Bộ Y TẾ
TRƯỜNÍ Ỉ ĐẠI HỌC Dược HÀ NỘI
- -
HÀ THỊ MINH CHÂƯ
s ủ DỤNG LFXTIN CHIẾT TÁCH TỪ MÍT DẠI
(ARTO CA R P Ư S M A ST IC A T A M O R A C E A E ) ĐỂ TINH CHẾ
VÀ XÁC ĐỊNH HÀM LƯỢNí; IgA TRONG DỊCH TÍÊT CỦA
BÊNH NHÂN VIÊM cố TỬ CUNG.
Giáo viên hướng dẫn : PGS. TS ĐÀO KIM CHI
ThS, N(;UYỄN VÃN LỢI
Sinh viên thực hiện : HÀ THỊ MĨNH CHÂU
Nơi thực hiện : lìộ MỎN HOÁ SINH
Thời gian thực hiện : 03/2002 - 05/2002
HÀ NỘI 05 - 2002
jQỜ9^@cẨM(fn
aùti hàij, lú Lồttg. hiỀÍ o'tt iãtL ằắe. têưJ)^Ẵ. ^ àũ C K im . & ti im
OTírĩ. QtgMitỊhí <ĩ)ăn Mọi, nhữtiạ. tiqưĩỉi ¿tã tậtt Íìttíi itướttg, dẫtt, kíuiỊỊỀii
idtíeii ĩtônợ, íùỀti ettt Irtìttợ. ằtiối quả Ịrìtilt ihư& itÀỀtt đễ. tà i nàtj^,
<5/11 ae/it ehâtt títàttii eâtn o'fi CTtỹ ^ 0 Qlạạe MÌỀỉt. trưỜỊtạ. ^ ạ ỉ họe
3Cỉttía hoa ÍT h’ ttiùỀti Ịhuôe ^rùòttiỊ ^ ạ i “700e, Q « tfé giíi '3C>à Qỉộl, nạưò'í đã
quan tồtn ohỉ ĩmo oà cỉto ettt tthiềtt tị kiỂMi qutị htỉti.
ò m eiittíỊ x itt ehíìĩì ỉh à ttỉt etittt o'tt íTrV Q ígttụễư (Xjuătt ^hắng.
eùttạ Ufàtt iitỉ eáe. thầíị eô giát), eô ^Ịtạtn ^ítattit ^Mtùơttq oà ũáe. eâ kụ
ỉhuật ơiỀtt trong, hô tttôtt '3ỗtìá sinỉt ^rưỉutíị ^ a i íw e ^u'tì'e 3iCrt Qĩ.ôíf íỹ cí.
QtạuụễMt '3õạnh - ^riiònq Ịỉỉiồiĩq, £a'Tio Sin ít itơd - <Ĩ)ÌỀMI <ĩ)ị sinit íỉịeh
íễ, CKhtìíỉL ^ Itụ Sảtt - ^ ệttií oJệjt ^pitụ Sàti Qlội đă tận ỉínii ạiáụ đ è tạú
đỉềií kiện thuận lợi eito £ỉti trtìitạ iuối litòt gỉm t húũ iập, oă kỡàti Ihàttít
kltoả luậtt íốt ttạiùỀp,.
'Tôà Qtồif iháttạ. 5 năttt. 2002
Sinh oiỂit
7ôà ^ h ị Mình. & tân

2.2 Kết quả thực nghiệm và nhận xét
25
2.2.1 Nghiên cứu khả năng ngưng kết hồng cầu của lectin trong dịch
chiết thô 1(D 1)

.
25
2.2.2 Giai đoạn chiết lectin từ hạt mít dại 25
2.2.3 Giai đoạn kết tủa Protein- lectin
26
2.2.4 Giai đoạn tinh chế leclin mít d ạ i
28
2.2.5 Tóm tắt kết quả tách chiết và tinh chế lectin.
.
.
31
2.2.6 Kết quả điện di lectin mít dại tinh chế trên gel polyacrylamid 32
2.2.7 Kết quả tinh chê IgA bằng cột sắc ký ái lực Sepharose-
Jacalin 32
2.2.8 Kiểm tra khả nãng kết hợp của IgA tinh chế và lectin mít dại
tinh chế bằng phưcfng pháp ELLA

