BỘ Y TẾ
TRƯỜNG ĐẠI HỌC Dược HÀ NỘI
NGUYỄN THỊ THU HẰNG
BƯỚC ĐẦU NGHIÊN c ứ u THÀNH PHẦN HOÁ
HỌC YÀ TÁC DỤNG KHÁNG KHUAN c ủ a c â y
HOÀNG LIÊN Ô RÔ MỌC Ở CAO BẰNG
(KHOÁ LUẬN TỐT NGHIỆP Dược s ĩ KHOÁ 1996-2001)
Người hướng dẫn : TS. PHÙNG HOÀ BÌNH
TS. CHU THỊ LỘC
Nơi thực hiện : BỘ MÔN DƯỢC HỌC cổ TRUYỀN
BỘ MÔN VI SINH HỌC
Thời gian thực hiện : 5/3/2001 - 22/5/2001
L C i U f O Hà Nội, tháng 5 năm 2001
LỜI CẢM ƠN
Để hoàn thành công trình tốt nghiệp này, tôi đã nhận được sự giúp đỡ
tận tình của các thầy cô và các bạn đồng nghiệp. Nhân dịp này, cho phép tôi
được chân thành cảm ơn thầy,cô:
TS. PHỪNG HOÀ BÌNH
TS. CHƯ THỊ LỘC
đã trực tiếp hướng dẫn, giúp đỡ tôi thực hiện đề tài.
Tôi cũng xin trân trọng cảm ơn các thầy, các cô ở Bộ môn Dược học cổ
truyền, Bộ môn Vi sinh học, Phòng nghiên cứu trung tâm, và các Phòng chức
năng trong trường đã giúp đỡ tôi trong quá trình thực hiện công trình tốt
nghiệp này,
Hà nội, ngày 20 tháng 5 năm 2001
' Sinh viên
Nguyễn Thị Thu Hằng
MỤC LỤC
t •
Trang
Phần I: Đặt vấn đề

1.3. Phương pháp nghiên cứu 10
2. Kết quả thực nghiệm

12
2.1. Đặc điểm thực vật
12
2.2. Nghiên cứu về hoá học 13
' 2.2.1. Định tính các nhóm thành phần hoá học trong
lá, thân và rễ cây Hoàng liên ô r ô

13
2.2.2. Nghiên cứu saponin 21
2.2.3. Nghiên cứu alcaloiđ 24
2.3. Thử tác dụng kháng khuẩn - kháng nấm
31
2.3.1. Chuẩn bị nguyên liệu và môi trường 31
2.3.2. Tiến hành 33
2.3.3. Kết quả 33
3. Bàn luận

36
Phần IV: Kết luận và đề xuất
37
1. Kết luận 37
1.1. Thực vật 37
1.2. Hoáhọc
.

ta hiện nay, Viện Dược liệu (Bộ Y tế) đã sưu tầm được 3 loài thuộc chi
Mahonia nhưng chưa nghiên cứu về thành phần hoá học và tác dụng sinh học
của nó.
Để góp phần tìm hiểu cây Hoàng liên ô rô mọc ở Cao Bằng, chúng tôi
thực hiện đề tài với những mục tiêu sau:
+ Sơ bộ xác định tên khoa học của mẫu nghiên cứu thu hái ở Cao Bằng.
+ Bước đầu nghiên cứu thành phần hoá học.
+ Nghiên cứu tác dụng kháng khuẩn - kháng nấm trên một số chủng vi
sinh vật.
1
Phần I I :
TỔNG QUAN
Cây Hoàng liên ô rô là một trong số những loài thuộc chi Mahonia, họ
Berberidaceae. Chi Mahonia gồm có rất nhiều loài, phân bố ở nhiều nơi trên
thế giới và được mô tả với những đặc điểm chung như sau:
1. fc>ẶC ĐIỂM THỰC VẬT:
Cây bụi hay gỗ nhỏ, cao 2 - 6 m [7, 8, 12, 13], thân cây có ruột màu
vàng. Cành không cổ gai. Lá màu xanh, mọc so le, lá kép hình lông chim lẻ,
V
có từ 3 - 21 lá chét tuỳ từng loài. Lá chét thưòng có hình trứng đầu nhọn sắc,
phía cuống tròn, mỗi bên có 3 - 8 răng cưa sắc, ngắn [7, 12, 13].
Cụm hoa tận cùng mọc thành bông phân nhánh ở gốc [7, 12, 13], nhiều
hoa, hoa có mầu vàng nhạt [8, 7, 12].
Mùa ra hoa là mùa xuân (tháng 1 - 3), mùa quả vào tháng 4-5. Quả
mọng màu xanh thẫm, hình cầu, trong quả chín chứa 2 -5 hạt. [7, 12]
2. PHÂN BỐ:
Các loài thuộc chi Mahonia có ở rất nhiều nơi trên thế giới.
Mahonia aquifolium Push; Mahonia repen (Lindl) G.Don có nhiều ở
vùng tây bắc Mỹ, Canada. [17]
M.bealei (Fort) Carr ; M.nepalensis D.C; M.fortunei (Fort) Carr có ở

