BỘ Y TÊ
TRƯỜNG ĐẠI HỌC Dược HÀ NỘI

lyj

VŨ THỊ THU HƯƠNG
NGHIÊN CỨU THÀNH PHẦN HOÁ HỌC VÀ TÁC
DỤNG KHÁNG KHUAN c ủ a q u ả c â y b ạ c h
CHỈ DI THỰC Ở VIỆT NAM
(KHOÁ LUẬN TỐT NGHIỆP Dược sĩ ĐẠI HỌC KHOÁ 1996 - 2001)
Người hướng dẫn
Nơi thực hiện
Thời gian thực hiện
PGS.TS. BẾ THỊ THUẤN
Bộ môn Dược liệu
2-5/2001
l e m
HÀ NỘI - 5 / 2001
LỜI CAM ƠN
Vói lòng kính trọng và biết ơn sâu sác nhốt, tôi xin bày tỏ lòng
biết ơn chân thành tới:
PGS. TS. Bế Thị Thuẩn.
Người tháy dỡ trục tiếp huóng dân, tận tình chỉ bảo và dành rát
nhiều thòi gian giúp dỡ tôi trong suốt thòi gian thục hiện vò hoàn thành
công trình tốt nghiệp.
Tôi xin chôn thành cảm ơn TS. Chu Thị Lộc, TS. Nguyên Viết Thân,
TS.ĐỖ Ngọc Thanh và các tháy cô giáo, các cán bộ bộ môn Dược
liệu và bộ môn Vi sinh — Kháng sinh đỡ giúp đ ỡ , tạo diêu kiện thuận lợi
cho tôi hoàn thành dề tài tốt nghiệp.
Hà Nội ngày 15 tháng 05 nám 2001.
Sinh viên

siảm đau, hạ sốt, chữa tràng nhạc, viêm tuyến vú, nsạt mũi, viêm mũi chảy
nước hôi, mụn nhợt chốc lở Thành phần hoá học và tác dụns sinh học của rễ
Bạch chí đã được nhiều tác 2Íả trong và ngoài nước nghiên cứu.
Ngoài bộ phận dùnơ là rễ ra, chúng tôi thấy quả Bạch chí cũng là nsuồn
nsuyên liệu rất phong phú. nhưng chưa được sử dụns rộnơ rãi. Tài liệu trons
và ngoài nước viết về quả Bạch chỉ cho tới nay hầu như còn rất hiếm. Chúng
tòi mới chỉ thấy một tài liệu duy nhất, đó là quyển "Những Coumarin và
Furocoumarin tự nhiên” của ‘viết về sự có mật của Byak-
angelicin trong quả của câv Angelica dahurica. Với mong muốn 2Óp phần tìm
nguồn nguyên liệu làm thuốc từ nhữnơ dược liệu sẵn có trong nước, chúns tôi
bước đầu tiến hành sơ bộ nghiên cứu quả cây Bạch chi di thực ở Việt Nam-với
những mục tiêu sau:
- Định tính phát hiện một số hợp chất tự nhiên.
- Định lượng thành phần hoá học chính.
- Chiết xuất, phân lập, tinh chế, phân tích và sơ bộ nhận dạn2 chất phân lập
được.
- Thử tác dụng kháng nấm, kháng khuẩn của dịch chiết quả và thành phần
hoá học chính có trong quả.
1
PHẦN II
TỔNG QUAN
2.1. Đặc điểm thực vật:
Ớ Việt Nam hiện nay chính thức có hai loài cùng cho vị thuốc Bạch chỉ
là Hàng châu Bạch chỉ - Angelica dahurica(Fisch.), Benth.et Hook, và Xuyên
Bạch chỉ- Angelica anomala Lallem họ Hoa tán Ápiaceae [9]. Cả hai loài trên
có nguồn gốc từ Tứ Xuyên - Trung Quốc, đã được di thực vào nước ta từ năm
1960. Cây Bạch chỉ thích nghi và phát triển tốt ở đồng bằng và miền núi phía
Bắc nước ta [7]. Theo Đỗ Tất Lợi [9] và Trần Thuý Nga [11], cây Hàng châu
Bạch chỉ là cây sống lâu năm, cao 1 - l,5m, đường kính thân có thể tới 2-
3cm. Thân rỗng, mặt ngoài có gờ dọc, gốc màu tím hồng, trên màu xanh lục

