Đồ án tốt nghiệp
CHƯƠNG 1
MỞ ĐẦU
1.1. Đặt vấn đề
Động vật giáp xác ở nước ta là khá phong phú, một số trở nên quen thuộc và gắn
liền với cuộc sống của chúng ta như Tôm,Cua, Ghẹ, Ba khía,…đây là nguồn thực
phẩm nhiều chất dinh dưỡng, cung cấp nhiều năng lượng và khoáng chất cần thiết cho
cơ thể.
Tuy nhiên, do hàm lượng vỏ của nguồn nguyên liệu này là khá lớn nên khi thải ra
ngoài môi trường sẽ gây ô nhiễm môi trường do nó rất khó phân huỷ. Bên cạnh đó, qua
quá trình nghiên cứu, người ta thấy rằng trong thành phần vỏ của các loài giáp xác này
có chứa nhiều chất khoáng, protein, Chitin,…mà đặc biệt là Chitin - một vật liệu rất
quý, đang được cả thế giới quan tâm và nghiên cứu.
Bởi vậy chúng ta phải góp phần giải quyết ô nhiễm môi trường mà lại tận dụng
được lớp vỏ của các loài giáp xác này làm thực phẩm chức năng. Vì lí do này mà tôi
được giao nghiên cứu đề tài: “ Nghiên cứu biến đổi sinh học Cua Đồng bằng công nghệ
vi sinh để chế biến thực phẩm không phế thải ”.
1.2. Mục đích đề tài
 Nâng cao giá trị kinh tế của Cua Đồng.
 Có thể ăn Cua Đồng nguyên con vì lợi ích về dinh dưỡng, kinh tế và môi
trường.
1.3. Nội dung đề tài
- Nuôi sinh khối các vi sinh vật thí nghiệm.
- Thu nhận Chitin từ vỏ Cua.
- Làm mềm vỏ Cua bằng các phương pháp hóa và vi sinh vật học.
- Phân tích sinh hóa các nguyên liệu tham gia và được tạo thành trong thí
nghiệm.
- Chế biến thực phẩm từ Cua Đồng đã được làm mềm vỏ.
CHƯƠNG 2
TỔNG QUAN TÀI LIỆU
GVHD : TS. Lê Chiến Phương SVTH : Đồng Thị Thuận

GVHD : TS. Lê Chiến Phương SVTH : Đồng Thị Thuận
2
Đồ án tốt nghiệp
Potamiscus mieni và có thể một số loài khác nữa như đã phát hiện ở vùng Tây Bắc (Lai
Châu).
2.1.4. Thành phần dinh dưỡng của Cua Đồng
Bảng 2.1. Thành phần dinh dưỡng của Cua Đồng
Thành phần dinh dưỡng trong 100 g thực phẩm ăn được
Nguyên
liệu
Năng
lượng
Thành phần chính Muối khoáng
Nước Protein Lipid Glucid Tro Calci Phospho Sắt
Kcal g Mg
Cua
Đồng
103 72,2 17,5 0,6 7,0 2,7 141 191 3,8
2.2. Khái quát về Trichoderma harzianum sp.
2.2.1.Đặc điểm sinh học của nấm T. harzianum sp.
2.2.1.1. Vị trí phân loại [10,13]
Trichoderma là một trong những nhóm vi nấm gây nhiều khó khăn trong việc
phân loại do các đặc điểm cần thiết cho việc phân loại vẫn còn chưa được biết đầy đủ.
Theo hai nhà khoa học Elisa Espossito và Manuela da Silva, Trichoderma thuộc
loại họ Hypocreaceae, lớp nấm túi Ascomycetes, được phân làm năm nhóm:
Trichoderma, Longibrachiatum, Satutnisporum, Pachybarium và Hypocreanum.
Theo Rifai (1969), Barnett và Hunter (1972), Trichoderma được phân loại như
sau:
Giới: Nấm
Ngành: Ascomycota

rất chậm và yếu .
GVHD : TS. Lê Chiến Phương SVTH : Đồng Thị Thuận
4
Đồ án tốt nghiệp
Giá trị a
w