34
2.2.9 Sử dụng lectin mít tinh chế xác định sự thay đổi hàm lượng
IgA trong dịch tiết của bệnh nhân viêm cổ tử cung

35
2.3 Bàn luân 37
PHẦN 3: KẾT LUẬN VÀ ĐỀ X U Ấ l


Heamatoagglutinating activity
HIV :
. Human Immunodeficient Virus
Ig :
Immuno globulin
kDa ;
Kilo Dalton
PBS :
Phosphate buffered saline
SDS :
Sodium dodecyl sulphate
ĐẶT VẤN ĐỂ
Nếu như Hormon, enzym, vitamin là những chất có đặc tính sinh học
có vai trò quan trọng đối với cơ thể thí lectin cũng là chất có đặc tính sinh học
đặc biệt. Mặc dù lectin không có nguồn gốc miễn dịch nhưng nổ vẫn có khả
năng kết hợp nhiều loại tế bào theo kiểu đặc hiệu kháng nguyên - kháng thể,
liên kết với đường hoặc những hợp chất chứa đường.
Hơn một thế kỷ qua kể từ lần đầu tiên được phát hiện (1888), lectin đã
thu hút sự quan tâm chú ý của nhiều nhà khoa học trên thế giới bởi mức đô
phân bố rộng rãi trong tự nhiên và khả năng ứng dụng đa dạng của nó trong
các lĩnh vực của đời sống.
Lectin được phân bố nhiều nhất trong giới thực vật, đặc biệt tập trung ở
hai họ Fabaceae và Moraceae. Trong số những lectin được phát hiện thì lectin
được tinh chế từ chi Artocapus của họ Moraceae có những đặc tính đặc biệt và
đã được ứng dụng nhiều trong lĩnh vực miễn dịch học như; khả năng kết hợp
đặc hiệu IgA, được sử dụng để tinh chế IgA và Iheo dõi hàm lượng IgA trong
một số bệnh, khả năng kích thích phan chia tế bào lympho, khả năng tưcfng tác
với glycoprotein ở bề mặt tế bào lyinpho T của người là phân tử kết hợp đặc
hiệu với virus HIV trong pha nhiễm khuẩn đẩu tiên của AIDS. Như vậy, lectin
tinh chế từ các loài mít đã thực sự trở thành công cụ hữu ích cho việc chẩn

[25].
Mặc dù các khái niệm của lectin thay đổi nhưng ‘lectin” vẫn được sử
dụng như một thuật ngữ khoa học.
* Tình hình nghiên cứu trên thế giới:
Sau hơn 100 năm kể từ khi Stillmark tìm ra ricin - lectin đầu tiên, quá
trình nghiên cứu lectin tiếp theo được chia làm 3 giai đoạn:
Cuối tliế kỷ XIX đầu thể kỷ XX: Các nhà khoa học tập trung vào nghiên
cứu, điều tra sự phân bố của lectin trong giới sinh vật, rất nhiều công trình
nghiên cứu được công bô như của: Stillmark (1888), Helin (1891),
Lansteiner (1902), Lansteiner và Raubischeck (1903), Melden (Ỉ909),
Korbert(1913), Ludwingvaf Kraus(1902), Kayser(1903), Guyot (1908) đã
xác định lectin được phân bố rộng rãi trong thực vật, động vật và cả các vi
sinh vật như virus, vi nấm. [25J
Từ năm 1950- 1970: Ngoài các công trình về điều tra cơ bản, người ta bắt
đầu tập trung vào chiết tách tinh chế để xác định cấu tạo phân tù (cấu tạo
bâc ỉ và cấu trúc không gian) của lectin. Phương pháp tinh chế lectin đã
trải qua nhiều giai đoạn nghiên cứu từ sắc kỹ cột, đến sắc ký trao đổi ion và
cuối cùng dựa trên khả năng tưưiig tác đặc hiệu với đường của lectin, các
nhà khoa học đã tinh chế lectin bằng phương pháp sắc ký ái lực. Kỹ thuật
này đã được Agrwal và Golsteiner nghiên cứu và sử dụng đầu tiên vào năm
1965 [24J. Đây ỉà phương pháp tinh chế lectin hiệu quả nhất, cho chế phẩm
lectin có độ tinh sạch cao và hiện đang được sử dụng tại nhiều nơi trên thế
giới.
Từ năm 1970 đến nay: Nhờ sự hoàn thiện về kỹ thuật tinh chế lectin, các
nghiên cứu tiếp Iheo về lectin được phát triển mạnh sang hướng ứng dụng
trong các lĩnh vực của đời sống và đả đạt được những kết quả khả quan;
Lectin chiết tách từ các cá thể họ hàng gần gũi có những đặc tính sinh học
và có cấu tạo khá giống nhau (Soni-1982), (Wully-1984) được sử dụng làm
cơ sở để gián tiếp phân loại thực vật ở mức độ phân tử.
Lectin được chiết tách từ đậu thận đỏ {Phaseoỉus vuỉgơris Fahaceae) có

