BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO
BỘ NÔNG NGHIỆP VÀ PTNT
VIỆN KHOA HỌC NÔNG NGHIỆP VIỆT NAM TRẦN DUY DƢƠNG
NGHIÊN CỨU ĐA DẠNG DI TRUYỀN
VÀ XÁC ĐỊNH CHỈ THỊ NHẬN DẠNG MỘT SỐ
NGUỒN GEN HOA LAN HOÀNG THẢO (DENDROBIUM)
BẢN ĐỊA CỦA VIỆT NAM Chuyên ngành : Di truyền và Chọn giống cây trồng
Mã số : 62.62.01.11 TÓM TẮT LUẬN ÁN TIẾN SĨ NÔNG NGHIỆP

HÀ NỘI - 2015

Luận án được hoành thành tại:
VIỆN DI TRUYỀN NÔNG NGHIỆP
VIỆN KHOA HỌC NÔNG NGHIỆP VIỆT NAM


tạo ra các công cụ hữu hiệu và nhanh chóng được ứng dụng trong nghiên cứu
bảo tồn đa dạng sinh học. Ưu thế của các kỹ thuật phân tử là có khả năng xác
định được sự đa dạng ở mức độ gen, tạo cơ sở để đánh giá về giá trị bảo tồn của
loài và quần thể. Chính vì vậy, việc tạo lập cơ sở dữ liệu ADN (DNA
fingerprinting) của các giống/loài, đăng kí ở ngân hàng gen thế giới, khẳng định
chủ quyền quốc gia về tài nguyên di truyền thực vật của nước ta cũng như việc
xác định bản quyền đối với giống cây trồng và thực hiện quyền sở hữu trí tuệ về
tên các giống cây trồng quý, đặc hữu của Việt Nam nói chung và lan Hoàng
Thảo nói riêng đang là vấn đề rất quan trọng, cấp bách, mang tính khoa học và
thực tiễn cao, không chỉ phục vụ cho lợi ích trước mắt mà còn định hướng mục
tiêu lâu dài trong công tác bảo tồn khai thác hiệu qủa nguồn gen phục vụ các
chương trình kinh tế trọng điểm đất nước. cơ sở
, chúng tôi đề tài nghiên cứu: “Nghiên cứu đa dạng di truyền và
xác định chỉ thị nhận dạng một số nguồn gen hoa lan Hoàng Thảo (Dendrobium)
bản địa của Việt Nam”.
2. Mục tiêu của luận án
- Đánh giá đa dạng di truyền ở mức độ hình thái kết hợp với chỉ thị phân
tử để xác định mối quan hệ di truyền của các giống/loài hoa lan Hoàng Thảo
bản địa phục vụ cho công tác phân loại, chọn và lai tạo giống mới.
- Sử dụng chỉ thị ITS để để nhận dạng một số nguồn gen hoa lan Hoàng
Thảo bản địa quý của Việt Nam phục vụ cho công tác bảo tồn, làm cơ sở dữ
liệu cho xây dựng ADN mã vạch.
3. Ý nghĩa khoa học và ý nghĩa thực tiễn của đề tài
3.1. Ý nghĩa khoa học
- Cung cấp dữ liệu khoa học về đa dạng di truyền ở mức hình thái và mức
phân tử của các mẫu giống hoa lan thuộc chi Hoàng Thảo bản địa, là cơ sở để tuyển
chọn những nguồn gen ưu tú phục vụ cho công tác chọn và lai tạo giống mới;
2
- Kết quả của đề tài rất có ý nghĩa trong việc nhận dạng một số giống/loài
lan Hoàng Thảo bản địa Việt Nam, làm cơ sở cho công tác bảo tồn, lưu giữ các

