm và Thực
phẩm của Mỹ (PDA) công nhận là sinh vật an toàn (Generally Regarded As Safe -
GRAS) [17]. B. su b tilis có độc tính rất thấp đối với người vì enzyme ngoại bào và các
tác nhân gây độc do vi sinh vật này sản xuất ra không đù liều lượng và hoạt độ đế có thê
18
gây nguv hại cho naười, ngoại trừ các trường hợp đột biến trong tế bào vi khuẩn hay hệ
miễn dịch của người đang quá suv yếu. Một so chuna B su b tilis cũng như họ hàng gần
cua nó là B. lich en iform is, B. pu m u lis, B m eg aterium có khả năng sản xuất lecithinase.
một enzyme có kha năng phá vờ màng động vật có vú. Tuy nhiên vẫn chưa có bàng
chứng nào cho thấy lecithinase gây bệnh trên người [17]. Một số nshiên cứu cho thấy B.
su b tilis liên quan đến vài trường hợp ngộ độc thực phẩm do vi khuẩn này có khả năng
sản xuất enzyme ngoại bào subtilin. Mặc dù có độc tính thấp trong thành phần protein
của tế bào nhưng subtilin vẫn có khả năng gây dị ứng đối với những người tiếp xúc với
nó trong một thời gian dài và gây ra bệnh viêm da, viêm đường hô hấp Trong một số
trường hợp khác, người ta phát hiện B. su b tilis hiện diện ở những bệnh nhân bị áp-xe
phôi Tuy nhiên tỉ lệ các trường hợp này là rất hiếm (chỉ có 2 trong 1034 ca là do B.
su b til is) [17].
Nhiều nghiên cứu đã chứng minh rằng khi bô sung B. su b tilis vào môi trường nuôi tôm
thi tỉ lệ sống của tôm được cải thiện đáng kể và hệ miễn dịch tăng lên rõ rệt [4], Hiện nay,
việc sử dụng chế phẩm từ vi sinh vật hữu ích trong nuôi trồng thủy sản là hướng đi có ý
nghĩa thực tiễn vê khía cạnh bảo vệ môi trườns và tăna hiệu quả sản xuất. Ngoài ra, B.
su b tilis còn hạn chế vi khuẩn có hại trong đường ruột, giúp chuyển hoá thức ăn một cách
hiệu quả và khốne chế vi khuẩn gây bệnh [23].
1.1.3. N h ữ n g ứ n g d ụ n g c ủ a B. subíU is
1.1.3.1 Trone nghiên cửu cơ bản
t
B. su b tilis được sử dụng như mô hình nghiên cứu quá trình phát triển và biệt hóa của tế

sốt rét ở Ấn Độ) [21]. Do đó, vi khuẩn này được sử dụng như một tác nhân kiểm soát
sinh học trong việc phòng trừ căn bệnh sốt rét.
Dựa vào khả năng tiết, nhiều chủng B a cillus đã được áp dụng để sản xuất thuốc khána
sinh trên quy mô cônR nghiệp. Một số kháng sinh mà B. su b tilis tạo thành là bacitracin,
polymyxin, difficidin. subtilin và mycobacillin. Kháng sinh bacitracin chỉ nhạy với vi
khuân Gram dương, polymyxin lại có khả năng chống lại các vi khuân Gram âm. trong
khi difficidin có phổ kháng khuân rộnạ hơn [20],
1.1.3.3 Trong công nghiệp
Trong môi trường hạn chế chất dinh dưỡng, B. sub tilis sản xuất một số chất có hoạt tính
sinh học như protease, amylase, cellulase, lipase, inosine, riboside, acid am in Dựa vào
khả năng tiết các enzyme. B. su b tilis đã được áp dụng trong công nghiệp đê sản xuất một
số chất phụ eia trona chất tẩy rửa và các sản phẩm khác [34], Gần đây, tất cả các
protease bổ sung vào chất tẩy dùng trên thị trường đều là serine proteasc và được sản
xuất từ các chủng B a c illu s, chủ yêu là từ B. su b tilis. Trên thế giới, mồi năm người ta đã
sử dụng 89% các loại enzyme này cho ngành công nghiệp tẩy rửa. Trong số đó, hai công
ty lớn là N ovo Nordisk và Genencor International mỗi năm đã cung cấp cho thế giới hơn
95% lượng enzyme protease [34]. B. su btilis đã được sử dụng để chuyến hóa vật liệu nổ
thành các hợp chất vô hại vi vi sinh vật này có khả năns loại bỏ các chất thái phóng xạ
hạt nhân [34].