học, y học và đáp ứng với nhu cẩu thực tiễn Việt Nam.
1.1.2 Các tính chất của lectin:
Tính chất vật lý và hoá học:
Khới lượng phân tỉc Khối lượng phân tử của ỉectin rất khác nhau,
chúng có khoảng dao động rất lớn từ vài nghìn Da (Lectin rễ cây gai-
ưì ticaceơe 8500 Da), đến vài trăm ngiiìn Da (Lectin của loài sam biển châu Á
Tachyĩeus trideníus 700. 000 Da). Nhiều công trình nghiên cứu cho thấy, khối
lượng phân tử của lectin khôtig liên quan đến hoạt tính của lectin và cũng
không mang tính đặc trưng hay mức độ tiến hoá của loài hoặc cá thể [24],
Tính tan: Lee tin có bản chất là protein nên có khả năng hoà tan trong
nước, đặc biệt đễ hoà tan trong dung dịch muối loãng. Vì vậy, nước muối sinh
lý thường được dùng để làm dung môi chiết, tách và tinh chế ỉectin. Ngược lại
lectin dễ bị kết tủa bởi aceton, alcol ở nhiệt độ thấp cũng như một số muối
trung tính ở nồng độ cao và kim loại nặng.
Khả năng tưong tác vói đường: Khả năng tưomg tác với đường là một
trong những đặc tính quan trọng của lectin. Lectin có khả năng tương tác với
đường đơn và cả các đường nằm trên bề mặt tế bào. Bản chất hoá học của
tưoíig tác này có nhiểu giả thuyết nhưng các nhà khoa học đều thống nhất: Sự
bển vững của liên kết giữa đường và lectin được duy trì bởi liên kết phân cực (
liên kết hydro giữa - OH của đường và với đầu phân cực của gốc aminoaciđ
của phân tử lectin) và liên kết không phân cực (Lực Vanderwall) [24j.
Khả năng tưcmg tác đặc hiệu của lectin với đường đã được ứng dụng trong
nhiều nghiên cứu về tế bào học, miễn dịch học và huyết học. Đặc biệt dựa trên
khả năng tương tác đặc hiệu của leclin với đườiig đã cho phép sử dụng phương
pháp sắc ký ái lực để tinh chế nhiều sản phẩm lectin cũng như nhiểu loại
glycoprotein cho hiệu suấi và độ linh khiết cao.
Đặc tính sinh học của lectin:
Khả năng ngưng kết tế bào:
Ngưng kết tế bào là đặc tính sinh học điển hình của ỉectin. Đặc tính này là
cơ sở để phát hiện ra lectin và phân biệt lectin với các chất sinh học khác cũng