chỉ là cây ăn rễ sâu, cần cày sâu, bừa kỹ. Đánh luống, gieo hốc, mỗi hốc 10 -
3
15 hạt, tưới nước, vì hạt thích ẩm. Khi cây cao 20 - 30 cm thì tỉa bớt còn vài ba
cây ở mỗi hốc. Cần làm cỏ bón phân khi lá chưa phủ hết mặt luống. Nếu có
bệnh đốm đen (trên lá có đốm đen) thì hái lá đốt đi hoặc phun dịch Bordeaux.
Nếu có sâu bọ nhiều thì dùng thuốc trừ sâu để phun.
Ảnh 2: Bạch chỉ mùa thu hoạch tại xã Vạn Phúc-Thanh Trì-Hà Nội
2.3. Bộ phận dùng, phương pháp thu hái, chê biến:
Bộ phận dùng của Bạch chỉ là rễ củ của cả hai loài. Vào mùa thu, khi trời
khô ráo, đào lấy rễ, cắt bỏ thân và rễ con, rửa sạch đất, để ráo nước, cho vào lò
xông sinh một ngày đêm rồi đem phơi hoặc sấy. Khi khô xông sinh lần nữa
[ 1]. Theo sổ tay trung dược tễ [11], có thể chế biến Bạch chỉ theo phương pháp
sau: Bạch chỉ khô đã sơ chế, rửa sạch, để ráo nước, cho vào nồi nhôm hai lớp,
thêm rượu 15°, chưng cách thuỷ trong 8 giờ đến khi mềm không còn chảy
nước. Cho ra khay, sấy ở 60°-70°C cho đến khô.
Dược điển Việt Nam I tập 2 [4] và Dược điển Việt Nam II tập 3 [5] đã
mô tả về hình thái vị thuốc: rễ nguyên, ít khi phân nhánh, hình chuỳ thẳng
4
hoặc cong queo. Rễ của loài Angelica, dahurica có thiết diện gần như vuông
trong khi rễ của loài Angelica anomala có thiết diện gần tròn. Rễ dài 5-25cm,
đường kính từ 0,5 cm trở lên. Mùi thơm hắc. Đầu rễ phía trên to và còn vết
tích của thân cây, phía dướỉ thuôn nhỏ dần. Mặt ngoài màu vàng nâu có vết
tích của rễ con đã cắt bỏ, có nhiều nếp nhăn xếp thành 4 hàng dọc, nhiều bì
khổng lồi nổi lên thành những vết sần ngang. Mặt cắt ngang màu trắng đến
trắng ngà, nhiều bột, tầng sinh libe-gỗ rõ rệt là một vòng màu nâu, mỏng như
sợi chỉ. Phần vỏ có nhiều đám màu nâu là các ống tiết tinh dầu bị cắt ngang.
Rễ có thể chất cứng chắc, đầu phía trên khó bẻ, vết bẻ lởm chởm, nhiều bột.
Đặc điểm vi học của cả hai loài tương tự giống nhau. Vi phẫu rễ cắt ngang có
cậc đặc điểm: mô mềm vỏ có khuyết, nhiều ống tiết nằm chủ yếu trong phần
libe [1].

hoạt huyết, bài nùng, sinh cơ, giảm đau, làm huyết trong toàn thân vận chuyển
nhanh chóng, thư gân, ra mồ hôi, dùng chữa cảm‘sốt, nhức đầu (đặc biệt vùng
trán), ngạt mũi do bị lạnh, đau răng. Dùng ngoài chữa sưng vú, tràng nhạc,
ghẻ lở, giảm đau, hút mủ [9,12].
Về tác dụng sinh học, chúng tôi ít thấy tài liệu nghiên cứu về tác dụng
của Bạch chỉ với tự cách là 1 vị thuốc cổ truyền mà đa số nghiên cứu về tính
chất và tác dụng của cao Bạch chỉ, các hợp chất Coumarin phân lập được từ
dược liệu. Phạm Duy Mai và cộng sự [10] đã công bố về tác dụng giảm đau
nội tạng, tác dụng kháng khuẩn rõ rệt của cao lỏng Bạch chỉ đối với các chủng
Diplococcus pneumonia, Streptococcus hemolyticus, Staphilococcus aureus,
Bacilus subtilis. Các tác giả Nhật Bản [18] đã xác định được nồng độ ức chế
tối thiểu của 5,8-di - (2,3-dihydroxy-3-methyl butoxyl) Psoralen,
Isoimperatarin, Imperatorin, Phellopterin, Byak-angelicin, Scopolethin phân
lập từ rễ
Angelica dahurica đối với các chủng Bacilus subtilis, E.coli,
Cladosporium herbarum, Aspergilus Candidas. Năm 1999, Đàm Hương
6
Huyền và cộng sự [13] đã thử một số tác dụng dược lý của nước sắc (1:1)
Bạch chỉ di thực. Kết quả cho thấy:
- Với liều 2,5g/kg, chế phẩm có tác dụng chống viêm trên chuột cống
trắng sau 24 giờ.
- Vói liều 0,3g/kg, chế phẩm có tác dụng chống đông máu trên thỏ.
- Dung dịch chế phẩm ở nồng độ 2 % trong dung dịch Ringer tim làm
giảm biên độ co bóp cơ tim ếch cô lập.
- Với liều 0,3g/kg, chế phấm gây hạ huyết áp thỏ 30 phút sau khi uống.
Ngoài ra, chế phẩm không làm thay đổi nhịp tim ếch tại chỗ, không gây
giãn cơ trơn mạch máu tai thỏ cô lập và dung dịch chế phẩm ở nồng độ 0,1%
trong dung dịch Tyrode không ảnh hưởng đến nhu động ruột thỏ.
Đối với quả Bạch chỉ, ngoài tài liệu [19] ra cho đến nay chúng tôi chưa
thấy tài liệu nào công bố về thành phần hoá học cũng như về tác dụng và công