nhỏ nhất là 0,91 ở 25 °C.
T.harzianum tổng hợp enzyme chitinase và các chất kháng sinh (Trichodermin,
glyotosin…).
Vấn đề độc tố của T.harzianum chưa được biết đến.
2.2.2. Các nghiên cứu ứng dụng vi nấm Trichoderma
2.2.2.1. Bảo vệ thực vật [10]
Một trong những nghiên cứu ứng dụng T.harzianum được quan tâm nhiều nhất
đó là khả năng kiểm soát sinh học và khả năng kháng một số nấm gây bệnh quan
trọng ở thực vật. Giống Trichoderma này tấn công các nấm bệnh bằng cách tiết ra các
enzyme phân giải chitin. Các nhà khoa học đã nghiên cứu và đưa ra những kết quả
thuyết phục về hoạt động kháng nấm Sclerotium rolfsii (nấm bệnh ký sinh trên cây
thuốc lá) của T.harzianum qua việc tổng hợp các enzyme chitinase.
Bên cạnh tác dụng kháng nấm, T.harzianum còn có khả năng ức chế các tác
nhân gây bệnh trên cây trồng. Trichoderma là một thành phần đặc hiệu trong
Trochodex – một chế phẩm dùng để chống lại sự mục rữa của táo sau thu hoạch. Mặt
khác, T.harzianum còn được kết hợp với polysporum trong việc sản xuất Binabt - chế
phẩm được dùng trong chữa trị các vết thương bị nhiễm trùng và thối rữa ở rễ.
Backman, Redriguer - Kaban (1975) sử dụng bào tử nấm T.harzianum ngăn
chặn bệnh do nấm Sclerotium rolfsii, Rhizoctonia, Pythium sp. ,bảo vệ cây họ đậu và
củ cải tránh được bệnh chết ẻo. Theo Emxep V.T (1989) nấm Trichoderma không chỉ
tiêu diệt nhiều loài nấm gây bệnh cây trồng trong đất mà còn có tác dụng cải thiện cấu
trúc và thành phần hóa học của đất, đẩy mạnh sự phát triển của các vi khuẩn nốt sần
cố định đạm có ích trong đất và kích thích sinh trưởng, phát triển của cây trồng. Một

sinh không những cung cấp một nguồn phân bón an toàn, hiệu quả mà còn giúp kiềm
chế các bệnh gây hại cây trồng và tạo được những ổ sinh thái phòng bệnh lâu dài
trong tự nhiên.
2.2.2.3.Trong lĩnh vực xử lý môi trường [10]
T.harzianum có khả năng phân hủy các chất gây ô nhiễm trong đất rừng.
T.harzianum có khả năng làm giảm bớt sự tập trung của các hợp chất tự do 2,4,6
– Trichlorophenol ; 4,5 – dichloroguaiacol và cả AOX trong môi trường có chứa muối
khoáng. Loài nấm này cũng có khả năng dehalogen hóa tetrachloroguaiacol tự do
trong môi trường khoáng mặn.
GVHD : TS. Lê Chiến Phương SVTH : Đồng Thị Thuận
6
Đồ án tốt nghiệp
T.harzianum đã chứng tỏ khả năng phân giải hiệu quả của chúng trên ciliatin,
glycophosphate, và amino methylphosphonic ( 3-methoxyphenyl).
T.harzianum 2023 (khoa sinh lý thực vật trường Đại học California) có thể phân
giải DDT , endosulfan, pentachloronitrophenol và pentachlorophenol.
T.harzianum CCT-4790 phân giải 60% thuốc diệt cỏ Duirion trong đất trong 24
giờ, đây là một tiềm năng tốt để xử lý sinh học các hóa chất ô nhiễm trong đất và
trong đầm lầy.
2.2.2.4. Trong các lĩnh vực khác [12, 26 ]
Trichoderma sp. là nguồn sản xuất hiệu quả các hệ enzyme cellulase ngoại bào.
Các enzyme này được sử dụng rất nhiều trong công nghiệp dệt, do chúng có thể làm
cho vải bông mềm và trắng hơn.
L.Grange và cộng sự đã biểu hiện gen β- xylanase ( XYN 2) của T.reesei ở
Saccharomyces cerevisiae để bổ sung vào thức ăn của gia cầm, tăng khả năng tiêu hóa
hemicellululose trong lúa mạch và các cây lương thực khác.
2.3 . Tổng quan về Chitin
2.3.1. Lịch sử nghiên cứu Chitin [9]
Năm 1811 Chitin được mô tả lần đầu tiên bởi Braconnot. Trong quá trình nghiên
cứu trên một loài nấm Agaricus volvaceus và một vài loài nấm khác với dung dịch

