BỘ Y TẾ
TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI

BẠC CẦM MY

NGHIÊN CỨU ĐẶC ĐIỂM THỰC VẬT,
THÀNH PHẦN HÓA HỌC
VÀ TÁC DỤNG KHÁNG KHUẨN
CỦA LÁ CÂY HỒNG

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP DƯỢC SĨ

HÀ NỘI – 2014

BỘ Y TẾ
TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI BẠC CẦM MY

NGHIÊN CỨU ĐẶC ĐIỂM THỰC VẬT,
THÀNH PHẦN HÓA HỌC
VÀ TÁC DỤNG KHÁNG KHUẨN
CỦA LÁ CÂY HỒNG


Hà Nội, ngày 01 tháng 05 năm 2014
Sinh viên
Bạc Cầm My

MỤC LỤC

ĐẶT VẤN ĐỀ 1
CHƯƠNG 1. TỔNG QUAN 2
1.1. Đặc điểm thực vật 2
1.2. Thành phần hóa học 5
1.3. Tác dụng sinh học của vị thuốc lá cây Hồng 8
CHƯƠNG 2. ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 11
2.1. Nguyên vật liệu và thiết bị nghiên cứu 11
2.2. Nội dung nghiên cứu 13
2.3. Phương pháp nghiên cứu 14
CHƯƠNG 3. THỰC NGHIỆM, KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN 16
3.1. Nghiên cứu đặc điểm thực vật của lá cây Hồng 16
3.1.1. Đặc điểm hình thái 16
3.1.2. Đặc điểm vi phẫu 17
3.1.3. Đặc điểm bột lá 19
3.2. Nghiên cứu thành phần hóa học của lá cây Hồng 20
3.2.1. Định tính các nhóm chất trong dược liệu bằng phản ứng hóa học 20
3.2.2. Chiết xuất, định tính và định lượng các phân đoạn 28
3.3. Thử tác dụng kháng khuẩn của lá cây Hồng 42
3.3.1. Thử tác dụng kháng khuẩn của cao cồn toàn phần 42
3.3.2. Thử tác dụng kháng khuẩn của phân đoạn chloroform và ethyl acetat 45
3.4. Bàn luận 47
KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 49
TÀI LIỆU THAM KHẢO 51 DANH MỤC CÁC BẢNG

STT

Tên bảng Trang

1
Bảng 1.1. Nồng độ ức chế tối thiểu (MIC) của kaempferol phân lập
từ lá Hồng đối với một số chủng vi sinh vật
9
2 Bảng 3.1. Kết quả định tính các nhóm chất trong lá cây Hồng 27
3 Bảng 3.2. Hàm lượng cắn các phân đoạn dịch chiết lá Hồng 31
4 Bảng 3.3. Kết quả định tính cắn các phân đoạn dịch chiết lá Hồng 32
5
Bảng 3.4. Kết quả thử hoạt tính kháng khuẩn của cao lỏng toàn phần
các nồng độ 1:1, 1:2, 1:4
44
6
Bảng 3.5. Kết quả thử hoạt tính kháng khuẩn của 2 phân đoạn
chloroform và ethyl acetat
45

11
Hình 3.8. Kết quả sắc ký đồ phân đoạn n-hexan dịch chiết lá Hồng
quan sát dưới ánh sáng tử ngoại bước sóng 366 nm
35
12
Hình 3.9 Sắc ký đồ phân đoạn chloroform dịch chiết lá Hồng với hệ
dung môi khai triển Toluen: EtOAc: Acid formic (8:3:1)
37
13
Hình 3.10. Kết quả sắc ký đồ phân đoạn chloroform dịch chiết lá
Hồng quan sát dưới ánh sáng tử ngoại bước sóng 366 nm
38
14
Hình 3.11. Sắc ký đồ phân đoạn ethyl acetat với hệ dung môi khai
triển Toluen: EtOAc: Acid formic (9:6:1)
40
15
Hình 3.12. Kết quả sắc ký đồ phân đoạn ethyl acetat quan sát dưới
ánh sáng tử ngoại bước sóng 366 nm
41
16
Hình 3.13. Sơ đồ sắp xếp khoanh giấy lọc các mẫu thử hoạt tính
kháng khuẩn
43
17
Hình 3.15. Vòng vô khuẩn của mẫu thử phân đoạn chloroform và
ethyl acetat với vi khuẩn Bacillus pumilus và Shigella flexneri
46

