BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO
TRƯỜNG ĐẠI HỌC NHA TRANG
VIỆN CÔNG NGHỆ SINH HỌC VÀ MÔI TRƯỜNG
BÀI GIẢNG VI SINH VẬT THỰC HÀNH
(Dùng cho ngành Nuôi trồng thủy sản)
Biên soạn: Phạm Thị Lan
Vũ Đặng Hạ Quyên
Bộ môn: Công nghệ sinh học
Một số quy định đối với sinh viên khi thực tập môn Vi sinh vật ứng dụng
tại phòng thí nghiệm Công nghệ sinh học
1. Đi thực tập đầy đủ, đúng giờ.
2. Phải đọc kĩ tài liệu trước khi đi thực tâp.
3. Bắt buộc phải mặc áo blouse, đeo bảng tên trong suốt thời gian thực tập.
4. Phải nghiêm túc, giữ trật tự trong suốt thời gian thực tập.
5. Không được tự ý sử dụng các trang thiết bị trong phòng thí nghiệm khi chưa
được sự đồng ý của cán bộ hướng dẫn.
6. Sử dụng các trang thiết bị thí nghiệm đúng quy cách và đúng mục đích sử
dụng.
7. Phải ký vào sổ quản lý trang thiết bị sau khi sử dụng.
8. Nghiêm cấm ăn, uống, nằm, ngồi ngả nghiêng, đùa giỡn trong phòng thí
nghiệm
9. Phải vệ sinh phòng sạch sẽ trước khi ra về.
10.Hoàn thành bài báo cáo thực tập và nộp lại cho giáo viên hướng dẫn theo thời
gian quy định.
Bài 1.
CHUẨN BỊ CÁC DỤNG CỤ VÀ GIỚI THIỆU CÁC THIẾT BỊ MÁY MÓC
THƯỜNG ĐƯỢC SỬ DỤNG TRONG NGHIÊN CỨU VI SINH VẬT
I. Chuẩn bị dụng cụ
I.1. Các dụng cụ thường được sử dụng trong nghiên cứu vi sinh vật
- Đĩa petri (hộp petri, hộp lồng)
- Ống nghiệm, bình nón có đậy nút bông

vết bẩn. Dùng khăn mềm thấm xà phòng cọ kỹ phía ngoài. Xả nước sạch xà phòng
phía trong và phía ngoài. Tráng lại bằng nước khử khoáng. Dựng ngược ống và bình
vào rổ có lót giấy sạch để róc nước. Làm khô ở nhiệt độ phòng hoặc phơi nắng hoặc
sấy khô ở 100
0
C.
- Đối với các đĩa petri: dùng khăn mềm thấm xà phòng cọ kỹ từng bộ. Rửa sạch xà
phòng, tráng lại bằng nước khử khoáng. Úp đĩa petri vào rổ theo từng bộ để róc nước.
- Các phiến kính và lá kính dùng xong nên ngâm riêng vào dung dịch tẩy rửa hoặc sát
trùng. Dùng khăn mềm cọ,rửa, tráng nước khử khoáng, thấm khô bằng khăn bông,
hong khô trước khi xếp vào hộp. Các lá kính rất dễ vỡ, rửa thận trọng dưới dòng nước
chảy nhẹ.
- Pipet dùng cho các phản ứng hóa học: không cần ngâm nước sát trùng. Đặt pipet
dưới vòi nước chảy, xả bớt hóa chất bám dính bên trong. Ngâm vào ống nước xà
phòng một ngày, rửa sạch, tráng nước khử khoáng. Loại pipet này chỉ nên hong khô ở
nhiệt độ phòng. Sấy ở nhiệt độ cao thủy tinh dãn nở dẫn đến sai lệch thể tích.
Chú ý: nếu ngâm lâu trong dung dịch tẩy rửa mạnh các vạch chia độ sơn trên
pipet dễ bị mờ.
I.5. Cách làm nút bông
- Ống nghiệm, bình nón, bình cầu dùng để nuôi cấy vi sinh vật nhất thiết phải được
đậy nút bông. Bông không thấm nước được sử dụng để làm nút. Nút bông có chức
năng như một dụng cụ lọc khí vô trùng do vậy cần có độ dày vừa phải để không khí
có thể đi qua nhưng vi sinh vật bị giữ lại. Hơn nữa nút bông cần làm đúng kiểu cách
để thuận tiện khi thao tác thí nghiệm.
I.6. Cách bao gói đĩa petri và pipet
- Quan sát cách gói đĩa petri bằng giấy
- Quan sát cách cuốn giấy bao gói pipet từng cái. Có thể chọn các pipet cùng kích cỡ
gói lại thành bó, buộc hai đầu, đánh dấu phần miệng hút. Sau khi khử trùng, chỉ được
mở phần này để lấy pipet ra dùng, tay không được chạm vào phần nhọn của pipet.
- Quan sát cách bao gói que gạt, que cấy tre hoặc thủy tinh, các ống nghiệm có nút