- Làm trung gian trong quá trình tiêu diệt tế bào đích của tế bào lympho và
đại thực bào.
- ITiúc đẩy quá trình thực bào của đại thực bào đối với nấm và vi khuẩn.
“ Tác dụng tương tự Insulin trên tế bào mỡ.
- Tham gia phản ứng giải phóng tiểu cầu.
- ức chế sự thụ tinh của trứng.
- Tương tác với hormon rau thai.
- Úc chế sự giải phóng Histamin từ tế bào Mast và tế bào ưa kiềm.
- Liên kết vi khuẩn cố định đạm[2J.
Các yếu tố ảnh hưởng đến hoạt tính của lectin:
Ảnh hưởnữ của ữH:
Yếu tớ pH có ảnh hưởng lớn trong quá trình tách chiết tinh chế lectin và
hoạt tính của chúng:
ở pH đẳng điện, lectin dễ bị tủa và có hoạt tính thấp nhất.
ở pH tối thích, hoạt tính của lectin được thể hiện tối đa.
Các nghiên cứu cho thấy ờ môi trường acid mạnh hoặc kiềm mạnh, hoạt tính
của lectin bị giảm hoặc mất hoàn toàn.
Ảnh hưỏnẹ của nhỉèt đô:
Lectin có bản chất là protein vì vậy rất dễ bị biến tính bởi nhiệt độ. ở nhiệt
độ quá thấp hoạt tính của lectin giảm, còn ở nhiệt độ cao hoạt tính của lectin
giảm đần rồi mất hẳn.
Ảnh hưởns của dườns đơn:
Các loại đườiig đơn có anh hưởng lớn tới hoạt tính ngưiig kết tế bào của
lectin, vì khi có mặt của đường đơn, trung tâm liên kết hydrocacbon của lectin
bị phong toả làm lectiii không liên kết được với các receptor trên bề mặt tế
bào, do đó tế bào không bị nguiig kết [2J.
Ảnh hưởne của enzvm:
Những enzym có khả năng biến đổi tính chất của màng tế bào cũng gây
ảnh hưởng lớn đến khả năng ngưng kết tế bào của lectin.
Một số enzym có khả năng thuỷ phân một số protein trên màng ỉàm bộc lộ ra

hợp và được giữ ỉại cột.
- Rửa cột: ở giai đoạn này những protein nào không có ái lực với lectin và
các protein thừa sẽ bị đẩy ra khỏi cột.
- Phản hấp phụ lectin khỏi cột: Dùng một dung dịch có ái lực hoá học
phù hợp để đẩy lectin ra khỏi cột.
Phương pháp sắc ký ái lực được sử dụng để tinh chế lectin lần đầu tiên
vào năm Ĩ965 [24], cho đến nay nó vãn được sử dụng rộng rãi VI kỹ thuật đơn
giản, cho hiệu suất cao và chất lượng chế phẩm rất tinh sạch.
1.1.4 ứng dụng của lectin:
Lectin đã được ứng dụng trong nhiều lĩnh vực của đời sống:
Trong huyết học: ỉectin được sử đụng để phân loại nhóm máu. Phương
pháp xác định này cho kết quả nhanh chóng và chính xác nhưng lại đòi hỏi
phải có loại lectin có tính đặc hiệu và độ tinh sạch cao.
- Trong tê bào học: Lectin được sử dụng để nghiên cứu một số cấu trúc
màng tế bào.Phương pháp sắc ký đã được sử dụng để xác định bản chất
glycoprotein của receptor màng tế bào.
- Miễn dịch học: lectin được sử dụng để phát hiện và tinh chế các hoạt chất
sinh học cớ ái lực với lectin như các globuỉin miễn dịch .Từ đó các nhà
khoa học có thể nghiên cứu cấu trúc, bản chất và chức năng của chúng
trong cơ thể. Lectin còn được ứng dụng làm chất kích thích miễn địch để
tăng cường khả năng đáp ứng miễn dịch cho cơ thể (lectin được chiết, tách
và tinh chế từ đậu thân đỏ Phaseoỉus vuỉgơris Fahaceae) [23J
- Trong y học: lectin được sử dụng nhiều trong chẩn đoán bệnh mang lại
hiệu quả cao và độ chính xác. Dựa vào khả năng phân biệt một số vi sinh
vật, lectin được sử dụng cùng với các xét nghiệm thông thường khác để
nâng cao chất lượng chẩn đoán bệnh. Hiện nay trên thế giới, người ta ứng
dụng phương pháp ELLA (là phương pháp ELISA cải tiến) để xác định
virus gây bệnh [20j hoặc xác định hàm lượng một số chất mang hoạt tính
sinh học có ái lực cao với lectin. Dựa vào khả năng phân biệt tế bào bình
thường và tế bào ung thư, lectin được sử dụng để chẩn đoán sớm một số