1

2

Chương 1. TỔNG QUAN
1.1. Đặc điểm thực vật
1.1.1. Vị trí phân loại chi Diospyros
Cây Hồng có tên khoa học là Diospyros kaki L.f., tên đồng nghĩa: Diospyros
chinensis Blume, là một loài thuộc chi Diospyros. Cây còn có các tên gọi khác như
thị đinh, mác pháp (Tày)… Tên nước ngoài: Kaki – persimmon, Japanese
persimmon (Anh); kakier, plaqueminier kaki, plaqueminier du Japon, coing de
Chine (Pháp) [10], Shi Zi (Trung Quốc) [19].
Theo hệ thống phân loại thực vật của Takhtajan 1987 [1],[6], [24], vị trí phân
loại của chi Diospyros được tóm tắt như sau:
Giới thực vật (Plantae)
Ngành Ngọc lan (Magnoliophyta)
Lớp Ngọc lan (Magnoliopsida)
Phân lớp Sổ (Dilleniidae)
Liên bộ Đỗ quyên (Ericanae)
Bộ Thị (Ebenales)
Họ Thị (Ebenaceae)
Chi Diospyros
1.1.2. Đặc điểm thực vật và phân bố chi Diospyros
1.1.2.1. Đặc điểm thực vật
Cây gỗ hoặc cây bụi, rụng lá hoặc thường xanh. Lá mọc so le, nguyên [7].
Thỉnh thoảng có các vết mờ rải rác hoặc các vết rỗ lớn [22].
Hoa thường đơn tính, khác gốc hoặc cùng gốc; hiếm khi lưỡng tính. Hoa đực
mọc thành xim ở nách lá; nhị từ 4 đến rất nhiều, thường kết hợp thành 2 vòng xoắn.
Hoa cái thường đơn độc, mọc ở nách lá; nhị lép 1-16 hoặc không có; bầu thường có
2 ô. Đài hoa thường có 3-7 thùy. Tràng hoa hình chum, hình chuông, hoặc hình ống,
3-7 thùy, rụng sớm. Quả thịt, mang đài to không rụng. Hạt 1-10 (hoặc hơn), thường
hẹp theo bề ngang [22].

Ở Việt Nam, D. kaki là loài hồng được trồng phổ biến. Đây là cây ăn quả lâu
đời ở các tỉnh phía Bắc từ Thanh Hóa trở ra. Cây thường trồng ở vườn nhà, vườn
4

trang trại từ độ cao 500m trở xuống. Ở miền Nam, hồng mới được phát triển ở Đà
Lạt (Lâm Đồng). Các giống hồng đang được trồng hiện nay vô cùng phong phú như
hồng Hạc, hồng Lạng, hồng vuông, hồng trứng… [10]

Hình 1.1. Hình ảnh cây Hồng và một số bộ phận của cây
Chú thích:
1. Toàn cây
2. Cây mang quả
3. Cành mang lá
4. Cành mang hoa
5. Quả hồng
6. Tai hồng
5

1.2. Thành phần hóa học
Trên thế giới, nhiều hợp chất đã được phân lập từ các bộ phận khác nhau của
cây Hồng, chủ yếu thuộc các nhóm chất glycoside, flavonoid, tanin, saponin, sterol
và triterpenoid [20], [21].
Quả hồng chứa 79,6% nước, 0,8% protein, 0,2% chất béo, 0,4% chất
khoáng, 19% carbonhydrat, calci, phosphor, sắt, caroten, vitamin A, thiamin,
riboflavin, niacin và vitamin C. Đã tìm thấy trong quả các hợp chất như citrulin,
isodiospyrin, bisisodiospyrin, 2,3-butylen glycol, manitol, phytofluen, neodiospyrin,
zeaxanthin và lyeopin. Quả còn có tanin, pectin và polysaccharid. Tanin khi thủy
phân với kiềm thu được phloroglucinol và pyrocatechol [10]. Tanin có trong quả
hồng xanh khiến quả có vị rất chát, khi chín vị chát này hầu như mất đi, khi đó
lượng đường khoảng 13 – 19% dưới dạng glucose, saccharose và fructose [8].

astragalin, hyperin, isoquercitrin, rutin [29].
Cấu trúc của các flavonoid này được trình bày trong Hình 1.3.

