BỘ Y TẾ
TRƯỜNG ĐẠI HỌC Dược HÀ NỘI
Họ tên sinh viên : Nguyễn Quỳnh Chi
NGHIÊN cứu sơ BỘ THÀNH PHAN h ó a h ọ c
VÀ MỘT SỐ TÁC DỤNG SINH HỌC
CỦA KHƯƠNG HOẠT
CÓ TRÊN THỊ TRƯỜNG VIỆT NAM
KHÓA LCIỢN TỐT NGHIỆP
DƯỢC Sỉ ĐỢI HỌC
Khoa 51 (1996 - 2001)
Người hướng dẫn : PGS. TS. Mai Tất Tô'
: PGS. TS. B ế Thị Thuấn
Nơi thực hiện : Bộ môn dược lý
: Bộ môn dược liệu
Thời gian thực hiện : 2/200
Hà Nội, tháng 5-2001
M Ờ J ( ỉ ớ k í l l Ơ Q i
(f uu ầ in /t thiù' /tiền đê tà i jV ỹ/tiân cứu áư ểâ t/iàn/i ỷikun Aoẩ
ểtoe 'tm mM áổ ẵíc duny àrnÁ /uie của /cÁưổnỹ /tout m (àền th i tà ưổny í i ê t jVam
toi đ ã n/tđn đưổc /t ưổnọ dẫn tan ũ n/t của
ỉỹSSP. &ĨP. 'Ẩũu 3ư% &o
ỉ ỹ ê ỉ y . P ĩ ỉ j P . S B ế ỉS ìd & ỉ iu ấ n
3 o i xin ểà y ủ ỉ lòn<j é iế t ổn bâu ầắc oảa niìnA tồi títít/y m
7
M ầiàn l/tê cấc
títầ/y ỹflẩũ
,
m ỹiảù , cẩc m /k ỹ ừ ii«u 'ềùên tâtmỹ ểô mon
í2Wd?
(ỷ , ểô môn (SsiMỉ ửêu
càn<j cúc ývỉiòny ếan tfamy tàưổny đ ã ỹkiỷệ đ õ 'IM tao nud đmu
bằng các phản ứng hoá học 13
3.2.3 Chiết tách , phân lập định tính coumarin trong
khương hoạt 20
3.3 Tác dụng dược lý 29
3.3.1 Tác dụng trên tim ếch tại chỗ 29
3.3.2 Tác dụng trên tim ếch cô lập 30
3.3.3 Tác dụng chống viêm cấp 31
3.3.4 Tác dụng chống viêm mãn 32
3.3.5 Tác dụng giảm đau 34
3.3.6 Tác dụng trên huyết áp 36
3.3.7 Tác dụng chống loạn nhịp tim 37
Phần 4 : Kết luận và đề nghị 39
Tài liệu tham khảo
Phụ lục
ĐẶT VÂN ĐỂ
Từ xa xưa tới nay con người đã biết sử dụng cây cỏ trong thiên nhiên để làm
thuốc chữa bệnh . Qua tích luỹ kinh nghiệm dân gian đã dần hình thành nên một
nền y học cổ truyền dân tộc . Cùng với sự phát triển của khoa học hiện đại, ngày
nay, việc sử dụng các vị thuốc y học cổ truyền đã có một số cơ sở khoa học nhất
định .Việc kết hợp giữa y học hiện đại và y học cổ truyền đã , đang và sẽ từng
bước giúp cho việc sử dụng các vị thuốc này ngày một hợp lý và hiệu quả hơn .
Khương hoạt đã được sử dụng từ lâu trong đông y với công năng giải cảm ,
tán phong khử thấp .Theo một số bài thuốc có vị khương hoạt dùng trong đông y,
khương hoạt được dùng theo hai cách chính : dưới dạng nước sắc hoặc tán nhỏ ,
dùng rượu chiêu thuốc . Hiện nay đây là một trong các vị thuốc chúng ta vẫn phải
nhập từ Trung Quốc . Trên thế giới đã có một số công trình nghiên cứu về thành
phần hoá học và tác dụng dược lý của vị thuốc này .