vi sinh-kháng sinh trường Đại học Dược Hà nội.
8
3.2. Kết quả thực nghiệm và nhận xét.
3.2.1. Đinh lương tinh dầu trong quả Bạch chỉ [2]:
Cân 20 g dược liệu, cho vào bình cầu cổ mài dung tích 500 ml. Thêm
200 ml nước cất. Lắp dụng cụ. Đun trực tiếp trên bếp điện (qua lưới amiang)
trong 2 giờ. Ngừng cất. Tháo dụng cụ. Lấy riêng phần ống hứng tinh dầu, điều
chỉnh cho tinh dầu vào phần chia vạch. Đọc thể tích tinh dầu và tính kết quả.
Hàm lượng tinh dầu trong được liệu được tính theo công thức:
ỵo/ - ^xlQQ _ Kx 10000
a ~ 2000 - 20 X A/
Trong đó: X : Hẳm lượng tinh dầu (%).
V: Thể tích tinh dầu (ml).
M: Hàm ẩm dược liệu (12,4%).
Ik Z.
Kết quả cho thấy hàm lượng tinh dầu trong quả Bạch chỉ khô tuyệt đối là
1,56% (Bảng 1).
Bảng 1: Hàm lượng tinh dầu trong quả Bạch chỉ.
Mẫu 1 Mẫu 2 Mẫu 3
Lượng dược liệu (g)
20,00
20,00 20,00
Thể tích tinh dầu (ml)
0,28
0,25
0,29
Hàm lượng tinh dầu (%)
1,60
1,43 1,66
Trung bình (%)

90°. Dịch cồn làm các phản ứng định tính:
• Phản ứng Liberman-Bouchardat:
Lấy lml dịch chiết cồn, thêm vài giọt acid acetic và 2ml hỗn hợp
anhydrid acetic: acid sulfuric (50:1),trộn đều. Không thấy sự thay đổi màu từ
hồng đến xanh lá (phản ứng âm tính).
• Phản ứng Baliet:
Lấy lml dịch chiết cồn, thêm 0,5ml thuốc thử Baljet (1 phần dung dịch
acid picric ỉ % trong cồn và 9 phần dung dịch NaOH 10%) không thấy xuất
hiện màu đỏ cam (phản ứng âm tính).
• Phản ứng legal:
Lấy 1 ml dịch chiết cồn, thêm 5 giọt dung dịch Natri nitroprusiat 1%,
thêm từ từ vài giọt dung dịch Natri hydroxid 10% (bảo đảm kiềm dư). Có xuất
hiện mầu đỏ (phản ứng dương tính).
Sơ bộ kết luận trong dược liệu không có Glycosid tim thuộc nhóm
Cardenolid.
♦> Định tính Tanin :
11
Cho vào ốns nghiệm to lg dược liệu, thêm 5ml nước cất, đun sôi trực tiếp
trên bếp điện trong vài phút, lọc nóng qua giấy lọc gấp nếp. Dịch lọc để làm
các phản ứng định tính:
• Phản ứng với thuốc thử sát (III) clorid 5%:
Cho vào ống nghiệm lml dịch lọc, thêm vài giọt thuốc thử thấy xuất hiện
màu xanh đen (phản ứng dương tính).
• Phản ứng với dung dich Gelatin 1%:
Cho vào ống nghiệm lml dịch lọc, thêm vài giọt thuốc thử không thấy
xuất hiện tủa bông trắng (phản ứng âm tính).
Sơ bộ kết luận trong dược liệu không có Tanin.
♦> Định tính Saponin :
Cho vào ống nghiệm to lg dược liệu, thêm 10ml cồn 70°, đun cách thuỷ
3 phút, lọc nóng qua giấy lọc, dịch lọc để làm phản ứng định tính.