Hàm lượng berberine (%)
Alcaloid và hợp chất khác
Rễ, vỏ
rễ
Thân,
vỏ thân
Lá
(1)
(2)
(3) (4)
(5)
(6)
1
M.acanthifolia
Don
0,50
jatroưhizine,oxyacanthine,
neprotine, palmatine.
2
M.annamica
Gagnep
(M.nepalensis DC)
corypalmine, neprotine,
palmatine, umbellatine,
tetrahyđro jatrorrhizine.
3
M.aquifolium
Push
palmatine, berbamine,
oxyacanthine, jatrorrhizine,

tetrahydro shobakunine •
9
M.leschenaultii
Takeda
1,02
jatrorrhizine, neprotine,
oxyacanthine, palmatine.
10
M.lomarrifolia
2,9
berbamine, jatrorrhizine,
isotetrandrine,
oxyberberine,
magnoílorine, shobakunine.
11
M.manipurensis
Takeda
jatrorrhizine, neprotine,
oxyacanthine.
12
M.morrisonensis 3,088
berbamine, jatrorrhizine,
isotetrandrine,
magnoflorine,
oxyberberine, shobakunine.
13
M.philipinensis
Takeda
Jatrorrhizine, shobakunine,
berbamine, oxyacanthine,

19
M.trifoliolata
Moric
1,33 -
3,22
0,45
Cấu tạo của một sốalcaloid cố khung protoberberine:
Protoberberine hay berbine alcaloid đều có khung dibenzo-quinolizine.
Chúng có nhóm thế ở vị trí 2, 3, 9, 10 hoặc 2, 3, 10, 11. Riêng các alcaloid có
cấu tạo kiểu corydalin còn có thêm nhóm thế methyl ở C|3. Căn cứ vào sự bão
hoà hydro ở nhân, người ta còn chia alcaloid thuộc khung này ra hai loại:
- Loại 1: có một nhân trong khung quinolizine được bão hoà hydro gọi là
protoberberin. Alcaloid thuộc loại này thường có mầu (vàng - đỏ)
- Loại 2: có 2 nhân trong khung quinolizine được bão hoà hydro, gọi là
tetrahydro protoberberine. Các alcaloid loại này thường không mầu.
Protoberberine Tetrahydroprotoberberin
Sự khác nhau giữa các nhóm thế trên khung protoberberine tạo thấnh
các chất khác nhau. Một số alcaloid protoberberine được trình bày ở bảng 2.
5
Bảng 2: Cấu tạo alcaloidprotoberberine.
Protoberberine
Nhóm thế ở vị trí nguyên tử c
1
2 3 9
10
11 13
Berberine
0
1
n

hemolytycus, Shigella dysenteriae, Shigella paradysenteriae, Neiseria
gonorrhoeae, Mycobacterium tuberculosis, Diplococcus pneumoniae,
Salmonella typhosa, Escherichia coli, Bacillus subtilis, Bacillus anthracis,
Pasteurella multicoda Tác dụng kháng khuẩn của berberine tương đương
với sulfathiazole, sulfamerazine, sulfamethyldiazine, sulfapyridine,
sulfaguanidine [1].
Palmatine hydroclorid có tác dụng ức chế đối với tụ cầu khuẩn
(Staphylococcus) và liên cầu khuẩn (Streptococcus) còn đối với các loại vi
khuẩn khác (lỵ, thương hàn) thì không thấy có kết quả rõ rệt. Tác dụng ức chế
vi khuẩn của Palmatine hydroclorid kém các loại kháng sinh thông thường.
- Tấc dụng kháng nâht gây bệnh: Dịch chiết từ cây Mahonia aquifolium có tác
dụng ức chế sự phát triển của một số nấm gây bệnh ngoài da [19].
6
- Tác dụng chống oxy hoá: Dịch chiết từ M.aquifolium và các alcaloid chính
có trong cây (berberine, berbamine, oxyacanthine) có tác dụng chống oxy hoá
[21,22].
- Tác dụng đối với đơn bào: Berberine trên ống kính với nồng độ 1:5000 và
trên chuột nhắt trắng đã được gây nhiễm amip, với liều lượng 50 mg/kg thể
trọng bằng đường uống có tác dụng ức chế sự sinh trưởng của amip [14].
- Tác dụng với tiêu hoá: Chất berberine gây tăng tạm thời trương lực và sự co
bóp của ruột [12].
- Đối với hô hấp: Hoạt chất berberine với liều lượng nhỏ kích thích sự hô hấp.
Với liều lượng lớn ức chế hô hấp làm tê liệt trung khu hô hấp trong khi tim
vẫn còn đập [14].
- Tác dụng đối với tim và tuần hoàn: Hoạt chất berberine với liều lượng nhỏ
có tác dụng kích thích tim, làm giãn động mạch vành. Với liều lượng lớn thì
gây hạ huyết áp.
Sản phẩm hydro hoá của berberine là tetrahydro berberine, chất này có tác
dụng ức chế hệ thống thần kinh trung ương và có tác dụng an thần [14].
V