Với mong muốn tìm hiểu vị thuốc khương hoạt có trên thị trường Việt Nam
nhằm xác định tên vị thuốc và làm sáng tỏ công dụng của nó, chúng tôi tiến hành
đề tài “Nghiên cứu sơ bộ thành phần hoá học và một số tác dụng sinh học của
1.2 Đặc điểm vị thuốc
1.2.1 Dược điển Trung Quốc - Tập 1 [12] đã mô tả hình thái vị thuốc :
- Thân rễ của loài Notopterygium incisum : hình trụ hơi cong, dài 3 -1 4 cm,
đường kính 0,6 cm - 2,5 cm . Đoạn đầu còn lưu giữ vết thân, một số ít chia
nhánh . Bề ngoài có màu từ nâu đến nâu hơi đen , phần bị tróc vỏ ngoài có màu
vàng . Đốt ngắn dày đặc nổi lên kết thành vòng như con tằm hoặc các đốt kéo
dài như đốt của cây tre . Chất nhẹ, dễ bẻ, dễ gẫy . vết bẻ không nhẩn , có những
đường n ứ t, phần vỏ màu nâu hơi vàng tới nâu sẫm , có dầu với những điểm dầu
màu nâu . Phần gỗ màu hơi vàng với các tia rõ ràng , phần lõi màu vàng đến
vàng nâu . Mùi thơm , vị hơi đắng và hăng .
- Thân rễ và rễ của loài Notopterygium forbesii : thân rễ gần hình trụ mang vết
thân và phần còn lại của vỏ lá cây . Rễ gần hình nón , có các vết nhăn theo chiều
dọc . Bề ngoài màu nâu với những đốt vòng mau, dài 8cm - 15cm , đường kính
lcm - 3cm . Một số thân rễ mập chắc , có các đốt không đều , phần đầu mang
vết thân , rễ tương đối nhỏ . Chất xốp , dễ bẻ, dễ gãy . vết bẻ hơi nhẩn , vỏ màu
nâu , phần gỗ hơi vàng , mùi thơm .
1.2.2 Theo “ Trang Quốc trung dược tài chân nguỵ kiểm biệt đồ sách” [10]
khương hoạt chính phẩm gồm hai loại:
3
- Khương hoạt: nguyên liệu làm thuốc là
phần thân rễ và rễ đã phơi khô của
khương hoạt Notopterygium incisum
Ting ex .T . Chang họ Hoa tán (Ảnh 1).
Thành phẩm thường chia làm 3 loại :
tàm khương , trúc tiết khương và điều
khương . Đặc điểm của vị thuốc được mô
tả như trong dược điển Trung Quốc [12] Nọtopterygium incisum Ting ex H.T. Chang
ẢNH 1
- Khương hoạt lá rộng : nguyên liệu làm
thuốc là phần thân rễ và rễ khô của khương
tác giả Trung Quốc bằng phương pháp sắc ký khí khối phổ liên hợp đã xác định
được 78 thành phần có trong tinh dầu của loài Notopterygium incisum [21]
1.4.2 Coumarin
Theo tài liệu [18,19,20] trong thân rễ Notopterygium incisum có các chất :
bergapten , bergaptol , bergamottin , isoimperatorin , notopterol , notoptol
nodakenin , demethylfuropinnarin , anhydronotoptol , xanthotoxol , 7-
isopentenyloxy- 6- methoxy- coumarin , 7-(3,7- dimethyl- 2,6- octadienyloxy ) -
6 methoxy coumarin , notoptolide , ethylnotopterol , anhydronotoptoloxide ,
columbianetin . Tài liệu [13] đã nêu phương pháp phân lập notopterol và
isoimperatorin.
5
1.4.3 Acid amin
Đã phân lập được 3 acid amin lần đầu tiên từ loài Notopterygium incisum vào
năm 1994 [18] . Đó là : T- aminobutyric acid , acid aspartic và leucin.
1.4.4 Dân chất acid ferulic
Trong thân rễ của khương hoạt có acid ferulic [18] , phenethyl ferulate và
(-)- bomyl ferulate. Các tác giả Đức đã nêu phương pháp phân lập các dẫn
chất này.
1.4.5 Một số thành phần khác
Một số thành phần khác cũng đã được xác định . Đó là falcarindiol ,
pregnenolone , P- sitosterol, acid oleic , acid linoleic [13,18].
1.5 Tác dụng, công dụng:
Theo quan niệm y học cổ truyền [4] khương hoạt được xếp vào nhóm
thuốc tân ôn giải biểu : vị cay , tính ấm , quy kinh bàng quang , can , thận có tác
dụng tán hàn giải biểu , dùng khi cảm mạo phong hàn , sốt không có mồ hôi ,
đau đầu , toàn thân đau mỏi , có tác dụng trừ thấp chỉ thống để điều trị bệnh
phong thấp . Đặc biệt khương hoạt có tác dụng tốt trong các chứng thấp đau nhức
xương c ố t, thần kinh từ lưng trở lên .