Cho vào ống nghiệm to 0,5g dược liệu, thêm 5ml cồn 50°, đun trên nồi
cách thuỷ sôi trong 5 phút, lọc. Dịch lọc để làm các phản ứng định tính:
• Đinh tính đường khử:
Lấy 2ml dịch chiết vào ống nghiệm, thêm 2 giọt thuốc thử fehling A, 2
giọt thuốc thử fehling B, lắc, không thấy xuất hiện màu đỏ nâu (phản ứng âm
tính).
Sơ bộ kết luận trong dược liệu không có đường khử.
• Đinh tính acid amin:
Lấy 2ml dịch chiết vào ống nghiệm, thêm vài giọt thuốc thử Ninhydrin
2%, lắc kỹ, rồi đun trên nổi cách thuỷ sôi trong vài phút, không thấy xuất hiện
màu xanh tím (phản ứng âm tính).
Sơ bộ kết luận trong dược liệu không có Acid amin.
❖ Định tính Flavonoid :
Cho vào 1 bình cầu 3g dược liệu, đun hồi lưu cách thủy với 20ml cồn 70°
trong 30 phút. Lọc qua giấy lọc. Bay hơi dung môi, hoà tan cắn bằng 10ml
13
nước nóng, để nguội, dịch chiết được lắc với cloroform 2 lần, mỗi lần 15ml.
Phần nước còn lại sau khi lắc được cô tới cạn, hoà tan cắn bằng 5ml cồn 70°
để làm các phản ứng định tính:
• Phản ứng với kiềm:
Nhỏ 2 giọt dịch chiết lên tờ giấy lọc, hơ nóng nhẹ đến khô, hơ lên miệng
lọ đựng amoniac đặc, thấy màu vàng tăng lên rõ rệt.
• Phàn ứng với dung dich sắt (IIĨ) clorid:
Cho lml dịch chiết vào ống nghiệm, thêm vài giọt dung dịch sắt (III)
clorid 5%, thấy xuất hiện mầu xanh đen.
• Phản ứng Cyanỉdin:
Cho lml dịch chiết vào ống nghiệm, thêm một ít bột Magie kim loại, vài
giọt dung dịch acid clohydric đặc, đun cách thuỷ vài phút, thấy mầu dịch chiết
không thay đổi.
Sơ bộ kết luận trong dược liệu không có Flavonoid.

♦♦♦ Định tính Ảlcaloid :
Cho 2g dược liệu vào 1 bình nón dung tích 50ml, thấm ẩm bằng dung
dịch amoniac, để yên trong 30’. Thêm 30ml cloroform để qua đêm. Dịch chiết
lọc qua giấy lọc vào 1 bình gạn, lắc với 10ml acid sulfuric 10%. Gạn lớp acid
làm các phản ứng định tính:
• Phản ứng với thuốc thử Dragendorff:
Cho vào ống nghiệm lml dịch chiết, thêm vài giọt thuốc thử
Dragendorff, lắc kỹ, không thấy xuất hiện tủa màu vàng cam (phản ứng âm
tính).
• Phản ứng với thuốc thử Mayer:
Cho vào ống nghiệm lml dịch chiết, thêm vài giọt thuốc thử Mayer, lắc,
không thấy xuất hiện tủa trắng hơi vàng (phản ứng âm tính).
15
• Phản ứng với thuốc thử Bouchardat:
Cho vào ống nghiệm lml dịch chiết, thêm vài giọt thuốc thử Bouchardat.
Không thấy xuất hiện tủa màu nâu. (phản ứng âm tính).
Sơ bộ kết luận trong dược liệu không có Alcaloid.
Nhân xét và sơ bỏ kết luân:
- Các phản ứng: với thuốc thử Legal trong định tính Glycosid tim, với
kiềm trong định tính Flavonoid, với dung dịch sắt (III) clorid trong định tính
Flavonoid và Tanin đều dương tính, song chúng tồi vẫn sơ bộ kết luận không
, có những hợp chất này trong dược liệu,vì những phản ứng đặc trưng của chúng
âm tính.
- Qua kết quả của các phản ứng hoá học đặc trưng cho từng nhóm chất
trên đây, chúng tôi sơ bộ kết luận trong quả bạch chỉ có Coumarin,
Phytosterol, chất béo, Caroten, acid hữu cơ, trong đó có thể coi Coumarin là
thành phần hoá học chính.Không có: Flavonoid, Glycosid tim, Saponin, Tanin,
alcaloid, acid amin, đường khử.
Kết quả được ghi ở bảng 2:
16