- Các chuỗi polypeptid này bao giờ cũng đi với nhau từng đôi một và giống
nhau hoàn toàn trong các phân tử Ig.
- Tất cả các globulin đều có chuôi nhẹ L thuộc kiểu K hoặc X, trong khi
chuỗi nặng H của các globulin có nhiều lớp khác nhau.
1.2.2 Chức năng của các globulín miễn dịch trong hệ thống miễn dịch
của cơ thể [7,11,18]:
* Chức năng nhận biết kháng nguyên:
Chức năng nhân biết kháng nguyên là chức năng rất quan trọng của các
giobưlin miễn địch, nó quyết định phản ứng kết hợp đặc hiệu kháng nguyên-
kháng thể. Nhờ đó, các globulin miễn dịch trưng hoà được các kháng nguyên
như độc tố, vi khuẩn
Phân tử globulin miễn dịch kết hợp với quyết định kháng nguyên ở vị trí
gần hay chính vị trí hoạt động của kháng nguyên đo đó phong bế được phản
ứng của độc tố. Nếu điểm quyết định kháng nguyên nằm xa trung tâm hoạt
động của độc tố thì sự kết hợp giữa kháng nguyên và kháng thể sẽ ỉàm biến
đổi cấu trúc không gian của độc tố dãn đến kết quả độc tố không thể bám vào
các tế bào đích và hạn chế khả năng gây bệnh của kháng nguyên, ví dụ IgA
tiết ở niêm mạc đường tiêu hoá có vai trò ngăn vi khuẩn bám vào màng nhầy.
* Chức năng gây ngưtịg kết kháng nguyền:
Chức năng gây ngưng kết kháng nguyên là một trong những chức năng
sinh học khác của các globulin miễn dịch được coi như một chức năng thứ
phát vì khả năng này chỉ xảy ra sau khi các globulin miễn dịch đã thực hiện
xong chức năng kết hợp đặc hiệu kháng nguyên.
Các phân tử globulin miễn dịch của các lớp IgG, IgA, IgM, IgD, IgE có
khả năng ngimg kết vi khuẩn, nấm, ký sinh trùng đơn bào, nhờ đó tạo điều
kiện thuận lợi cho quá trình thực bào.
* Chức năng hỗ trợ cho các quá trínk đại thực bào:
Các kháng nguyên khi đã được bao vây bởi các globuỉin miễn dịch thì
chúng dễ bị các đại thực bào bắt giữ và thực hiện quá trình thực bào. Đặc điểm
này đễ thực hiện vì các đại thực bào và bạch cầu trung tính có các receptor