- Màng lọc vô trùng
- Đèn tử ngoại (UV)
- Nồi hấp
- Tủ cấy vô trùng
- Bình ủ kỵ khí
III. Môi trường nuôi cấy vi sinh vật
Các tế bào vi sinh vật sinh trưởng được thì cần các các chất dinh dưỡng thích hợp.
Khi nuôi cấy nhân tạo người ta làm các loại “thức ăn” cung cấp cho từng nhóm vi
sinh vật khác nhau. Dạng “thức ăn” này được gọi là môi trường nuôi cấy.
III.1. Các yêu cầu về môi trường nuôi cấy
- Đầy đủ các chất dinh dưỡng phù hợp với từng kiểu trao đổi chất của từng nhóm vi
sinh vật, không chứa các yếu tố độc hại, đảm bảo cho sự sinh trưởng bình thường
của vi sinh vật.
- Vô trùng tuyệt đối để khi nuôi cấy chỉ phát triển một loại vi sinh vật mong muốn.
III.2. Phân loại môi trường
- Phân loại theo thành phần hóa học:
Môi trường có thành phần xác định;
Môi trường có thành phần không xác định
- Phân loại môi trường theo chế độ dinh dưỡng
Môi trường tối thiểu
Môi trường đủ hoặc giàu
- Phân loại môi trường theo công dụng
Môi trường chọn lọc
Môi trường phân biệt
Môi trường chọn lọc – phân biệt
III.3. Cách làm môi trường
Cần đọc kỹ công thức môi trường, chuẩn bị các hóa chất, dụng cụ liên quan
- Pha chế
- Đun môi trường
- Điều chỉnh pH

• soong 2 lít - 2 cái;
• besher loại 500 ml – 2 cái; loại 250 ml – 2 cái;
• pipét loại 1ml - 2 cái,
• loại 5 ml - 2 cái;
• ống nghiệm - 50 ống;
• chai tam giác loại 250 ml - 6 chai;
• kéo cắt giấy - 1cái;
• dao thái -1cái;
• hộp Petri-25 hộp/ nhóm;
• khăn lau - 2 cái;
• bật lửa - 1 cái;
• ống nhỏ giọt - 2 cái.b. Nguyên liệu và mẫu vật
• Bông không thấm nước 100g;
• nước cất 10 lít;
• cồn đốt 1000 ml;
• bông thấm nước; giấy thấm 1 hộp;
• giấy báo cũ để gói đĩa Petri;
• dây buộc bằng nilon;
• Môi trường thạch đĩa 30 hộp,
• thạch nghiêng 50 ống để nuôi cấy vi khuẩn
• Chai tam giác loại 250 ml chứa môi trường đã pha chế trước
• Đất vườn, đất đồi, mỗi loại 100-150g.
• Các ống giống vi khuẩn chuẩn.
• Chất ức khuẩn: streptomycin, penicillin, gentian violet v.v
• Môi trường thạch TSA
• Môi trường TCBS.
2. Nguyên tắc phân lập