Acid hữu cơ
Phản ứng với Na2C03
+
Có
Saponin
Quan sát hiện tượng tạo bọt
-
Không có
Quan sát hiện tượng phá huyết
-
Không có
Chất béo
Vết dầu để lại trên giấy lọc
+
Có
Caroten Phản ứng với H2S04 đặc
+
Có
Đường khử Phản ứng với thuốc thử Fehling
-
Không có
Acid amin
Phản ứng với thuốc thử Ninhydrin
-
Không có
Flavonoid
Phản ứng với kiềm
++
Phản ứng với dung dịch FeCl-Ị 5% ++
Phản ứng Cyanidin

vết đậm ( vết 1,3,4,6,7,8 ) và 2 vết mờ ( vết 2,5 ). Với thuốc thử Diazo và hơi
lot, vết 4 và 7 hiện màu rõ và đậm ( hình I, bảng 3 ).
18
Hình I: sắc ký đồ SKLM định tính Coumarin trong quả Bạch chỉ
Hệ dung môi: Cloroform : Methanol [9:1]
19
Bảng 3: Giá trị Rf và màu sác các vết coumarin trong quả bạch chỉ
trên sắc ký lớp mỏng một clìiều.Hệ dung môi Cloroform:Methanol [9:1]:
Vết RfxlOO
Màu sắc các vết
chất
Hệ
DM 1
Hệ
DM 2
Hệ
DM 3
Ánh sáng
thường
u v
Ằ = 366nm
TT Diazo
Hơi iod
8 89.65 72.41 83.90 Không màu
Tím Hơi vàng
Vàng
7 83.90 85.05 77.01
Không màu
Vàng
Đỏ

sơ bộ với dịch chiết chưa qua giai đoạn tinh chế, nhưng chúng tôi có thể khẳng
định chắc chắn rằng: Trong dịch chiết cồn của quả Bạch chỉ có Coumarin hàm
lượng tương đối cao và có thành phần phong phú.
♦> Chiết tách và phân lập định tính Coumarin:
Để chiết xuất Coumarin từ quả Bậch chỉ khô, chúng tôi sử dụng phương
pháp chiết nóng với dung môi là Ethanol 90°.
Cho 100 g dược liệu khô vào bình cầu có ống sinh hàn hồi lưu, thêm
dung môi ngập dược liệu, đun hồi lưu cách thủy trong 3 giờ. Rút dịch chiết 1,
bã dược liệu được chiết lại 2 lần nữa. Cất thu hồi dung môi bằng máy cất quay
dưới áp lực giảm, dịch chiết đậm đặc đem cô cách thủy cho hết cồn, thêm
nước, hoà tan cao trên nồi cách thúy sôi, lọc nóng vào bình gạn, lắc nhiều lần
với ether dầu hoả cho đến khi dịch chiết không màu với thuốc thử Diazo. Gộp
dịch chiết, cất thu hồi dung môi, cặn được sấy khô bằng Silicagel trong bình
hút ẩm. Thu được 2,30 g Coumarin thô ( Phân đoạn I ) .
Phần nước còn lại sau khi bay hơi hết dung môi lại cho vào bình gạn lắc
nhiều lần với Cloroform cho đến khi dịch chiết không còn phản ứng với thuốc
thử Diazo nữa. Gộp dịch chiết, cất thu hồi dung mồi, cắn được sấy khô bằng
Silicagel trong bình hút ẩm, thu được 4,63g Coumarin thô ( Phân đoạn II).
Qui trình chiết xuất và phân lập Coumarin được tóm tắt trên sơ đồ 1:
21
Sơ đồ 1: Sơ độ chiết xuất, phân lập Coumarin trong quả Bạch chỉ.
Bằng SKLM một chiều, so với dịch chiết Coumarin toàn phần trên hệ
dung môi Cloroform : Methanol [9 : 1 ], kết quả cho thấy:
Phân đoạn I chỉ cho 1 vết tương ứng với vết số 7 ở dịch chiết Coumarin
toàn phần cả về giá trị Rf và màu sắc.
Phân đoạn II cho 2 vết, tương ứng với các vết 4,5 ở dịch chiết Coumarin
toàn phần.( hình II ).
22