Năm 1993 , các tác giả Nhật Bản [16] đã công bố notopterol là thành
phần có tác dụng giảm đau của N. incisum bằng thử nghiệm gây quặn đau bởi
ếch có trọng lượng 150 - 200 g, chó có trọng lượng 10 - 13 kg do
phòng Giáo tài trường Đại Học Dược cung cấp .
2.3 Nội dung và phương pháp nghiên cứu :
2.3.1 Nghiên cứu thành phần hoá học :
Chúng tôi đã sử dụng các phương pháp ghi trong tài liệu [1,2,5]
2.3.1.1 Xác định hàm lượng tinh dầu trong dược liệu bằng phương
pháp cất kéo hơi nước.
2.3.1.2 Xác định độ ẩm dược liệu trên máy Ưltrax - Germany.
2.3.1.3 Định tính một số nhóm chất tự nhiên trong dược liệu bằng
phương pháp hoá học .
2.3.1.4 Chiết tách , phân lập định tính coumarin trong khương hoạt
bằng phương pháp sắc ký lớp mỏng .
2.3.1.5 Phân lập coumarin bằng sắc ký cộ t. Định tính chất phân lập
được bằng các phản ứng hoá học và phương pháp quang phổ :
8
I
- Phổ tử ngoại được đo trên máy UV-VIS Spectrophotometer cary 1E
varian ( Australia ) tại Phòng thí nghiệm Trung tâm - Trường Đại học
Dược .
- Phổ hồng ngoại được đo trên máy FIIR- 8110 M ( Shimaclzu) tại
phòng Vật lý - Viện kiểm nghiệm .
2.3.2 Tác dụng dược lý
Chế phẩm thử là cao lỏng 1:1 của khương hoạt chế theo phương pháp
sắc đông y.
Theo phương pháp ghi trong tài liệu [3, 11] chúng tôi đã tiến hành
thử một số tác dụng sinh học của nước sắc khương hoạt
2.3.2.1 Tác dung trên tim ếch cỏ lâp
Cô lập tim ếch theo phương pháp Straube . Xác định biên độ và tần số hoạt
động tim khi nuôi bằng dung dịch Ringer tim và dung dịch Ringer tim có thêm
chế phẩm nghiên cứu .
10
PHẦN 3
THỰC NGHIỆM - KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN
3.1 Sơ bộ định tên khoa học yị thuốc
Vị thuốc khương hoạt được thu mua tại phố Lãn Ông - Hà Nội (Ảnh 3) có
các đặc điểm bên ngoài như sau : hình trụ hơi cong , dài 4 -1 0 cm . Đoạn đầu
còn dấu vết của thân và lá . Một số chia nhánh . Bề mặt màu nâu đen , phần bị
tróc vỏ có màu vàng nâu . Đốt ngắn , dày đặc , nổi gồ, kết thành vòng . Nhẹ ,
giòn ,dễ gãy . Mặt gãy có vân hình hoa cúc và khe hở, phần vỏ màu nâu hơi
vàng với những điểm dầu màu nâu , phẩn lõi màu vàng nâu . Vị thuốc có mùi
thơm đặc biệt.
ẢNH 3 : Vị thuốc khương hoạt trên thị trường Việt nam
Căn cứ vào đặc điểm của vị thuốc đã được mô tả trong các tài liệu [10,12]
chúng tôi sơ bộ xác định : vị thuốc khương hoạt có trên thị trường Việt nam hiện
nay được chế biến từ rễ và thân rễ của cây khương hoạt Notopterygium incisum
Ting ex . T. Chang họ Hoa tán Apiaceae .