c. Phân lập vi khuẩn hiếu khí và kị khí tùy tiện
- Cấy dịch huyền phù lên môi trường đặc trong hộp Petri
+ Dùng pipet vô trùng nhỏ 1ml dịch huyền phù đã pha loãng ở nồng độ nhất định lên
bề mặt của môi trường trong hộp Petri.
+ Dùng que trang dàn đều giọt dịch huyền phù trên toàn bộ bề mặt môi trường hộp
thạch.
+ Đậy hộp Petri, gói lại và đặt vào tủ ấm ở nhiệt độ 28 - 30
0
C trong 48 - 72h.
- Trộn dịch mẫu pha loãng trong các môi trường thạch nóng chảy
Dùng pipet vô trùng nhỏ 1ml dịch huyền phù đã pha loãng ở nồng độ nhất định vào
môi trường thạch đã nóng chảy và để nguội đến 45 - 50
0
C trong bình nón, lắc đều. Bổ
sung thêm một trong các chất ức khuẩn trên khoảng 0,3-0,5‰, tiếp tục lắc đều một
lần nữa rồi đổ ra các hộp Petri mỗi hộp cở 15ml. Gói các hộp Petri lại, và đặt vào tủ
ấm ở nhiệt độ 28 - 30
0
C trong 48 - 72h.
- Phân lập vi khuẩn bằng que cấy vòng
+ Nung đỏ đầu que cấy vòng (hình 2.1), làm nguội trong không khí khoảng 15s. Cho
vòng que cấy chấm vào dịch huyền phù đã pha loãng có chứa vi khuẩn cần phân lập.
+ Tay trái hé mở nắp hộp thạch. Đặt đầu que cấy vào 1 góc hộp thạch, chấm nhẹ để
loại bớt tế bào một lần nữa. Từ điểm này đẩy nhẹ đầu que cấy lướt nhanh trên bề mặt
thạch theo đường zích zắc (hình 2.2). Xoay đĩa và tiếp tục vạch các đường zích zắc
sao cho không trùng lên nhau trên khoảng trống còn lại, nhằm tạo điều kiện cho các
khuẩn lạc mọc rời nhau ra. Đậy nắp hộp. Khử trùng que cấy trước khi cắm vào giá.
+ Các thao tác phải nhanh tay và làm trên ngọn lửa đèn cồn đặt trong tủ cấy, đảm bảo
vô trùng.


+ Cấy truyền định kỳ trên môi trường thạch nghiêng mới (1 tháng/1lần).
+ Giữ vi khuẩn ở nhiệt độ 4-5
0
C trong tủ lạnh hoặc phòng lạnh.
+ Trộn vi khuẩn với glycerol vô trùng với tỉ lệ 1 : 20 và giữ ở nhiệt độ 3-5
0
C.
+ Bảo quản vi khuẩn trong cát sạch đối với những chủng có bào tử.
+ Phương pháp đông khô v.v
4. Thu nhận nhanh một số chủng vi khuẩn trong thực tế
Bên cạnh phương pháp phân lập như trên, tùy điều kiện từng trường chúng ta có thể
tự thu nhận nhanh các chủng vi khuẩn để làm đối tượng thực hành sinh học.
a. Phân lập trực khuẩn Bacillus subtilis(Gram dương sinh bào tử)
- Cỏ khô cắt nhỏ 5g, cho vào bình tam giác dung tích 250ml, 200ml nước
- Bổ sung thêm 1g đất vườn, 1/4 viên phấn viết bảng
- Đun sôi 15 phút để diệt các tế bào sinh dưỡng và tế bào không có nội bào tử
- Đậy nút bông, ủ ấm ở nhiệt độ 30
0
C trong 72h
Kết quả: Xuất hiện lớp váng xám có nhiều trực khuẩn Bacillus subtilis
Trên kính hiển vi các tế bào Bacillus subtilis có dạng hình que, kích thước khoảng 3-5
´ 0,6 mm, mỗi tế bào chỉ có một bào tử hình ô van và không làm biến dạng tế bào.
b. Thu nhận liên cầu khuẩn Streptococcus lactis (Gram dương không sinh bào tử)
- Lấy 2 ml sữa chua Vinamilk hòa loãng với 3ml nước cất, ta được 5ml dung dịch
chứa liên cầu khuẩn Streptococcus lactis.
c. Thu nhận Vibrio (phân lập bằng môi trường TCBS)
- - Tiến hành thu mẫu nghiên cứu và xử lý mẫu như sau:
* Với mẫu bùn và nước: lấy 1ml hoặc 1g mẫu trộn đều với 9ml dung dịch nước muối
sinh lý vô trùng được nồng độ 10
-1