M.aquifolium có khả năng chữa trị rất tốt đối với bệnh nấm. [19]
V
- Menet-Voneiff (1995) báo cáo rằng, cồn M.aquifolium 1% có hiệu quả trong
điều trị mụn trứng cá. Trong khoa kiểm tra lâm sàng tại trường Đại học Basel
15 bệnh nhân bị mụn trứng cá sau một thời gian sử dụng cồn M.aquifolium
1% đã giảm bót được chất nhờn trong da và có một kết quả rất khả quan [20].
- Augustin (1996) báo cáo rằng, 80% bệnh nhân sử dụng M.aquifolium không
có tác dụng phụ. [15]
- Quả của một số loài M.aquifolium, M.repen còn được dùng chế rượu, chế
mứt, chế nước giải khát [18].
8
b: hàm ẩm của dược liệu (%).
- Định lượng saponin toàn phần bằng phương pháp cân:
+ Nguyên tắc:
Chiết kiệt hoạt chất trong dược liệu bằng methanol, dịch chiết methanol
thu hồi còn cắn, thêm một lượng nước, đem lắc với n-butanol. Dịch n-butanol
cô đến cắn. Thu được saponin toàn phần.
Kết quả được tính theo công thức (A).
- Phân lập alcaloid:
+ Nguyên tắc:
Dùng phương pháp ngâm lạnh với cồn cao độ, chiết kiệt hoạt chất có
trong dược liệu, sau đó kết tinh bằng dd acid H ơ loãng và NaCl bão hoà. Tinh
chế bằng than hoạt. Kiểm tra độ tinh khiết của chất chiết được (chất B) bằng
SKLM. Nhận dạng chất B bằng SKLM (đối chiếu với chất chuẩn), phổ hồng
ngoại, tử ngoại, đo nhiệt độ nóng chảy.
1.3.2. Thử tác dụng kháng khuẩn, kháng nấm:_
Thử tác dụng kháng khuẩn, kháng nấm theo phương pháp khuếch tán
trên thạch, khả năng ức chế vi sinh vật được đánh giá bằng đường kính vòng
ức chế các vi sinh vật kiểm định của các dung dịch thử.
I