IgA có hai phân lớp là IgA| và IgAj. Trong đó IgA| chiếm 80%. Cấu
trúc của IgAị và IgAj có sự khác biệt về chiều dài của chuỗi polypeptid và
phần cấu trúc hydradcarbon. ở phân tử IgAj không có cấu trúc có cấu trúc N-
Acetyl- Galactosamin nhưng lại tìm thấy cấu trúc này ở phân tử của IgAị.
• Đặc điểm miễn dịch học:
+ ỉgA có vai trò quan trọng trong việc chống lại sự xâm nhập của các
virus, vi khuẩn và động vật nguyên sinh.
+ IgA tiết có vai trò bảo vệ tại chỗ, ngăn cản sự xâm nhập của các kháng
nguyên vào cơ thể qua hệ thống niêm mạc. Đặc biệt, IgA tiết có khả năng tồn
tại ở pH thấp của dạ dày vì vậy trẻ em được hưỏmg một lượng lớn IgA từ sữa
mẹ, giúp trẻ tăng cường khả năng miễn dịch trong 6 tháng đầu của trẻ sơ sinh.
• IgA và mối liên quan với các bệnh lý:
Các globulin miễn dịch được sinh ra nhằm bảo vệ cơ thể khi chất lạ xâm
nhập vào cơ thể. Vì vậy sự biến đổi hàm lượng các globulin miễn dịch có liên
quan chặt chẽ với các tình trạng bệnh lý của cơ thể.
IgA là một globulin miễn dịch có vai trò chính trong việc ngăn ngừa sự
tấn công của các vi sinh vật qua biểu mô. Bình thường, nồng độ IgA trong
máu luôn ổn định nhưng khi có sự xâm nhập của các vi sinh vật qua biểu mô
thì hàm lượng IgA sẽ tăng lên trong máu. Đặc biệt đối với IgA tiết, cổ vai trò
quan trọng trong việc bảo vệ cơ thể chống lại các vi khuẩn như E. Coỉi,
Salmonella, Shigella quã hệ thống niêm mạc. VI vậy sự tăng hay giảm hàm
lượng IgA thường có liên quan đến một số bệnh lý của cơ thể như:
- Bệnh chuỗi nặng (a) thuộc IgA thể hiện sự tăng sinh tế bào lympho xâm
nhập vào tế bào non, các hạch mạc treo làm teo nhung mao ruột, giảm sự
hấp thu dinh dưỡng và dẫn đến hậu quả suy dinh dưỡng đặc biệt ở trẻ nhỏ.
- Khi cơ thể thiếu hụt IgA thường đẽ bị nhiễm trùng hô hấp và đường ruột-
Đặc biệt ở trẻ sơ sinh thường được cung cấp IgA từ nguồn sữa mẹ trong khi
hệ thống miễn dịch chưa hoàn chỉnh. Vì vậy với những trẻ em không được
bú mẹ, thường bị mắc các bệnh nhiễm trùng hơn trẻ được bú đầy đủ sữa
mẹ. Sự thiếu hụt IgA còn có thể gây ra hiện tượng sốc khi bị nhiễm trùng

Cách xử lý mẫu:
- Ngâm bông có thấm bệnh phẩm vào đệm PBS pH 7,4.
- Chiết 3 lán bằng đệm PBS pH 7,4.
- Thu lấy dịch chiết
- Kết tủa bằng amonisulphat 41% bão hoà, ổn định kết tủa trong 24 h.
- Ly tâm iấy tủa ở 4° c, 10 000 vòng/phút, hoà tan tủa bằng đệm PBS
pH 7,4.
2.1.2 Hoá chất và thuốc thử:
- Acrylamiđ, Bis Acrylamid, Broniuacỵanogen, Sodium azid,
D - (+) - Galactose, Amonisulphat (MERCK- Germany).
- Amonipersulphat (Kockligh - Japan).
- Commasie Brillant Blue R250 (Recinal - Hungary).
- Sepharose 4B (Pharmacia biotech AB - Sweden).
- Thuốc thử Folinciocalteur.
- Thuốc thử đồng kiềm.
“ Đệm Blocking pH 7,65.
- Anti- IgA gắn OP (Sigma).
- Cơ chất OPD (Sigma).
- Hồng cầu người nhóm máu A, B, o lấy tại Viện huyết học và truyền
máu trung ương được chống đông máu bằng dung dịch ACD, rửa 3 ỉần
bằng nước muối sinh lý 0,9%.
2.1.3 Thiết bị và máy móc:
- Máy ly tâm lạnh Biof'uge I5R. (Gennany)
- Máy đo quang phổ UV-VIS.
- Máy chạy điện di Hoffoe Small II (USA).
- Máy đo pH Jenway (England),
- Máy đông khô Jouan LP3. (France)
- Máy khuấy từ.
- Cột sắc ký Sepharose 4B- Mucin (1,5 X 6cm).
- Bản nhựa làm phản ứng ELISA.

giếng.
- Đặt ở nhiệt độ phòng 60 phút, đọc kết quả.
* Phương pháp xác định Proíein:
■ Hàm lượng protein trong mẫu thí nghiệm được xác định bằng phưcíng pháp
Lowry[10], với chất chuẩn là BSA.
- Chất chuẩn BSA.
- Xây dựng đường chuẩn và lập phương trình hồi quy.
y = l,0345x- 0,0409 (với = 0,99)
Hình 2. Đồ thị đưòng chuẩn định lượng protein ở bước sóng 660nm