3.2 Thành phần hoá học
3.2.1 Xác định hàm lượng tinh dầu trong khương hoạt
Bằng cảm quan thấy khương hoạt có mùi thơm hắc đặc biệt, đổng thời căn
cứ vào các tài liệu đã công bố khương hoạt có tinh dầu , do đó chúng tôi đã tiến
hành định lượng tinh dầu bằng phương pháp cất kéo hơi nước [2]
Các bước tiến hành :
■ Cân 20 g dược liệu , thái lát mỏng
■ Cho vào một bình cầu có sẵn 100 ml nước
■ Cất trong 3 giờ kể từ lúc sôi
■ Đọc thể tích tinh dầu và tính kết quả theo công thức :
x% = — . 100 =
—
thêm từ từ 0,5 ml acid sulfuric đặc theo thành ống nghiệm . Mặt phân cách giữa
hai lớp chất lỏng có màu nâu đỏ ( Phản ứng dương tính )
Sơ bộ kết luận trong dược liệu có Phytosterol
3.2.2.2 Đinh tính glycosid tim
Cho 10 g dược liệu vào một bình nón có dung tích 100 ml , thêm 80
ml cồn 25° . Ngâm trong 24 giờ , gạn dịch chiết vào một cốc có mỏ , loại tạp
bằng dung dịch chì acetat 30% . Lọc bỏ tủa . Dịch lọc sau khi bay hơi hết cồn
chọ vào bình gạn , lắc kỹ 3 lần với cloroform , mỗi lần 15 ml . Gạn dịch
cloroform vào một cốc có mỏ . Bay hơi dung m ô i. hoà tan cắn bằng 10 ml dung
dịch cồn 90 0. Dịch cồn làm các phản ứng định tính :
■ Phản ứng Liberman - Bouchardt:
Lấy lml dịch chiết cồn vào một ống nghiệm sạch , khô , cô cạn trên nồi
cách thuỷ , cắn được hoà tan trong lml anhydrit acetic . Đặt nghiêng ống 45° ,
cho thêm từ từ lml acid sulfuric đặc theo thành ống nghiệm, không thấy xuất
hiện màu đỏ nâu ở mặt phân cách ( Phản ứng âm tính )
■ Phản ứng Baliet:
13
Lấy 1 ml dịch chiết cồn , thêm 0.5 ml thuốc thử Baljet ( 1 phần dung
dịch acid picric 1% và 9 phần dung dịch Natri hydroxyd 10%) .Không thấy xuất
hiện màu đỏ cam ( Phản ứng âm tính ).
■ Phản ứng Legal:
Lấy 1 ml dịch chiết cồn , thêm 5 giọt dung dịch Natri nitroprussiat 1%
và thêm từ từ vài giọt dung dịch Natri hydroxyd 10% ( đảm bảo kiềm dư) .
Không thấy xuất hiện màu đỏ ( Phản ứng âm tính ).
Sơ bộ kết luận trong dược liệu không có glycosid tim
3.2.2.3 Đinh tính Alcaloid
Cân 5 g dược liệu vào bình nón dung tích 100 ml . Thêm 50 ml
dung dịch acid sulfuric IN . Để yên ở nhiệt độ phòng trong 30 phút . Đun cách
thuỷ trong 30 phút . Dịch chiết lọc qua giấy lọc vào một bình gạn. Kiềm hoá
bằng dung dịch Amoniac đặc . Lắc kỹ 3 lần với cloroform , mỗi lần 15 ml . Gạn
giọt thuốc thử Fehling B , đun cách thuỷ thấy xuất hiện màu đỏ gạch ( Phản ứiig
dương tính)
Sơ bộ kết luận trong dược liệu có đường khử tự do
3.2.2.5 Đinh tính Saponin
Cho vào ống nghiệm to 1 g dược liệu , thêm 5 ml cồn 70°, đun cách thuỷ
5 phút, lọc nóng qua giấy lọc . Dịch lọc để làm các phản ứng định tính :
■ Lấy lml dịch lọc cho vào một ống nghiệm , thêm 5 ml nước cất .
Lắc kỹ trong 5 phút, thấy có ít bọt và không bền
15
■ Phản ứng Salkovki
Lấy 1 ml dịch chiết cồn cho vào một ống nghiệm , thêm 1 ml acid sulfuric
đặc từ từ theo thành ống nghiệm , không thấy xuất hiện một vòng nâu đỏ ồ giữa
hai lớp chất lỏng và dịch chiết ồ phía trên không có màu xanh (Phản ứng âm tính)
Sơ bộ kết luận trong dược liệu không có Saponin
3.2.2.6 Đinh tính chất béo và caroten
Cho vào một bình cầu 5 g dược liệu , thêm 20 ml ether dầu hoả , đun
hồi lưu cách thuỷ trong 30 phút. Lọc qua giấy lọc gấp nếp . Bay hơi dung môi .