Angiospermanophyta), phân giới thực vật bậc cao (Cosmobionia), giới thực vật
(Plantae) (Trần Hợp, 1998; Hoàng Thị Bé, 2004; Leitch và cs., 2009; Evans và
cs., 2012).
Nghiên cứu phân loại chi lan Hoàng Thảo (Dendrobium. sw) ở Việt Nam
thường dựa trên hệ thống của Seidenfaden (1985). Hệ thống này rõ ràng, không
phức tạp, có độ tin cậy cao và phù hợp với các đại diện của chi lan Hoàng Thảo ở
Việt Nam (Trần Hợp, 1998; Dương Đức Huyến, 2007).
1.1.2. Đặc điểm hình thái
1.1.2.1. Thân
3
Thân của các đại diện chi lan Hoàng Thảo đều phân đốt, hình trụ, hình
con suốt, hình chùy, hình trứng, có chiều dài thay đổi từ 2-3cm đến 120cm hoặc
đôi khi hơn, kích thước phổ biến là 20-50cm (Trần Hợp, 1998). Thân có thể
mảnh, đôi khi dẹp bên hoặc là dày mập lên hay có dạng tràng hạt.
1.1.2.2. Rễ
Rễ của các đại diện chi lan Hoàng Thảo là rễ khí sinh, thường mảnh, hình
trụ, màu xanh và chuyển thành nâu khi già, chúng thường ôm lấy giá thể hoặc
buông thõng xuống.
1.1.2.3. Lá
Lá mọc thành hai dãy so le nhau, không có cuống mà chỉ có bẹ ôm thân,
ít khi không có bẹ. Lá thường cứng, dạng da, bóng, ít khi nạc và mềm, bề mặt
thường nhẵn. Lá thường hình mác, bầu dục, đôi khi hình kiếm, hình thuôn hoặc
ít khi lá hình thoi dài (Averyanov, 2004).
1.1.2.4. Nhóm hoa
Nhóm hoa thường là nhiều hoa, đôi khi ít hoa hoặc hoa đơn độc. Nhóm
hoa dài thường rủ thõng xuống, nhiều loài có nhóm hoa đẹp có giá trị làm cảnh
(Trần Hợp, 1998).
1.1.2.5. Hoa
Hoa lưỡng tính, đối xứng hai bên. Màu sắc hoa đa dạng, sặc sỡ. Hoa đa số
các loài có hương thơm.

thể (Salazar, 2003).
1. 3. 3. 3. Phương pháp đánh giá đa dạng di truyền dựa vào các chỉ thị phân tử ADN
Các chỉ thị ADN phổ biến trong nghiên cứu sinh học phân tử ở thực vật là:
Restriction Fragment Length Polymorphism (RFLP); Amplified Fragment
Length Polymorphism (AFLP); Random Amplified Polymorphic DNA
(RAPD); Microsatellite hay Simple Sequence Repeates (SSR); Inter-simple
sequence repeats (ISSRs) (Singh và cs., 2012; Shangguo và cs., 2013; Swati
Das và cs., 2014).
1.3.3.4. Các phƣơng pháp nghiên cứu về phân loại thực vật dựa trên trình
tự gen
* Vùng ITS (Internal Transcribed Spacer) là một đoạn RNA không có
chức năng, nằm giữa các RNA cấu trúc của ribosome thường được dịch mã.
Cấu trúc vùng ITS gồm ITS1 – 5.8S – ITS2. Một lợi thế của vùng ITS là nó bao
gồm 2 locus riêng biệt (ITS1 và ITS2) được nối với nhau qua locus 5.8S. Vùng
5.8S khá bảo ôn, trên thực tế có đủ tín hiệu phát sinh loài phân biệt ở mức bộ và
ngành (Richardson và cs., 2001; Sharma và cs, 2012).
* Vùng Gen rbcL (ribulose-bisphosphate carboxylase) được sử dụng
nhiều để dựng cây phát sinh loài. Tuy nhiên, đối với mối quan hệ di truyền ở
mức dưới loài thì sự phân tích trên gen này gặp nhiều hạn chế (Kress và
Erickson, 2007).
* Vùng gen matK (gen mã hóa cho maturaseK): Các nghiên cứu sử dụng
trình tự gen matK để xây dựng cây phát sinh loài như cho thấy gen matK có
tính đa dạng hơn những gen khác có trong lục lạp và do vậy gen matK trở thành
gen chỉ thị quan trọng để giúp phân loại thực vật (Asahina và cs., 2010; Sharma
và cs., 2012).
1. 4. Tình hình nghiên cứu hoa lan trên thế giới và ở Việt Nam
1.4.1. Nghiên cứu đánh giá đa dạng di truyền và xác định chỉ thị nhận dạng
hoa lan trên thế giới
1.4.1.1. Nghiên cứu ở mức độ hình thái
Đối với loài Lan Hoàng Thảo (Dendrobium), có rất nhiều các nghiên

