ðẠI HỌC QUỐC GIA TP.HCM
TRƯỜNG ðẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN
PHAN THỊ BÍCH TRÂM

NGHIÊN CỨU HỆ PROTEASE TRÙN QUẾ
(Perionyx excavatus)TRONG QUÁ TRÌNH TỰ
PHÂN VÀ KHẢ NĂNG ỨNG DỤNG

LUẬN ÁN TIẾN SĨ SINH HỌC
Tp. Hồ Chí Minh – 2010


ii
LỜI CAM ðOAN

Tôi xin cam ñoan Luận án này là công trình nghiên cứu của riêng tôi.
Các kết quả trình bày trong luận án là trung thực và chưa từng ñược
ai công bố trong bất kỳ công trình nào khác.

Tác giả luận án Phan Thị Bích Trâm iii
LỜI CẢM ƠN

Với tất cả tình cảm chân thành và sâu sắc nhất, tôi vô cùng biết ơn:

Lời cảm ơn iii
Mục lục iv
Danh mục các ký hiệu và các chữ viết tắt ix
Danh mục các bảng x
Danh mục các hình vẽ và ñồ thị xii
MỞ ðẦU 1
CHƯƠNG 1. LƯỢC KHẢO TÀI LIỆU
1.1.Trùn quế 3
1.1.1 ðặc tính sinh lý học 3
1.1.2 Các nghiên cứu ứng dụng về trùn ñất nói chung và trùn quế nói riêng 4
1.2. Hệ protease và các nghiên cứu ứng dụng 5
1.2.1 Phân loại về protease 7
1.2.2 Cơ chế phản ứng của nhóm serine peptidase 9
1.2.3 Ứng dụng nhóm serrine protease trong quá trình thủy phân fibrin 11
1.2.3.1 Khái quát về phân tử fibrinogen và fibrin 11
1.2.3.2 Vai trò của enzyme thủy phân fibrin trong ñiều trị tim mạch 15
1.2.3.3 Các nghiên cứu về enzyme thủy phân fibrin 16
1.2.4 Ứng dụng protease trong quá trình thủy phân protein 18
1.2.4.1 Các yếu tố ảnh hưởng ñến qúa trình tự phân 18
1.2.4.2 Các phương pháp ñánh giá hiệu suất quá trình thủy phân protein . 20
1.3 Kỹ thuật thu nhận, tinh sạch và phân tích protein hiện ñại 21
1.3.1 Thu nhận và xử lý mẫu 22
1.3.1.1 Nguyên liệu 22
1.3.1.2 Một số thiết bị nghiền mẫu và phá vỡ tế bào dùng trong 22
chiết tách mẫu
1.3.1.3 Các yếu tố cần chú ý khi chiết tách protein 23
1.3.1.4 Tủa sơ bộ 25
1.3.2 Các kỹ thuật sắc ký thường sử dụng trong tinh sạch protein 25
v
1.3.3 Kỹ thuật ñiện di 27

2.2.3.1 Xác ñịnh pH thích hợp cho quá trình tự phân 50
2.2.3.2 Xác ñịnh dung dịch thích hợp bổ sung cho quá trình tự phân 50
2.2.3.3 Xác ñịnh tỷ lệ pha loãng thích hợp cho quá trình tự phân 50
2.2.3.4 Xác ñịnh nhiệt ñộ thích hợp cho quá trình tự phân 51
2.2.3.5 Xác ñịnh thời gian tự phân thích hợp 51
2.2.3.6 Khảo sát sự tương tác giữa nhiệt ñộ và thời gian 52
2.2.3.7 Khảo sát ảnh hưởng của chế ñộ sấy ñến chất lượng bột trùn quế 53
tự phân
2.2.4 Nuôi thử nghiệm ấu trùng và hậu ấu trùng tôm sú ñể ñánh giá 54
khả năng sử dụng bột trùn quế tự phân
2.2.4.1 Phối chế thức ăn 54
2.2.4.2 ðánh giá khả năng sử dụng thức ăn chế biến từ bột trùn quế 54
tự phân lên tỷ lệ sống và tăng trưởng của ấu trùng tôm sú
2.2.4.3 ðánh giá khả năng sử dụng thức ăn chế biến từ bột trùn quế 55
tự phân lên tỷ lệ sống, tăng trưởng và chất lượng của hậu ấu trùng tôm sú
2.3 Phương pháp xử lý số liệu 56