Dán 35%
Bọ cánh cứng 37%
Nhện 38%
Bò cạp 30%
Sâu 20-38%
Nấm 5-20%
Tôm 33%
Cua 70%
Mực 3-20%
2.3.3. Cấu trúc phân tử và tính chất của Chitin
• Cấu trúc phân tử: [23, 27]
Qua nghiên cứu về sự thủy phân Chitin bằng enzyme hay HCl đậm đặc thì người
ta thấy rằng Chitin là một polymer được tạo thành từ các đơn vị N-acetyl-(-D-
Glucosamin liên kết với nhau bởi liên kết 1-4 glucoside).
GVHD : TS. Lê Chiến Phương SVTH : Đồng Thị Thuận
8
Đồ án tốt nghiệp

Hình 2.2. Cấu trúc Chitin
Chitin có cấu trúc lạp thể gồm 3 dạng như : α, β và γ , sự khác nhau này thể hiện
ở sự sắp xếp các chuỗi . Ở chuỗi α – chitin các chuỗi xuôi và ngược xen kẽ nhau. Tuy
nhiên, chúng có một cặp xếp cùng chiều. Ở chuỗi β – chitin các chuỗi sắp xếp theo
một chiều nhất định, còn ở chuỗi γ – chitin có các cặp chuỗi xếp cùng chiều so le với
một chuỗi ngược chiều trong cấu trúc.
Hình 2.3. Cấu trúc không gian của Chitin
• Tính chất của Chitin [8 ]
Chitin ở thể rắn có cấu trúc bền vững nhờ các liên kết hydro trong và giữa các
mạch. Chitin không tan trong nước, trong dung dịch acid và kiềm loãng, trong cồn và
GVHD : TS. Lê Chiến Phương SVTH : Đồng Thị Thuận
9

COOH
Chitin
Tẩy, khử màu
CaCO
3
protein
Nấm, tảo
10
Đồ án tốt nghiệp
Hình 2.4. Quy trình tách chiết Chitin
2.3.5. Thành phần của Chitin trong một số loài
Bảng 2.2. Thành phần Chitin ở một số loài
Thành phần (%) Vỏ cua Vỏ tôm Nấm
Chitin 25-30 30-40 15-40
Protein 15 30 5-10
CaCO
3
55 30
*
Lipid 2-5 5-10 5-10
( * ): chưa rõ.
2.4. Đại cương về hệ enzyme Chitinase
2.4.1. Định nghĩa
Chitinase [ Poly Beta 1-4 – (2-acetalmido-2-deoxy )-D glucoside
glucanohydrolase ] thuộc nhóm enzyme thủy phân (hydrolase), là enzyme thủy phân
Chitin thành chitobiose hay chitotriose qua việc xúc tác sự thủy giải liên kết 1,4
glucoside giữa C
1
và C
4

GVHD : TS. Lê Chiến Phương SVTH : Đồng Thị Thuận
12
Đồ án tốt nghiệp
Nhóm II : là những đồng phân enzyme trong phân tử chỉ có tâm xúc tác, thiếu
đoạn giàu cystein ở đầu N và peptid nhận biết ở đầu C, có trình tự amino acid tương
tự chitinase ở nhóm I. Chitinase nhóm II có ở thực vật, nấm, và vi khuẩn, chúng được
cảm ứng bởi các tác nhân bên ngoài .
Nhóm III : trình tự amino acid hoàn toàn khác với Chitinase nhóm I và II
Nhóm IV : là những đồng phân enzyme chủ yếu có ở lá cây hai lá mầm, 41-47%
trình tự amino acid ở tâm xúc tác của chúng tương tự như chitinase nhóm I, phân tử
cũng có đoạn giàu cystein nhưng kích thước phân tử nhỏ hơn đáng kể so với chitinase
nhóm I.
Nhóm V: dựa trên những dữ liệu về trình tự, người ta nhận thấy vùng gắn Chitin
( vùng giàu cystein) có thể đã giảm đi nhiều lần trong quá trình tiến hóa ở thực
vật bậc cao.
2.4.2.3. Dựa vào phản ứng phân cắt [14]
Enzyme phân giải chitin bao gồm : endochitinase, chitin 1-4 – β –
chitobiosidase, N-acetyl –β – D-glucosaminidase (exochitinase) và chitobiase.
Endochitinase: là enzyme phân cắt nội mạch Chitin một cách ngẫu nhiên tạo các
đoạn olygosaccharides, đã được nghiên cứu từ dịch chiết môi trường nuối cấy nấm
mốc T.harzianum ( 2 loại endochitinase : M
1
= 36kDa, pI
1
= 5,3 (± 0,2) và M
2
=
40kDa, pI
2
= 3,9) , Gliocladium virens (M = 41kDa, pI = 7,8).