Cắn thu được dùng làm các phản ứng định tính
* Đinh tính chất béo
Hoà tan cắn bằng 2 ml cloroform , nhỏ hai giọt lên tờ giấy lọc , hơ
nóng nhẹ đến khô thấy có vết dầu mỡ ( Phản ứng dương tính )
Sơ bộ kết luận trong dược liệu có chất béo
■ Đinh tính caroten
Cho vào cắn 2 giọt acid sulfuric đặc , không thấy xuất hiện màu
xanh nâu ( Phản ứng âm tính )
Sơ bộ kết luận trong dược liệu không có caroten
3.2.2.1 Đinh tính acid amin
Cho vào một ống nghiệm to 1 g dược liệu , thêm 5 ml cồn 50° , đun
cách thuỷ trong 5 phút . Lọc qua giấy lọc gấp nếp . Lấy 2 ml dịch lọc cho vào
ống nghiệm , thêm vài giọt thuốc thử Ninhydrin 2% trong aceton thấy xuất hiện
(III) clorid thấy xuất hiện màu xanh rêu
■ Phản ứng Cyanidin
Cho 1 ml dịch chiết vào ống nghiệm , thêm vài giọt dung dịch acid
hydroclorid đặc và bột Magie kim loại, đun cách thuỷ vài phút không thấy dung
dịch chuyển màu '
Sơ bộ kết luận trong dược liệu không có flavonoid
*Nhận xét và sơ bộ kết luận
Các phản ứng với dung dịch sắt (DI) clorid trong định tính flavonoid và tanin ;
với kiềm trong định tính flavonoid đều dương tính , song chúng tôi vẫn sơ bộ kết
luận không có những hợp chất này trong dược liệu vì những phản ứng đặc trưng
của chúng đều âm tính .
Như vậy qua kết quả của các phản ứng hoá học trên , chúng tôi sơ bộ kết luận
trong mẫu khương hoạt nghiên cứu có Phytosterol, Acid hữu cơ , Chất béo,
Đường khử, Acid amin và Coumarin , trong đó các phản ứng định tính
coumarin là rõ hơn cả , chứng tỏ thành phần hoá học chính trong khương hoạt
ngoài tinh dầu ra còn có coumarin ; không có Glycosid tim, Alcaloid, Tanin,
Saponin, Caroten và Flavonoid .
Kết quả được ghi trong ở bảng 2
Bảng 2 : Kết quả định tính các hợp chất tự nhiên trong khương hoạt
Hợp chất
Các phản ứng định tính
Kết
quả
Kết luân
Phytosterol
Phản ứng với anhydric acetic và
H?S04 đặc
+ Có
Glycosid tim
Phản ứng Liberman — Bouchardt
-
Chất béo
Vết dầu để lại trên giấy lọc
++
Có
Caroten
Phản ứng với H,S04 đặc
-
Không có
Acid amin
Phản ứng với thuốc thử Ninhydrin
++ Có
Flavonoid Phản ứng với kiềm
+ Không có
Phản ứng với FeCl3 5%
++
Phản ứng Cyanidin
-
Coumarin
Phản ứng mở và đóng vòng lacton
+++
Có
Phản ứng với thuốc thử Diazo
+++
Hiện tượng huỳnh quang tăng lên ở
môi trường kiềm
+++
Ký hiệu + : có phản ứng nhưng không rõ
++ : phản ứng lên rõ
+++ : phản ứng lên rất rõ
Hệ 4 : hexan- ethyl acetat (3:1)
Hệ 5 : ethyl acetat - methanol - nước ( 70:15:15 )
Sau khi triển khai , các bản sắc ký được để ngoài không khí cho bay hết
dung môi , quan sát các vết trên sắc ký bằng huỳnh quang dưới ánh sáng tử
ngoại ở hai bước sóng X = 254 nm và X = 366 nm, hiện màu bằng thuốc thử
Diazo và hơi iod .
Kết quả cho thấy hệ dung môi cloroform - ethyl acetat (1:1) có khả năng
tách rõ nhất đối với các chất trong phân đoạn I và hệ ethyl acetat - methanol -
nước (70:15:15) đối với các chất trong phân đoạn I I .
Trên sắc ký lóp mỏng :
- Phân đoạn I cho 9 vết chất có huỳnh quang dưới ánh sáng tử ngoại , 7 vết
cho màu với thuốc thử Diazo , còn với hơi iod bão hòa có 6 vết chất ( Hình I ,
bảng 3).
- Phân đoạn II có 3 vết chất cho huỳnh quang dưới ánh sáng tử ngoại
ở
bước
sóng X = 366 nm và cho màu với thuốc thử Diazo , với hơi iod bão hoà vết số
3 không màu ( Hình n, bảng 4 ).
Với kết quả sắc ký lớp mỏng trên đây , chúng tôi không nghĩ rằng tất cả
các vết chất có huỳnh quang dưới ánh sáng tử ngoại đều là coumarin và những
22
Copyright: Tài liệu đại học ©