acid, chia đểu vào 3 ống nghiệm, nhỏ vào từng ống nghiệm mỗi ống 1 -2 giọt
thuốc thử.
Ống 1: TT Mayer - Phản ứng dương tính khi xuất hiện tủa trắng.
Ống 2: TT Bouchardat - Phản ứng dương tính khi xuất hiện tủa nâu.
Ông 3: TT Dragendorff - Phản ứng dương tính khi xuất hiện tủa đỏ gạch.
> Định tính berberine:
Lấy khoảng 15 g bột dược liệu chiết kiệt hoạt chất bằng 45 - 50 mi cồn
I
90°, bốc hơi còn khoảng 15 ml dịch chiết. Dịch chiết này được dùng làm các
phản ứng hoá học.
* Phản ứng xác định alcaloid thuộc nhân benzyltetrahydroisoquinoleine:
- 1 ml dịch chiết, thêm 0,5 ml H2S04 đặc, thêm dần vào thành ống 1 ml
nước Brôm. Phản ứng dương tính khi giữa hai lớp tiếp xúc xuất hiện vòng đỏ.
- 1 ml dịch chiết, thêm 1 ml H2S04 đặc, thêm dần vào thành ống 1 ml
NH4OH 20%, Phản ứng dương tính khi lớp tiếp xúc ở giữa acid H2S04 và
NH4OH có vòng đỏ.
13
* Phản ứng kết tinh muối alcaloid bằng acid HCl và acid H N03:
- 1 giọt dịch chiết bốc hơi trên phiến kính, thêm 1 giọt HC1 đặc, để yên
trong 30 phút. Phản ứng dương tính khi soi kính hiển vi thấy từng bó kết tinh
hình kim màu vàng.
- 1 giọt dịch chiết bốc hơi trên phiến kính, thêm 1 giọt acid HNO3 đặc, để
yên trong 30 phút. Phản ứng dương tính khi soi kính hiển vi thấy tinh thể hình
chấm vàng.
* Phản ứng phát quang:
Bột dược liệu, dịch chiết cồn và tinh thể đều phát quang màu vàng sáng
dưới ánh sáng đèn tử ngoại.
2.2.1.2 Định tính glycosid tim:
Cho khoảng 10 g bột dược liệu vào một bình nón dung tích 250 ml,
thêm 100 ml nước cất| ngâm ở nhiệt độ phòng trong 24h. Gạn dịch lọc vào cốc

thuỷ 15 phút. Lọc nóng, cất thu hồi dung môi dưới áp suất giảm còn khoảng
10 ml. Dịch này để làm các phản ứng.
* Định tính Flavonoid:
+ Phẩn ứng Cyanidin: Cho 1 ml dịch chiết vào trong 1 ống nghiệm, thêm 1
ít bột magiê kim loại (khoảng 10 mg), cho vào ống nghiệm 2 -3 giọt HC1 đặc.
Phản ứng dương tính khi dd có màu đỏ.
+ Phản ứng với hơi amoniac đặc: Nhỏ 1 giọt dd chiết lên giấy lọc, để khô
tự nhiên rồi hơ lên miệng lọ amoniac đặc. Phản ứng dương tính khi có màu
vàng đậm lên.
+ Phản ứng với FeCl3: Lấy 1 ml cho vào ống nghiệm, thêm 2 giọt dd FeCl3
5%. Phản ứng dương tính khi xuất hiện tủa xanh đen.
* Định tính Coumarin:
15
+ Phản ứng mở đóng vòng lacton: Cho vào 2 ống nghiệm mõi ống 1 ml
dịch chiết
Ống 1: thêm 0,5 ml dd NaOH 10%.
Ống 2: để nguyên.
Đun cả hai ống nghiệm đến sôi, để nguội. Thêm vào cả hai ống nghiệm
mỗi Ống 2 ml nước cất. Nếu ống 1 trong, ống 2 đục, thêm HC1 vào ống 1 đục
như Ống 2 thì phản ứng dương tính.
+ Phản ứng diazo hoá: Cho vào ống nghiệm 1 ml dd chiết, thêm vào đó 2
ml dd NaOH 10 %. Đun cách thuỷ đến sôi rồi để nguội. Thêm vào ống vài
giọt thuốc thử diazo. Phản ứng dương tính khi dd xuất hiện màu đỏ tím.
+ Phẩn ứng vi thăng hoa: Cho vào trong 1 nắp chai bằng nhôm một ít bột
dược liệu, đun nhẹ để bay hơi hết nước, sau đó đậy nút bằng một phiến kính,
trên có một ít bông thấm nước. Đun nhẹ trong 5 phút, sau đó lấy phiến kính ra
để nguội. Nhỏ 1 giọt KI 10% lên phiến kính. Phản ứng dương tính khi soi dưới
kính hiển vi thấy có tinh thể màu nâu hoặc tím.
2.2.1.4 Định tính Saponin:
- Hiện tượng tạo bọt: Cho vào 2 ống nghiệm 0,lg dược liệu, thêm 5,0 ml nước.