GVHD : TS. Lê Chiến Phương SVTH : Đồng Thị Thuận
14
Đồ án tốt nghiệp
Giá trị pH tối thích (pH
op
) của hệ enzyme Chitinase từ 4-9 đối với các enzyme
Chitinase ở thực vật bậc cao và tảo; hệ enzyme Chitinase ở động vật là 4,8- 7,5 và ở
vi sinh vật là 3,5- 8,0.
Theo các nhà khoa học, pH
op
của enzyme Chitinase có thể có sự phụ thuộc vào
cơ chất được sử dụng. Đa số các enzyme Chitinase đã được nghiên cứu có pH
op
khoảng 5,0.
2.4.4. Cơ chế tác động của hệ enzyme Chitinase [11, 16]
Endochitinase phân cắt ngẫu nhiên trong nội mạch của Chitin và chitooligomer,
sản phẩm tạo thành là một hỗn hợp các polymer có trọng lượng phân tử khác nhau,
nhưng chiếm đa số là các diacetylchitobiose (GlcNAc)
2
do hoạt tính endochitinase
không thể phân cắt thêm được nữa.

Hình 2.8. Cơ chế hoạt động của enzyme Chitinase ở Trichoderma.
Chitin 1,4-chitobiosidase phân cắt chitin và chitooligomer ở mức trùng hợp lớn
hơn hay bằng 3 [(GlcNAc)
n
với n ≥ 3] từ đầu không khử và chỉ phóng thích
diacetylchitobiose (GlcNAc)
2
.

Độ quay cực của glucosamin : [α]
20
D
= 72,5
GVHD : TS. Lê Chiến Phương SVTH : Đồng Thị Thuận
16
Đồ án tốt nghiệp
Glucosamin là chất có nhiều ứng dụng trong y học. Nó đóng vai trò sinh lý sinh
hóa trong cơ thể người, tham gia vào chức năng giải độc của gan và thận, chống viêm
gan, chống dị ứng và chống thiếu oxi trong máu.
Glucosamin là nguyên liệu chủ yếu để tổng hợp các chất nhờn và sụn ở các khớp
cơ thể. Khi các khớp bị tổn thương, nó là nguyên liệu để cơ thể sản xuất các chất cần
thiết như: collagen, proteoglycan, glucosaminglycan để phục hồi sụn khớp và tái cung
cấp chất nhờn giúp các khớp linh động trở lại.
Ngoài ra, Glucosamin còn có tác dụng chống ung thư, chữa tổn thương dường
ruột, dạ dày.
2.6. Calci
Calci (tên La Tinh : Calcium) là nguyên tố hóa học ký hiệu Ca, số thứ tự 20 trong
bảng tuần hoàn. Nó là một kim loại kiềm thổ.
2.6.1. Đặc tính vật lý [18]
Calci là một kim loại màu xám bạc, mềm được điều chế bằng phương pháp điện
phân từ fluorua calci. Nó cháy với ngọn lửa màu vàng - đỏ và tạo thành một lớp nitrua
che phủ có màu trắng khi để ngoài không khí. Nó có phản ứng với nước tạo hydro và
hydroxyd calci.
2.6.2. Calci trong cơ thể người [19]
Calci là chất khoáng thiết yếu cho hoạt động bình thường của rất nhiều quá trình
nội và ngoại bào khác nhau bao gồm co cơ, dẫn truyền thần kinh, phóng thích hormon
và đông máu. Ngoài ra, ion Calci còn đóng vai trò then chốt trong hệ thống truyền tin
nội bào và liên quan đến quá trình điều hòa hoạt động của nhiều enzyme khác nhau.
Mặc dù có vai trò nội bào rất quan trọng nhưng khoảng 99% lượng Calci của cơ