Với hoa lan Hoàng Thảo, năm 2009 tác giả Wang và cộng sự đã sử dụng 17
chỉ thị ISSR để đánh giá đa dạng di truyền của 31 loài hoa lan Hoàng Thảo được thu
thập ở Trung Quốc. Kết quả cho thấy, trong số tổng 2368 băng được khuếch đại thi
có 278 ISSR locus có độ đa hình là 100%.
* Các nghiên cứu dựa vào trình tự ADN
Công trình đầu tiên trên thế giới sử dụng mã vạch ADN để phân biệt
Dendrobium là công trình của nhóm tác giả Trung Quốc công bố năm 2009 (Yao và
cs., 2009). Trong nghiên cứu này, các tác giả giải mã vùng chen giữa psbA-trnH nằm
trên genome lục lạp của 17 loài Dendrobium. Cũng trên đối tượng Dendrobium,
nhóm tác giả Nhật Bản (Asahina và cs., 2010) lại sử dụng trình tự gen matK và rbcL
để phân định loài đồng thời nghiên cứu sự phát sinh chủng loài của nhóm
Dendrobium dùng trong y học.
1.4.2. Tình hình nghiên cứu hoa lan ở Việt Nam
Từ năm 1985 đến nay đã có một số viện nghiên cứu và các trường đại học như
Viện Sinh thái Tài nguyên Sinh vật, Viện Sinh học Nhiệt đới, Đại học Nông Nghiệp
I, Đại học Lâm Nghiệp, Viện Di truyền Nông nghiệp, Viện Rau hoa quả đã tập trung
vào nghiên cứu, điều tra, phân loại lưu giữ một số tập đoàn phong lan ở nước ta. Đối
với cây hoa lan Hoàng Thảo, Nguyễn Thị Mỹ Duyên và cộng sự., 2012 đã nghiên
6
cứu dựa trên đặc điểm hình thái và tìm ra được ba loài D.pulchellum, D.Gatton
Sunray và D.moschatum có mối quan hệ rất gần nhau, mức tương đồng lần lượt là
96,5% và 95%. : “Đánh giá đa
dạng di truyền của giống lan rừng Dendrobium
.
rker nhận
dạng trên đối tượng lan Hoàng Thảo dựa trên giải trình tự các vùng gen ITS, matK,
rbcL
. Mới đây
nhất, Trần Hoàng Dũng và cộng sự 2012 đã ứng dụng công nghệ ADN để phânn loại
và nhận diện lan Hoàng thảo trầm rừng (D.parishii) và Phi điệp (D.anosmum) tại

2.3.2.4. Kiểm tra ADN bằng máy đo quang phổ
7
2.3.2.5. Phản ứng RAPD
Các loại mồi RAPD thuộc nhóm OPA và OPN do hãng Operon cung cấp;
mồi ITS do Sigma cung cấp.
2.3.3. Giải trình tự vùng ITS của gen ribosom nhân
2. 3.3.1. Khuếch đại vùng ITS bằng kỹ thuật PCR
Vùng ITS được khuếch đại bằng cặp mồi ITS1 và ITS4.
2.3.3.2. Giải trình tự sản phẩm PCR
2. 3.3.3. So sánh với cơ sở dữ liệu GenBank
2. 3.3.5. Xây dựng cây phát sinh loài
2.4. Phần mềm xử lý số liệu
- Số liệu nghiên cứu được phân tích, xử lý dựa trên các phần mềm Excel
version 5.0, phần mềm PCORD, phần mềm NTSYS, MEGA: phiên bản 5.2.1, để
xây dựng cây phát sinh loài.
2. 5. Địa điểm và thời gian nghiên cứu
- Địa điểm và thời gian nghiên cứu: Bộ môn Kĩ thuật Di truyền, Viện Di
truyền Nông nghiệp, thời gian nghiên cứu: 2010-2014.

CHƢƠNG III
KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN
3.1. tập đoàn chi lan Hoàng Thảo
hoa lan nhà
vườn số 422 Phạm Văn Đồng, Từ Liêm, Hà Nội 3
Thảo C (D2
-
. Các mẫu giống hoa như: D4, D7, D8, D12, D13, D14, D17, D19,
D20, D21, D22, D23, D24 và D25 có dải phân bố rộng từ Bắc đến Nam. Các mẫu
giống hoa còn lại chỉ tìm thấy ở một số địa phương của một vài tỉnh miền Trung hoặc
phía Nam, trong đó có mẫu giống hoa Hoàng thảo Vani (D27), Hoàng Thảo Đại Bạch

Lâm Đồng
D2
Hoàng Thảo Chuỗi ngọc
Điện Biên
D. findlayanum
Điện Biên
D18
Hoàng Thảo Chuỗi Ngọc
D. findlayanum
Kontum
D3
Hoàng Thảo Thái Bình
D. moschatum
Thái Bình
D19
Hoàng Thảo Kiều trắng Đồng
Nai
D. farmeri
Đồng Nai
D4
Hoàng Thảo Phi Điệp tím
D. anosmum
Hòa Bình
D20
Hoàng Thảo Tiểu hoàng lạp
D. chrysotoxum
Kontum
D5
Hoàng Thảo Trầm tím
D.parishii