CHƯƠNG 3. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 57
3.1 Khảo sát các yếu tố ảnh hưởng ñến hoạt tính protease trùn quế tự phân 57
3.1.1 Thành phần nguyên liệu 57
3.1.2 Ảnh hưởng thời gian tự phân lên hoạt tính protease trùn quế 58
3.1.3 Ảnh hưởng nhiệt ñộ và pH lên hoạt tính protease trùn quế tự phân 58
3.1.4 Xác ñịnh ñiểm ñẳng ñiện protease trùn quế tự phân 59
3.1.5 Ảnh hưởng các chất ức chế lên hoạt tính protease trùn quế tự phân 60
3.2 Thu nhận, tinh sạch và nghiên cứu các ñặc tính hóa học của hệ protease 60
trùn quế tự phân
3.2.1 Thu nhận bằng phương pháp tủa thích hợpdịch tự phân trùn quế 60
3.2.2 Tinh sạch protease trùn quế tự phân bằng kỹ thuật sắc ký, ñiện di 62
vii
3.2.1.1 Sắc ký trao ñổi ion trên gel Unosphere Q 63

3.4.2 Nuôi thử nghiệm ấu trùng và hậu ấu trùng tôm sú 98
3.4.2.1 ðánh giá khả năng sử dụng thức ăn chế biến từ bột trùn quế lên 98
tỷ lệ sống và tăng trưởng của ấu trùng tôm sú
3.4.2.2 ðánh giá khả năng sử dụng thức ăn chế biến từ bột trùn quế lên 103
tỷ lệ sống và tăng trưởng của hậu ấu trùng tôm sú
3.4.3 So sánh hiệu quả kinh tế giữa thức ăn chế biến từ bột trùn quế thủy phân và
thức ăn ngoại nhập 107

CHƯƠNG 4. KẾT LUẬN VÀ ðỀ NGHỊ
4.1 Kết luận 109
4.2 ðề nghị 110
TÀI LIỆU THAM KHẢO 111
DANH MỤC CÔNG TRÌNH ðà CÔNG BỐ LIÊN QUAN ðẾN ðỀ TÀI 122
PHỤ LỤC 1 123
PHỤ LỤC 2 139
PHỤ LỤC 3 151
PHỤ LỤC 4 160
xiii

3.14 A. Nhiệt ñộ tối ưu các phân ñoạn enzyme sau khi tinh sạch 74
B. ðộ bền nhiệt các phân ñoạn sau khi tinh sạch 74
3.15 A. pH tối ưu các phân ñoạn enzyme sau khi tinh sạch 76
B. ðộ bền pH các phân ñoạn enzyme sau khi tinh sạch 76
3.16 A. ðộ bền các enzyme sau tinh sạch theo thời gian trong dung dich 77
ñệm Na-pp pH 7,5
B. ðộ bền các enzyme sau tinh sạch theo thời gian trong nước cất 77
3.17 ðiện di SDS-PAGE khả năng thủy phân fibrinogen các protease 78
sau khi tinh sạch ở các thời ñiểm khác nhau
3.18 ðiện di hai chiều các phân ñoạn protease sau tinh sạch 79
3.19 So sánh trình tự amino acid FIII-1 trùn quế với Lumbrokinase 81
3.20 So sánh trình tự amino acid FIII-2 trùn quế với Lumbrokinase 81
3.21 Biểu ñồ ảnh hưởng của pH ñến quá trình tự phân trùn quế 84
3.22 Biểu ñồ ảnh hưởng loại dung dịch ñến quá trình tự phân trùn quế 85
3.23 Biểu ñồ ảnh hưởng tỷ lệ pha loãng trùn quế ñến quá trình tự phân 86
3.24 Dịch trùn quế chưa thủy phân ở các hàm lượng protein khác nhau 87
3.25 Dịch trùn quế ở các hàm lượng protein khác nhau sau 24 giờ tự phân 87
3.26 Biểu ñồ ảnh hưởng của nhiệt ñộ ñến quá trình tự phân trùn quế 88
3.27 Biểu ñồ ảnh hưởng của thời gian ñến hàm lượng ñạm amine và ammoniac 89
trong quá trình tự phân trùn quế
3.28 Biểu ñồ ảnh hưởng của thời gian ñến quá trình tự phân trùn quế 90
3.29 ðiện di ñồ tiến trình tự phân protein trùn quế 91
3.30 Ảnh hưởng của nhiệt ñộ và thời gian ñến quá trình tự phân trùn quế 92
3.31 Bột trùn quế tự phân sấy bằng các chế ñộ khác nhau 93
3.32 Các loại thức ăn Frippak, thức ăn chế biến từ bột trùn quế tự phân 97
và chưa thủy phân
xv
3.33 Biểu ñồ tỷ lệ sống của tôm giai ñoạn ấu trùng 100
3.34 Biểu ñồ chiều dài của ấu trùng tôm sú ở các giai ñoạn phát triển 101
3.35 Biểu ñồ tỷ lệ sống của tôm giai ñoạn hậu ấu trùng 104