+ Phản ứng Libermann-Burchard: Lấy ống nghiệm trên hoà tan vào 1 ml
anhydridacetic đã đun cách thuỷ cho nóng. Thêm 2 giọt H2S04 đặc. Phản ứng
dương tính khi dd trong ống có màu xanh lơ hay màu hồng, cam, đỏ.
+ Phản ứng Carr-Price: (thuốc thử antimontriclorid SbCl3 bão hoà trong
cloroform): Lấy 1 ml cloroform cho vào ống nghiệm trên, lắc cho tan cắn,
thêm 0,5 ml thuốc thử antimontriclorid. Phản ứng dương tính khi thấy màu
hồng hoặc đỏ.
+ Phản ứng Salkoxvski: Lấy 1 ml cloroform hoà tan cắn trong ống nghiệm
trên.Thêm 1 ml H2S04 đậm đặc. Phản ứng dương tính khi thấy xuất hiện màu
đỏ.
2.2.1.5 Định tính Anthraglycosid:
- Phản ứng Borntraeger: Cân 2g dược liệu cho vào bình nón dung tích 50 ml,
thêm 15 ml dd H2S04 10%, đun cách thuỷ 15 phút. Lọc, để nguội, cho vào
17
bình gạn, lắc với 10 ml etherethylic, gạn lấy lớp ether, thêm 8 ml dd NaOH
10% vào lớp ether, lắc. Phản ứng dương tính khi lớp kiềm xuất hiện màu đỏ.
- Phản ứng vi thăng hoa: Cho vào nắp nhôm 1 ít dược liệu. Hơ nhẹ trên
nguồn nhiệt đến khi bay hơi hết nước trong dược liệu. Đặt lên trên miệng nắp
nhôm một lam kính. Trên lam kính đó có để 1 miếng bông có tẩm nước lạnh.
Sau một thời gian (5-10 phút) lấy lam kính ra, để nguội. Phản ứng dương tính
khi soi dưới kinh hiển vi thấy xuất hiện tinh thể hình kim màu vàng.
2.2.1.6 Định tính Tanin:
Cho vào Ống nghiệm lg dược liệu, thêm 10 ml nước cất, đun sôi trực
tiếp, lọc, dịch lọc đem tiến hành làm các phản ứng.
* Phản ứng với FeCl3: Lấy 1 ml dịch lọc cho vào ống nghiệm, thêm vài giọt
dd FeCl3 5%. Phản ứng dương tính khi dd xuất hiện tủa xanh đen.
* Phản ứng với dd gelatin: Lấy 1 ml dịch lọc cho vào ống nghiệm, thêm vài
giọt dd gelatin 1%. Phản ứng dương tính khi xuất hiện tủa bông trắng.
2.2.1.7 Định tính acid hữu cơ:
Lấy lg bột dược liệu, thêm 5 ml nước cất, đun sôi trong vài phút, lọc.

Bảng 3 : Kết quả định tính thành phần hoá học của cây Hoàng liền ô rô.
TT
Nhóm chất
Phản ứng định tính
Kết quả
Đánh giá sơ bô
Rễ Thân Lá
Alcaloid
TT Mayer
+ + +
TT Dragendorff + + +
Có
1
TT Bouchardat + + +
Nước Brôm +
Trong thân có
berberine
Berberine
Dd NH4OH 20% +
Phản ứng kết tinh muối +
Phản ứng Liebermann
+ + +
2
Glycosid
Phản ứng Bal jet
- - -
Không
tim
Phản ứng Legal
-

+ +
+
5
Saponin
Phản ứng phân biệt
saponin steroid
Saponin triterpenoid
Có saponin
Phản ứng Salkowski
+ + +
steroid
Phản ứng Carr-Price
+ + +
p/ứ Libermann-
Burchard
+
+
+
6
Tanin
Phản ứng với FeCl,
- -
+ Rễ, thân không
Phản ứng với getalin
1%
- - +
có tanin
Lá có tanin
7
Anthra-

+ + Có
12
Acid amin
Với TT Ninhydrin 3%
+ +
+
Có
Ghi chú: (+): phản ứng dương tính. (-): phản ứng âm tính. (TT): thuốc thử.
20
22
2.2.22 Định tính bằng sắc kỷ lớp mỏng:
Bản mỏng silicagenG kích thước 3 x 9 cm được hoạt hoá ở 110°c trong
10 phút.
Dịch chấm sắc ký: hoà tan 5 mg cắn saponin trong methanol.
Hệ dung môi khai triển: n - butanol: ethanol: nước [4:1:4],
Thuốc thử hiện màu: dd vanilin 1% trong cồn tuyệt đối và acid H2S04
đặc. Sau khi phun thuốc thử đem sấy khô bản mỏng ở 110°c trong 5 phút.
Kết quả: Trên sắc ký lớp mỏng xuất hiện 4 vết có màu sắc và Rf được ghi ở
bảng 4, hình 1:
Bảng 4: Kết quả phân tích saponin bằng SKLM.
Thứ tự vết
Rf
Màu khi phun thuốc thử
1
0,21
Xanh lục
2
0,39
Xanh lục
3