Lactobacillus, Leuconostoc.
2.7.2. Đặc điểm
Hình thái : vi khuẩn thường có 2 dạng :
GVHD : TS. Lê Chiến Phương SVTH : Đồng Thị Thuận
18
Đồ án tốt nghiệp
Hình cầu : Diplococcus (2 hình cầu), Tetracoccus (4 hình cầu), Streptococcus
( hình cầu chuỗi).
Hình que : hình que đơn và hình que chuỗi.
Sinh lý : tất cả Gram dương, không sinh bào tử, hầu hết không di động, không
tạo màng nhầy, kỵ khí bắt buộc, thu nhận năng lượng nhờ thải ra acid lactic và phân
giải hydratcacbon. Khác với vi khuẩn đường ruột, vi khuẩn lactic là loại lên men bắt
buộc, không chứa cytochrome và catalase.
Chúng có nhu cầu về mặt dinh dưỡng khá phức tạp. Ngoài glucose, NH, chúng
còn đòi hỏi hàng loạt vitamin: lactoflavin, thiamin, acid pantothenic, acid nicotinic,
acid folic, biotin… và các acid amin. Vì thế thường nuôi cấy chúng trên môi trường có
bổ sung cao nấm men, cao thịt, nước chiết cà chua.
Căn cứ vào kiểu lên men, người ta chia vi khuẩn lactic thành 2 nhóm :
+ Vi khuẩn lactic đồng hình : sản phẩm chính của lên men lactic đồng hình là
acid lactic.
+ Vi khuẩn lactic dị hình : sản phẩm cuối đa dạng như acid lactic, ethanol, acid
acetic, CO
2
…
Tùy thuộc vào nhiệt độ lên men và tăng trưởng tối ưu, vi khuẩn lactic được chia
thành : vi khuẩn ưa nhiệt và vi khuẩn ưa nhiệt vừa.
pH cũng có ảnh hưởng đến sự phát triển của vi khuẩn lactic. pH tối ưu cho sự
phát triển của vi khuẩn lactic là từ 5,5- 6,4. Sự lên men bị ức chế mạnh ở pH =5 và
dưới 4,5. Trong quá trình trao đổi chất, vi khuẩn lactic luôn tiết ra acid lactic làm pH
môi trường giảm, đến một lúc nào đó chính acid lactic nó tiết ra gây ức chế sự sinh

đó là aldolase và triosephosphate isomerase.
Giống vi khuẩn chủ yếu lên men lactic dị hình là Leuconostoc và giống phụ là
Betabacterium.
Lên men lactic dị hình ít có ý nghĩa trong công nghiệp. Qúa trình lên men
tạo thành nhiều sản phẩm cuối nên việc tách và cô lập các sản phẩm giống nhau
rất tốn kém. Tuy nhiên, quá trình lên men này cũng có vai trò rất quan trọng trong việc
chế biến một số loại thực phẩm. Vi khuẩn lactic lên men dị hình có thể làm cho các sản
phẩm có mùi vị thơm ngon và đặc trưng hơn.
2.7.4. Vài đại diện của vi khuẩn lactic
Giống Streptococcus
Hình cầu hay oval, kích thước từ 0,5-2
µ
m ( biến đổi theo loài). Hiện diện ở
dạng cầu đôi hoặc chuỗi khi phát triển trên môi trường lỏng, Gram dương, không di
GVHD : TS. Lê Chiến Phương SVTH : Đồng Thị Thuận
20
Đồ án tốt nghiệp
động hoặc hiếm khi di động. Không tạo bào tử, không có benzidine, không có catalase,
kị khí tùy ý.
Yêu cầu dinh dưỡng phức tạp, bao gồm : amino acid, purines, pyrimidines,
peptides, vitamin và đôi khi các acid béo.
Nhiệt độ tối thích khoảng 37
0
C, giới hạn tối đa và tối thiểu thay đổi tùy loài từ 25-
45
0
C, tỷ lệ G + C biến đổi từ 33-42
0
C.
- Đại diện :