MALDI: Matrix-Assisted Laser Desorption Ionisation
MS: Mass spectrometry
MS-MS: Tandem mass spectrometry
N1: Nauplius-1
N6: Nauplius-6
NRDB: Non-redundant protein sequence database
OPA: ortho-phthaldialdehyde
PL-1: Postlarvae-1
PL-10: Postlarvae-10
x
PL-15: Postlarvae-15
PL-45: Postlarvae-45
PMSF : Phenylmethyl Sulfonyl Flouride
Q : Quaternary amine
SDS-PAGE: Sodium Dodecyl Sulfate - Polyacrylamide gel electrophoresis
SBTI: Soybean trypsin inhibtor
TACB: Thức ăn chế biến
TEMED : N, N, N’, N’-tera methyl ethylene diamine
TLCK: N-torsyl-L-lysine chloromethyl keton
TNBS : Trinitro-benzene sulfonic acid
TOF : Time of fly
TPCK: N-torsyl-L-phenylalanine chloromethyl keton
Tris : Tris-[hydroxymethyl]aminomethane
tPA : tisue plasminogen activator
uPA: urokinase plasminogen activator
Z1: Zoea-1
Z3: Zoea-3

3.10 Kết quả kiểm nghiệm vi sinh bột trùn quế tự phân sấy phun 95
3.11 Thành phần hóa học các loại thức ăn sử dụng ñể ương ấu trùng 96
và hậu ấu trùng tôm sú
3.12 Biến ñộng một số yếu tố môi trường trong thời gian nuôi ấu trùng tôm sú . 98
3.13 Tỷ lệ sống (%) của tôm giai ñoạn ấu trùng theo các nghiệm thức 99
3.14 Chiều dài (mm) các giai ñoạn ấu trùng tôm sú 102
3.15 Biến ñộng một số yếu tố môi trường trong thời gian nuôi hậu ấu trùng 103
tôm sú
xii
3.16 Tỷ lệ sống (%) của tôm giai ñoạn hậu ấu trùng theo các nghiệm thức 103
3.17 Chiều dài (mm) các giai ñoạn hậu ấu trùng tôm sú 104
3.18 Tỷ lệ sống (%) của hậu ấu trùng khi sốc formol 106
3.19 Chi phí nguyên liệu ñể sản xuất 1 kg thức ăn chế biến từ bột trùn quế 107
tự phân
3.20 Chi phí ñể sản xuất 1 kg thức ăn chế biến từ bột trùn quế tự phân 108
3.21 Bảng giá tham khảo các loại thức ăn trên thị trường 108
xiii