QuảngTrị
D9
Hoàng Thảo Long tu Bắc
D. primulinum
Sơn La
D25
Hoàng Thảo Vảy rồng lá trung
D. lindleyi
Lâm Đồng
D10
Hoàng Thảo Trúc
D. hancockii
Ninh Bình
D26
Hoàng Thảo Thủy tiên mỡ gà
D. haveyanum
Lâm Đồng

D11
Hoàng Thảo Xoắn
D. tortile
Ninh Bình
D27
Hoàng Thảo Vani

D. aduncum
Kon Tum
D12
Hoàng Thảo
D. amabile

Lâm Đồng
D16
Hoàng Thảo Hoàng lạp Tây
Bắc
D. chrysotoxum

D32
Hoàng Thảo Đại bạch hạc
D. christyanum
Kontum
Ghi chú: D. Dendrobium 9
Lá mọc thành hai dãy so le nhau, không có cuống mà chỉ có bẹ ôm thân. Lá
phân bố suốt dọc thân nhưng ở nhiều đại diện lá tập trung 2-6 chiếc ở đỉnh thân cũng
có khi phần đỉnh thân chỉ có hoa mà không có lá. Lá thường tồn tại khi cây ra hoa.
Số lượng lá thay đổi từ rất nhiều (D15 trung bình 35,9 lá/cây; D23 trung bình 31,7
lá/cây) đến rất ít (D22 trung bình 6,46 lá/cây). Lá có thể cứng hoặc mềm, bề mặt
thường nhẵn. Đa số lá của lan Hoàng Thảo trong 32 mẫu giống nghiên cứu có lá
dạng hình lưỡi mác, mộit vàu lá hình bầu dục, đỉnh lá nhọn, nhọn lệch hoặc tù.
Nhóm hoa có thể có nhiều hoa, hoặc có ít hoa. Nhóm hoa dài thường rủ thõng
xuống, hoặc mọc so le (Hình 3.4). Các mẫu giống hoa lan Hoàng Thảo có sự khác
biệt rõ rệt với nhau về kích thước, số lượng, cách sắp xếp và màu sắc, hình dạng lá
đài, cánh hoa, cánh môi. Hoa thường không quá lớn, đường kính dao động trong
khoảng 1,35-5,8cm. Cánh môi của các mẫu giống nghiên cứu có nhiều màu sắc khác
nhau như màu vàng sẫm hay vàng nhạt, màu trắng có đốm vàng hoặc cam ở giữa,
hay màu trắng họng đen (D3) hoặc màu tím (D4), màu vàng họng đen (D1), màu tím
nhạt họng vàng vv Hình dạng cánh môi thường gặp là hình tròn, hình gần tròn
hình rô, hình phễu, hình tim, hình bầu dục, hình trứng hay hình cằm (D32). Từ các

D13, D14, D17, D19 và D26 ở mức độ tương đồng di truyền 68%. Nhóm phụ thứ
II.2 chia thành hai nhóm nhỏ hơn trong đó D7 và D17 vào một nhóm còn lại là 5
mẫu giống D12, D13, D14, D19, và D26 tạo thành một nhóm. Đây là các giống hoa
lan Hoàng Thảo Kiều của miền Bắc hay gọi là Thủy Tiên theo cách gọi của người
miền Nam. Các mẫu giống hoa trong nhóm này về đặc điểm hình thái như thân, lá,
hình dạng hoa khá giống nhau, chỉ khác nhau về màu hoa Nhóm này bao gồm các
loài mang đặc điểm là có hoa to, cánh môi thường phủ lông rậm, có u lồi. Tuy vậy
sự khác biệt lớn ở đây là thân có hình con suốt, lá tập trung ở đỉnh, cụm hoa thường
nhiều hoa (Clements, 2003; Dương Đức Huyến, 2007).
Nhóm III: Bao gồm 4 mẫu giống hoa lan Hoàng Thảo là D8, D28, D31và
D32. Trong số 4 mẫu giống này thì hai mẫu giống D31 và D32 rất dễ nhầm khi
chúng có đặc điểm hình thái như thân, lá, rễ, hoa tương đối giống nhau. Hai mẫu
giống này chỉ khác nhau về đặc điểm hình dạng cánh môi, mẫu giống D31 có hình
dạng hình mác, còn mẫu giống D32 có dạng hình cằm.
Nhóm IV: Bao gồm 3 mẫu giống hoa lan Hoàng Thảo là các mẫu giống D16,
D20 và D21. Trong số 3 mẫu giống này thì hai mẫu giống D20 và D21 được phân bố ở
hai tỉnh Đồng Nai và Lâm Đồng. Về mặt hình thái chúng có màu hoa giống nhau hơn
nữa hình thái như thân, lá, rễ cũng như nhau, chỉ khác nhau về kích thước lá.
I
II
III
IV
V