C, nhiệt độ thích hợp là 30-42
0
C.
pH thích hợp là 5,5-5,8.
2.7.5. Ứng dụng
Ứng dụng trong công nghiệp chế biến sữa để sản xuất sữa chua, kefir, phomai,
koumis…
Ứng dụng trong muối chua rau quả : bắp cải muối, dưa chuột muối,…
GVHD : TS. Lê Chiến Phương SVTH : Đồng Thị Thuận
21
Đồ án tốt nghiệp
Ứng dụng trong ủ chua thức ăn gia súc dùng trong chăn nuôi.
Ứng dụng trong công nghiệp sản xuất acid lactic và các loại muối lactate : acid
lactic được ứng dụng trong ngành thuộc da, dệt, công nghiệp tổng hợp chất dẻo, công
nghiệp thực phẩm.
2.8. Acid acetic [3]
Công thức phân tử: CH
3
COOH
Khối lượng phân tử: M = 60,05
Nhiệt độ nóng chảy: T
nc
= 16,6°C
Nhiệt độ sôi : T
s
= 118,1 °C
Acid acetic hay còn được gọi là giấm là sản phẩm của quá trình lên men từ ngũ
cốc, đường hoặc oxi hóa rượu. Trong giấm có nhiều amino acid : 18 loại amino acid tự
do đều có trong giấm, trong đó có 8 loại aminoacid mà cơ thể con người không thể
tổng hợp được, cần phải do thức ăn cung cấp. Aminoacid trong giấm có từ sự phân giải

kinh, thúc đẩy cơ quan tiêu hóa, bài tiết số lượng lớn dịch tiêu hóa, giúp tăng cường
công năng tiêu hóa của dạ dày. Đồng thời, còn có thể khiến cho các loại muối vô cơ
( canxi, sắt , phospho trong thức ăn hòa tan càng nhiều, có thể phòng các loại vitamin C
bị phá hủy). Điều đó không những nâng cao giá trị dinh dưỡng của thức ăn mà còn có
lợi cho tiêu hóa và hấp thụ.
o Phòng suy lão: giấm có thể hạn chế và giảm sự hình thành oxy hóa chất
mỡ trong cơ thể, có tác dụng làm chậm sự suy lão.
o Phòng cao huyết áp sơ cứng động mạch: giấm có tác dụng hỗ trợ rất tốt
đối với việc điều trị bệnh cao huyết áp và sơ vữa động mạch.
o Tăng cường công năng bài tiết của thận, đề phòng sự hình thành sỏi trong
cơ thể: dịch nước tiểu thường có tính acid, dễ khiến cho các loại muối trong nước tiểu
kết thành sỏi. Giấm có thể làm cho dịch nước tiểu chuyển thành kiềm tính, do đó giảm
được sự hình thành sỏi.
o Phòng trị béo phì : theo nghiên cứu, trong giấm chứa amino acid, ngoài
thúc đẩy mỡ quá nhiều trong cơ thể chuyển biến thành năng lượng, còn có thể giúp tiến
hành thuận lợi quá trình trao đổi chất của các chất dinh dưỡng đường và protein trong
cơ thể do đó có tác dụng giảm béo rất tốt.
o Bảo vệ làn da, làm đẹp: giấm không những có tác dụng hạn chế thâm đen
trên da, giảm được vết đồi mồi tuổi già mà còn tăng tuần hoàn huyết dịch của da, loại
trừ tế bào già chết, thu nhỏ lỗ chân lông, làm cho da trơn bóng.
o Làm tỉnh rượu : acid acetic cùng với ethanol phản ứng thành acetic
acetate, giảm nhẹ ảnh hưởng độc tính của cồn với thần kinh, từ đó làm tỉnh rượu.
GVHD : TS. Lê Chiến Phương SVTH : Đồng Thị Thuận
23
Đồ án tốt nghiệp
CHƯƠNG 3
VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP
3.1. Vật liệu
3.1.1. Cua Đồng