7
Myricetin Quercetin Kaempferol

Astragalin Hyperin Isoquercitrin

Rutin
Hình 1.3. Cấu trúc hóa học của một số flavonoid chính trong lá cây Hồng

Ngoài ra, nhiều hợp chất khác cũng được phân lập từ lá Hồng: gamnamoside
[4-(3-hydroxypropyl)-2-methoxyphenol β-D-apiofuranosyl (1
→
6) β-D-
glucopyranoside] (2009) [26]; 8-C-[α-l-rhamnopyranosyl-(1→4)]-α-D-
glucopyranosylapigenin (2009) [13]; một số pectic polysaccharid (2003, 2004,
2010) [15], [16], [14]; kaempferol 3-O-beta-D-galactopyranoside (TR),
8

isorhamnetin 3-O-beta-D-glucopyranoside (IS) (2011) [28]; hyperoside, trifolin,
chrysontemin, quercetin-3-O-(200-O-β-alloyl-D-glucopyranoside) (QOG),
kaempferol-3-O-(200-O-β-alloyl-D-glucopyranoside) (KOG) (2011); lupeol, β-
sitosterol (2014) [11].
Tại Việt Nam, chưa có nghiên cứu nào được công bố về thành phần hóa học của
lá cây Hồng.
1.3. Tác dụng sinh học của vị thuốc lá cây Hồng

Trichophyton mentagrophytes
Aspergillus fumigates
Candida albicans
Geotricum candidum
Penicillium marneffei
Syncephalastrum racemosum

3,9
15,3
31,25
0,98
3,9
31,25
Amphotericin B
3,9
0,98
0,06
0,12
0,98
0,007
Vi khuẩn Gram (+):
Staphylococcus aureus
Staphylococcus epidermidis
Streptococcus pyogenes
Bacillus subtilis
Enterococcus faecalis

0,98
0,24
15,63
10

1.3.3. Tác dụng chống ung thư
Lupeol phân lập từ lá Hồng cho kết quả rõ ràng về khả năng chống ung thư
thử nghiệm trên tế bào MCF-7 và tế bào HeLa với nồng độ ức chế 50% (IC50) lần
lượt là 20,7 và 23,4 μg/mL.
Uvaol, α-amyrin và kampferol cũng cho thấy tác dụng kháng tế bào MCF-7
với IC50 tương ứng là 46,2, 47,1 và 43,4 μg/mL [11].
1.3.4. Tác dụng chống oxy hóa
Nghiên cứu flavonoid toàn phần chiết xuất từ lá Hồng trên tế bào MC3T3-E1
với chất chống oxy hóa chuẩn rutin cho thấy dịch chiết flavonoid toàn phần có tác
dụng chống oxy hóa mạnh, có khả năng dọn các superoxide anion và các gốc
hydroxyl tự do ở mức độ vượt trội so với rutin, khả năng dọn các gốc 1,1-diphenyl-
2-picrylhydrazyl kém hơn so với rutin [23].
Đỏ carmin
Glycerin
 Thuốc thử, dung môi, hóa chất sử dụng trong nghiên cứu thành phần hóa
học
- Dung môi: Ethanol, nước cất, n-hexan, chloroform, ethyl acetat, ether dầu hỏa,
toluen, aceton, acid formic, acid acetic…
- Hóa chất: NaOH, NH3 đặc, HCl, anhydrid acetic, H
2
SO
4
đặc, FeCl
3
, chì acetat,
bột Magnesi, gelatin, KOH…
12

- Thuốc thử: các thuốc thử thường dùng để định tính các nhóm chất hữu cơ trong
dược liệu như thuốc thử Mayer, Dragendorff, FeCl
3
5%, Lugol…
- Bản mỏng tráng sẵn silicagel GF
254
của hãng MERCK (Đức).
Các thuốc thử, dung môi, hóa chất đạt tiêu chuẩn hóa chất kiểm nghiệm, có xuất
xứ từ Trung Quốc.
 Thuốc thử, hóa chất sử dụng trong thử tác dụng kháng khuẩn
- Các chủng vi khuẩn kiểm định:
Vi khuẩn Gram (-):
Escherichia coli ATCC 25922
Proteus mirabilis BV 108