- Hóa chất dùng để nhuộm: tím kết tinh, lugol, safranin, lục malachit.
- Dụng cụ thí nghiệm: đèn cồn, lăng kính, lammen, kính hiển vi quang học…
III. Phương pháp
- Quy trình nhuộm đơn các tế bào vi sinh vật:
- Quy trình nhuộm Gram:
Vật liệu, hoá chất:
 Dung dịch Tím kết tinh (Crystal violet):
- 2g tím kết tinh hoà tan trong 20 ml etanol 95%
- 0,8 g ammon oxalat hoà tan trong 80 ml nước cất
- Trộn hai dịch nói trên lại với nhau, giữ 48 giờ rồi lọc. Bảo quản trong lọ tối, sử
dụng vài tháng.
 Dung dịch Iod:
- Hoà tan 1 g Iod (Iodine) trong 3-5ml nước cất, thêm 2g KI (Kali iodide), khuấy
cho tan hết, thêm nước cất cho đủ 300ml. Bảo quản trong lọ tối.
 Dung dịch tẩy màu:
- Etanol 95% hoặc trộn hỗn hợp 70ml etanol 95% với 30ml aceton.
 Dung dịch nhuộm bổ sung:
- Chuẩn bị sẵn dung dịch Fushin 2,5%, trước khi dùng pha với nước cất theo tỷ lệ
1:5 (vol/vol) để có dung dịch 0,5%.
Các bước tiến hành:
- Chuẩn bị vết bôi: dùng que cấy vô trùng lấy một ít vi khuẩn từ thạch (sau khi
cấy 24 giờ) hoà vào 1 giọt nước cất ở giữa phiến kính, làm khô trong không
khí.
- Cố định tế bào: hơ nhanh vết bôi trên ngọn lửa đèn cồn 2-3 lần.
- Nhuộm bằng dung dịch Tím kết tinh trong 1 phút, rửa nước, thấm khô.
- Nhuộm lại bằng dung dịch Iod trong 1 phút, rửa nước, thấm khô.
- Nhỏ dịch tẩy màu, giữ khoảng 30 giây (cho đến khi vừa thấy mất màu), rửa
nước, thấm khô.
- Nhuộm bổ sung bằng dung dịch Fushin trong 2-3 phút, rửa nước, để khô trong
không khí.

-1
, 10
-2
, 10
-3
, 10
-4
,
10
-5
tiến hành cấy mẫu ở các độ pha loãng khác nhau vào cac đĩa Petri (lặp ba, tức
là cấy mẫu ở mỗi độ pha loãng vào 3 đĩa Petri) theo hai phương pháp trên. Lưu ý rằng
ở phương pháp cấy gạt, chỉ cấy 0,1 ml dịch mẫu lên môi trường thạch rắn đã đổ sẵn,
còn đối với phương pháp đổ đĩa thì cấy 1 ml dịch mẫu vào đĩa trước khi thêm môi
trường thạch lỏng đã nguội vào.
- Đặt các đĩa thạch vừa cấy vào tủ ấm cài ở nhiệt độ 30oC và ủ trong 48 giờ.
- Kết thúc thời gian ủ, lấy các đĩa thạch ra, tiến hành đếm khuẩn lạc và tính số lượng
tế bào trong 1ml mẫu theo công thức đã nêu trên.
Mật độ tế bào vi sinh vật trong mẫu ban đầu tính từ số liệu của độ pha loãng D1
được tính theo công thức là :
Mi (CFU/ml) = A
i
x D
i
/V
Trong đó : A
i
là số khuẩn lạc trung bình/ đĩa
D
i

3. Mô tả kết quả kiểm tra hoạt tinh đối kháng của hai nhóm vi sinh vật phân lập
được.
4. Mô tả kết quả kiểm tra hoạt tính phân giải tinh bột của chủng vi sinh vật đã
tuyển chọn.