B. ðộ bền nhiệt các phân ñoạn sau khi tinh sạch 74
3.15 A. pH tối ưu các phân ñoạn enzyme sau khi tinh sạch 76
B. ðộ bền pH các phân ñoạn enzyme sau khi tinh sạch 76
3.16 A. ðộ bền các enzyme sau tinh sạch theo thời gian trong dung dich 77
ñệm Na-pp pH 7,5
B. ðộ bền các enzyme sau tinh sạch theo thời gian trong nước cất 77
3.17 ðiện di SDS-PAGE khả năng thủy phân fibrinogen các protease 78
sau khi tinh sạch ở các thời ñiểm khác nhau
3.18 ðiện di hai chiều các phân ñoạn protease sau tinh sạch 79
3.19 So sánh trình tự amino acid FIII-1 trùn quế với Lumbrokinase 81
3.20 So sánh trình tự amino acid FIII-2 trùn quế với Lumbrokinase 81
3.21 Biểu ñồ ảnh hưởng của pH ñến quá trình tự phân trùn quế 84
3.22 Biểu ñồ ảnh hưởng loại dung dịch ñến quá trình tự phân trùn quế 85
3.23 Biểu ñồ ảnh hưởng tỷ lệ pha loãng trùn quế ñến quá trình tự phân 86
3.24 Dịch trùn quế chưa thủy phân ở các hàm lượng protein khác nhau 87
3.25 Dịch trùn quế ở các hàm lượng protein khác nhau sau 24 giờ tự phân 87
3.26 Biểu ñồ ảnh hưởng của nhiệt ñộ ñến quá trình tự phân trùn quế 88
3.27 Biểu ñồ ảnh hưởng của thời gian ñến hàm lượng ñạm amine và ammoniac 89
trong quá trình tự phân trùn quế
3.28 Biểu ñồ ảnh hưởng của thời gian ñến quá trình tự phân trùn quế 90
3.29 ðiện di ñồ tiến trình tự phân protein trùn quế 91
3.30 Ảnh hưởng của nhiệt ñộ và thời gian ñến quá trình tự phân trùn quế 92
3.31 Bột trùn quế tự phân sấy bằng các chế ñộ khác nhau 93
3.32 Các loại thức ăn Frippak, thức ăn chế biến từ bột trùn quế tự phân 97
và chưa thủy phân
xv
3.33 Biểu ñồ tỷ lệ sống của tôm giai ñoạn ấu trùng 100
3.34 Biểu ñồ chiều dài của ấu trùng tôm sú ở các giai ñoạn phát triển 101
3.35 Biểu ñồ tỷ lệ sống của tôm giai ñoạn hậu ấu trùng 104
3.36 Biểu ñồ chiều dài của hậu ấu trùng tôm sú ở các giai ñoạn phát triển 105