1.1.3.4 Trong nông nghiêp và thủy sản
Các khuẩn lạc của B. su btil is cư trú trên hệ thống rễ cạnh tranh với các loại nấm gây
bệnh như M o nilinia fr u c tic o la , A sp e rg illu s flav us, A. p a r a s itic u s, R h izo cto nia so lani và
các loại vi khuẩn có hại cho cây trồng [17]. Ngoài ra, đối với ngành nuôi thủy sản và
chăn nuôi thú y, B. su b tilis dược áp dụng sản xuất probiotic để xử lý môi trường mự)i
thủy sản, xử lý đáy ao, mùi hôi, rác thải, phổi trộn với thực phẩm tạo hệ men tiêu hóa,
phòng ngừa các bệnh đường ruột và tăng cường khả năng kích thích miễn dịch [4, 5, 23],
B. su b tilis hỗ trợ sự phát triên của thực vật. Vi khuẩn này thường đóng vai trò quan trọng
trong việc tăng cường chất dinh dưỡng trong đất bằng cách tham gia vào chu trình cacbon
và chu trình nitơ. Vi khuân B. su b tilis có khả năng hình thành các màng sinh học
(biofilm), nơi có các quần xã vi sinh vật dày đặc tại bề mặt tiếp xúc giữa không khí và

gen còn nhiều hạn chế.
1.2.2. V ec tor biểu h iệ n tro n g B. subíilis và cài nhập g e n đích vào nhiễm sắc thế củ a vi
khuẩn B. subtil is
1.2.2.1 Vector biêu hiên trong tì. su bti[is
B. su b tilis được xem là vi sinh vật an toàn, nhưng hiện tại phần lớn các vector dùng cho B.
su btilis chỉ được thiết kế với quy mô sử dụng cho riêng phòng thí nghiệm với các mục
đích cụ thể mà vẫn chưa được thương mại hóa một cách rộng rãi. Một số các vector nhân
dòng trong vi khuẩn B. su b tilis đã được biết như pDG364, pD G 1664 [17]. Phần lớn
các vector này đều chỉ chứa 2-3 vị trí cát đa điểm đế có thể chèn gen đích. Khác với vi
khuẩn E. c o li, vi khuẩn B. su b tilis không có khả năng giữ plasmid trong tế bào cùa chúng.
Vì vậy các vector biểu hiện hoặc tách dòng trong vi khuẩn B. su b tilis thường là vector
con thoi (shutile vector) giữa vi khuân này và E.co li [32. 39], Do đó, đế biểu hiện protein
ngoại lai, đoạn chứa gen mã hóa cho protein phải được cài nhập thẳng vào nhiễm sắc thể
của B. su btilis và đoạn cài nhập phải chửa đầy đủ các yếu tố cần thiết cho việc biểu hiện
gen trong tế bào vi khuẩn này. N eoài các yếu tố cần thiết như đối với vector biểu hiện
trong E. co lỉ, vector biểu hiện trong B. su btilis cần phải có thêm đoạn tương đồng với
nhiễm sắc thể của vi khuân B. su b tilis để có thể xảy ra trao đổi chéo tại đây. Đoạn tươne,
đồng được chọn là các đoạn DNA mã hóa cho các gen khône có vai trò quan trọng trong
sự sống của tế bào vi khuẩn vật chủ [20], Cũng giong như E. co li, chất cảm ứng phải
được sử dụng cho các hệ vector biêu hiện trong B. su b tilis. Có thể kể đến hệ vector sử
dụng promoter Pspac (chất cảm ứng là IPTG), pXyi (chất cảm ứng là xylose), pmanp (chất
cảm ứng là mannose) và pgh. (chất cam ứng là maltose) [6, 22). Bên cạnh đó, các
promoter của gen tạo vỏ bào tử như promoter của gen cotB, c o tC [29, 38] cũng được sử
ciụna một cách rộns rãi. Tuy các promoter như vậv không cần sử dụne, chất cảm ứng,
23
nhưng protein khi biểu hiện dưới sự điều khiên của những promoter này thường rất khó
thu dược lượng lớn do phai phá vỡ vỏ bào tử và chi phí khá cao.
Biên nap s.en vào vi k hu â n B. su b tilis
Vector chứa gen đích phải được mở vòng để dễ dàng cài nhập gen đích vào tế bào kha
biến của vi khuân B. sub tilis. Có hai phương pháp cài nhập gen ngoại lai vào nhiễm sắc