Lưỡi dao lam, phiến kính, lá kính …và các dụng cụ làm tiêu bản vi phẫu khác.
Thước đo đường kính vòng vô khuẩn.
Thuyền tán, cối, rây, bộ dụng cụ chiết hồi lưu (bình cầu, ống sinh hàn), bình chiết,
bình nón, cốc có mỏ và các dụng cụ thí nghiệm khác.
- Thiết bị:
Kính hiển vi LABOMED (Mỹ) Serial No. 070918442
Máy ảnh kỹ thuật số Sony Cybershot W370
Tủ sấy Memmert (Đức)
Máy soi đèn tử ngoại VILBER LOURMAT CN-6.T (Pháp) Serial No.12 101537
Máy soi đèn tử ngoại CAMAG (Thụy Sỹ) Serial No.t 022.9120
Tủ hốt UNI-LAB
Máy cất quay BÜCHI Rotavapor R-200 (Thụy Sỹ) Serial 803894010002
Cân phân tích Sartorius TE214S (Đức) serial 23808521
Cân kỹ thuật Precisa XB 320C (Thụy Sỹ)
Máy ly tâm K Universal Centrifuge PLC-012E (Đài Loan) serial 717902
Bể cách thủy HHS4 (Trung Quốc) Serial No. 211121618
Bếp điện Wisd Heating Mantle WHM12014 (Hàn Quốc) Serial No.0406452128
Máy đo độ ẩm Precisa XM120
Hệ thống máy chấm sắc ký CAMAG LINOMAT 5, máy chụp sắc ký CAMAG TLC
VISUALIZE (Thụy Sỹ) được kết nối với máy vi tính có cài đặt phần mềm
WinCATS, VideoScan.
Các dụng cụ, thiết bị thuộc bộ môn Dược học cổ truyền và một số bộ môn khác,
trường Đại học Dược Hà Nội.
2.2. Nội dung nghiên cứu
2.2.1. Nghiên cứu đặc điểm thực vật lá cây Hồng
14

 Mô tả đặc điểm hình thái lá nghiên cứu.
 Nghiên cứu đặc điểm vi phẫu và đặc điểm bột lá Hồng.
2.2.2. Nghiên cứu thành phần hóa học lá cây Hồng

Sử dụng dung môi ethanol 70%, chiết theo phương pháp ngâm ở nhiệt độ phòng
cứ 24h rút dịch chiết 1 lần, chiết 3 lần, gộp các dịch chiết, thu hồi dung môi thu
được cao lỏng nước. Loại tạp. Dùng cao lỏng này chiết lần lượt với các dung môi có
độ phân cực tăng dần: n-hexan, chloroform, ethyl acetat, sau đó bốc hơi dung môi
thu được cắn các phân đoạn tương ứng. Cân và tính hàm lượng các cắn.
 Định tính các phân đoạn dịch chiết bằng phản ứng hóa học và sắc ký lớp
mỏng
Định tính cắn các phân đoạn theo định hướng các nhóm chất chính và phân tích
bằng sắc ký lớp mỏng theo các phương pháp hóa thực vật thường quy [2], [3], [9],
[27].
2.3.3. Thử tác dụng kháng khuẩn
Tiến hành thử tác dụng kháng khuẩn của cao lỏng cồn toàn phần, 2 phân
đoạn dịch chiết chloroform và ethyl acetat đối với các chủng vi khuẩn Gram (+),
Gram (-) theo phương pháp khuếch tán trên môi trường thạch [5].
Nguyên tắc: Mẫu thử (có chứa hoạt chất thử) được đặt lên lớp thạch dinh
dưỡng đã cấy VSV kiểm định. Hoạt chất từ mẫu thử khuếch tán vào môi trường
thạch sẽ ức chế sự phát triển của VSV kiểm định tạo thành vòng vô khuẩn.
Đường kính vòng vô khuẩn được đo bằng thước Panmer có độ chính xác
0,02 mm, so sánh với mẫu chuẩn để đánh giá kết quả. Mỗi mẫu là 6 lần để lấy kết
quả trung bình. 16

Chương 3. THỰC NGHIỆM, KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN
3.1. Nghiên cứu đặc điểm thực vật của lá cây Hồng
3.1.1. Đặc điểm hình thái

8. Lông tiết
18

Phần phiến lá: Phiến lá có cấu tạo dị thể bất đối xứng. Biểu bì trên (1) và
biểu bì dưới (4) là một hàng tế bào hình chữ nhật, kích thước lớn hơn nhiều so với
tế bào biểu bì ở gân lá, mang lông che chở đơn bào (5). Dưới lớp biểu bì trên là mô
giậu (2) gồm một lớp tế bào dài xếp sát nhau, thẳng đứng vuông góc với bề mặt lá.
Mô khuyết (3) được cấu tạo bới các tế bào thành mỏng, kích thước không đều, sắp
xếp lộn xộn tạo thành các khoảng trống. (Hình 3.4) Hình 3.4. Ảnh chụp vi phẫu phiến lá Hồng

Chú thích:
1. Biểu bì trên
2. Mô giậu
3. Mô khuyết
4. Biểu bì dưới
5. Lông che chở đơn bào

Trích đoạn Chiết xuất, định tính và định lượng các phân đoạn

---