khả năng thủy phân mạnh fibrin, chịu nhiệt và bền với pH kiềm cao, ñặc biệt có khả
năng tự phân giải chính protein của nó tạo ra sản phẩm giàu ñạm amin. Vì vậy ñể nâng
cao giá trị sử dụng từ trùn ñất nói chung và trùn quế nói riêng, ñề tài “Nghiên cứu hệ
protease trùn quế trong quá trình tự phân và khả năng ứng dụng” ñược tiến hành
nhằm làm cơ sở khoa học cho việc sử dụng trùn quế trong ñiều trị bệnh và bồi bổ sức
khỏe, ñồng thời tạo ra chế phẩm bột ñạm nuôi ấu trùng tôm sú ñể nâng cao giá trị thương
2
mại của loài trùn ñất nuôi công nghiệp này góp phần mở rộng và phát triển mô hình nuôi
trùn quế phục vụ trong y dược học và nuôi trồng thủy sản, cải thiện cuộc sống của người
dân vùng ñồng bằng sông Cửu Long.
Mục tiêu ñề tài
Nghiên cứu hệ protease trùn quế trong quá trình tự phân và khả năng ứng dụng của
chúng.
Nội dung nghiên cứu ñề tài:
1. Khảo sát các yếu tố ảnh hưởng ñến hoạt tính protease trùn quế tự phân.
2. Thu nhận, tinh sạch và nghiên cứu các ñặc tính hóa học của hệ protease trong trùn quế
tự phân.
3. Nghiên cứu các yếu tố ảnh hưởng ñến quá trình tự phân trùn quế.
4. Nuôi thử nghiệm ấu trùng và hậu ấu trùng tôm sú ñể ñánh giá hiệu quả của sản phẩm
tự phân trùn quế.
Những ñiểm mới và ý nghĩa thực tiễn của luận án :
1. Luận án ñã nghiên cứu hoàn chỉnh hệ protease trùn quế (Perionyx excavatus) trong
quá trình tự phân từ khâu chiết tách, tinh sạch, khảo sát ñặc ñiểm hóa học của hệ enzyme
này ñến việc so sánh trình tự amino acid với lumbrokinase từ các loài trùn ñất khác ñã
ñược nghiên cứu trên thế giới.
2. Nghiên cứu tận dụng nguồn protease trùn quế ñể thủy phân chính nguồn ñạm của nó
ñể tạo ra sản phẩm bột ñạm chất lượng cao dùng nuôi thử nghiệm tôm sú giai ñoạn ấu
trùng và hậu ấu trùng ñạt kết quả rất khả quan.
3. Kết quả của luận án là cơ sở cho các nghiên cứu cơ bản về enzyme nói chung ñặc biệt
nhóm serine protease ñược áp dụng trong y dược. Trùn quế ñược xem là nguồn protease

nước nên có khả năng tồn tại trong nước một thời gian vài tháng.
Trùn quế là sinh vật lưỡng tính, ñai và các lỗ sinh dục lệch về phía ñầu cơ thể, có thể
giao phối chéo với nhau ñể hình thành kén. Sau 14 - 21 ngày mỗi kén nở cho 2 - 10 trùn
con màu trắng, sau 5 - 7 ngày có màu hồng và ñỏ dần.
Về thành phần hóa học của trùn quế gồm nước chiếm khoảng 80 - 85%, chất khô khoảng
15 - 20%. Hàm lượng các chất khô (tính trên trọng lượng chất khô) như sau: protein: 68 -
70%, lipid: 7 - 8%, chất ñường: 12 -14 %, tro: 11 - 12% [47].

4
Trùn quế thích sống nơi ẩm thấp, ấm áp, yên tĩnh. Chúng sợ ánh sáng, nhiệt ñộ cao, tiếng
ñộng, hóa chất bảo vệ thực vật, muối, vôi. Nhiệt ñộ thích hợp từ 20 - 30°C, ẩm ñộ 75-
80%, pH 7,0 - 7,5. Ở nhiệt ñộ khoảng 30°C và ñộ ẩm thích hợp trùn quế sinh trưởng và
sinh sản rất nhanh.
Thức ăn của trùn là các loại phân gia súc, gia cầm, rác ñang phân hủy… trong ñó phân
bò tươi và phân trâu tươi là món ăn thích hợp nhất. Mỗi ngày trùn quế tiêu thụ lượng
thức ăn tương ñương với trọng lượng cơ thể của nó [48].
1.1.2 Các nghiên cứu ứng dụng về trùn ñất nói chung và trùn quế nói riêng
Trong y học cổ truyền Việt Nam, trùn ñất ñược dùng trong một số bài thuốc chữa sốt rét,
sốt nóng, suy nhược cơ thể, cao huyết áp, tai biến mạch máu não [33]. Trùn quế còn
chứa enzyme có thể thủy phân ñặc hiệu fibrin với hoạt tính xúc tác rất cao, có triển vọng
khai thác làm thuốc ñiều trị những căn bệnh ñột quỵ, tim mạch [35].
Hiện nay các tỉnh phía Nam và ñồng bằng sông Cửu Long ñã bắt ñầu nuôi trùn quế với
quy mô lớn, nguồn thức ăn chủ yếu lấy từ phân bò, trâu [48]. Một số nghiên cứu sử dụng
trùn ñất làm thức ăn bổ sung cho gà góp phần nâng cao hiệu suất nuôi gà thả vườn cho
các hộ nông dân [2], hoặc sử dụng trùn quế ñể sản xuất chế phẩm sinh học dùng trong
nông nghiệp[14]. Ngoài ra, nông dân các tỉnh miền Tây sử dụng thêm nguồn thức ăn trực
tiếp từ trùn quế giàu ñạm ñể bổ sung thêm khẩu phần dinh dưỡng cho các loại tôm cá
vừa qua giai ñoạn ấu trùng, hoặc khôi phục sức khỏe vật nuôi sau dịch bệnh. Ở các nước
Châu Á như Nhật Bản, Trung Quốc và Hàn Quốc ñã nghiên cứu thành công enzyme
thủy phân fibrin từ các loài trùn ñất Lumbricus rubellus [55], [80] và Eisenia fetida

công nghiệp sản xuất xà phòng. Người ta có thể thu nhận protease từ nhiều nguồn khác
nhau như thực vật, ñộng vật và vi sinh vật.
Trong chế biến thực phẩm: sử dụng nhiều nhất ñể cải tiến công nghệ sản xuất nước
mắm hoặc nước tương từ các chế phẩm cá, bánh dầu ñậu nành bằng việc bổ sung
protease từ giai ñoạn thô sơ dùng dịch chiết mủ ñu ñủ xanh, vỏ dứa, ruột cá, ruột lợn ñến
giai ñoạn cao hơn dùng chế phẩm enzyme thêm vào quá trình thủy phân như chế phẩm
bromelain [7], [20], [54], papain [11], [94], [96], ficin [49], chế phẩm protease từ nấm
mốc A.oryzae [10], [40], vi khuẩn Bacillus subtilis S5 [3], [36] hoặc nấm sợi [37] và cả
6
các chế phẩm protease từ ñầu tôm [5], [8]. Những kết quả nghiên cứu cho thấy khi bổ
sung thêm protease vào cá thì hàm lượng ñạm amin tăng cao, quá trình thủy phân nhanh
hơn nên rút ngắn ñược thời gian chế biến nước mắm.
Một lĩnh vực khác nghiên cứu sản xuất bột ñạm cao cấp cho trẻ em và người lớn tuổi già
từ bột ñậu nành sử dụng chế phẩm prozima có chứa bromelain ñể cải biến kích thước
phân tử protein và xử lý các protein ức chế tiêu hóa có sẵn trong nguyên liệu [6], hoặc sử
dụng các protease thương mại Alcalase, Novozym, Flavourzyme thủy phân bột ñậu nành
tách béo nhằm làm tăng hàm lượng amino acid tự do ñạt hiệu suất thủy phân cao và rút
ngắn thời gian thủy phân làm giảm thiểu sự hoạt ñộng vi sinh vật [70]. Ngoài ra enzyme
protease còn ñược sử dụng trong các lĩnh vực chế biến thực phẩm khác như làm phomat
[32], làm mềm thịt,…
Trong y học : một số protease như trypsin, α-chymotrypsin dùng sản xuất thuốc chữa
bệnh kém tiêu hóa, tiêu mủ các ổ viêm, làm thông ñường hô hấp rất thông dụng trên thị
trường dược phẩm. Nghiên cứu chế phẩm protease có tên gọi “prozimabo” trong ñiều trị
bỏng giúp giả mạc rụng nhanh, vết bỏng nhanh khỏi [5]. ðặc biệt hiện nay protease ñược
ứng dụng trong ñiều trị bệnh tim mạch, chúng rất ña dạng và có nguồn gốc khác nhau: từ
ñộng vật [56], [62], [63], [81], [82], [112], thực vật [58], [74], ñến vi sinh vật [51], [75],
[60], [114], [107], chúng thuộc nhóm serine protease có khả năng thủy phân fibrin,
fibrinogen.
Trong nông nghiệp: protease ñược bổ sung vào thức ăn cho ñộng vật nuôi nhằm tăng
khả năng tiêu hóa, chúng ñược xử lý trực tiếp vào thức ăn trước khi sử dụng hoặc xử lý