11
Nhóm V: gồm hai mẫu giống hoa lan Hoàng Thảo là Hoàng Thảo vảy rồng lá
nhỏ (D24) và Hoàng Thảo Vảy rồng lá trung (D25). Đây là hai mẫu giống phân bố ở
khắp ba miền Bắc, Trung và Nam có đặc điểm hình thái như nhau và chỉ khác nhau
về kích cỡ lá. Có thể nhận thấy rằng hai giống này là một loài và chỉ khác nhau ở
vùng phân bố nên khả năng sinh trưởng và phát triển của chúng có ít sai khác đặc

* 1

12

Hình 3.11. Ảnh điện di sản phẩm PCR-RAPD của 32 mẫu giống hoa lan Hoàng
Thảo với mồi OPN11; Giếng 1-32: Các mẫu giống hoa lan Hoàng Thảo bản địa
(D1-D32); M: 1kb ladder
3.1.2.3. Mối quan hệ di truyền giữa các mẫu giống hoa lan Hoàng Thảo
quan hệ
hệ số tương đồng di truyền và sơ đồ cây của 32 mẫu giống hoa lan Hoàng Thảo
3.13). Xét ở mức độ tương đồng di truyền 32%, 32
.

Hình 3.13.
dựa trên chỉ thị phân tử RAPD
:
34- 100%.
Nhóm phụ thứ nhất (I.1) gồm 6 mẫu giống bao gồm các giống D1 (Hoàng Thảo
Long Nhãn Lai Châu), D3 (Hoàng Thảo Thái Bình), D11 (Hoàng Thảo Xoắn), D15
(Hoàng Thảo Tam Đảo), D10 (Hoàng Thảo Trúc) và D30 (Hoàng Thảo Môi tơ) có hệ số
tương đồng di truyền từ 50-80%.
Nhóm phụ thứ 2 (I.2) bao gồm 5 mẫu giống là các giống D4, D5, D6, D7 và D17.
Trong nhóm này, 3 giống D4 (Hoàng Thảo Phi điệp tím), D5 (Hoàng Thảo Trầm tím) và
D6 (Hoàng Thảo Trầm trắng) có hệ số tương đồng di truyền là rất cao từ 80-100%.
(Hình 3.14). Trong 3 mẫu giống trên thì hai mẫu giống D5 và D6 có hệ số tương đồng là
100%. Đây là hai giống Hoàng Thảo trầm được thu thập ở hai vùng Sơn La và Điện

13
Biên có đặc điểm hình thái như thân, lá, kiểu hoa giống nhau nhưng khác về màu sắc
hoa. Kết quả này tương tự như tác giả Trần Hoàng Dũng và cs., 2012 khi nghiên cứu tập


14
3.1.3. Kết hợp chỉ thị hình thái và chỉ thị RAPD trong phân tích đa dạng di
truyền các giống hoa lan Hoàng Thảo
32 mẫu . Qua kết quả so sánh
giữa sơ đồ hình cây bằng chỉ thị hình thái và sơ đồ hình cây bằng chỉ thị RAPD cho
thấy 32 mẫu giống hoa lan Hoàng Thảo đều được chia làm 5 nhóm khác nhau. Các
mẫu giống hoa lan Hoàng Thảo có quan hệ gần nhau về mặt di truyền đều xếp chung
vào một nhóm. Trong số các mẫu giống đó có các mẫu giống có hệ số di truyền như
nhau như các mẫu giống D5 (Hoàng Thảo Trầm tím) và D6 (Hoàng Thảo Trầm
trắng); D24 (Hoàng Thảo Vảy rồng lá nhỏ) và D25 (Hoàng Thảo vảy rồng lá trung).
Bên cạnh đó các mẫu giống khác như D2 (Hoàng Thảo Chuỗi Ngọc Điện Biên) và
D18 (Hoàng Thảo Chuỗi Ngọc); hoặc các giống lan Hoàng Thảo Kiều có hệ số
tương đồng khá cao từ 65-80%.
Tóm lại, việc nghiên cứu, đánh giá và so sánh đa dạng di truyền của tập đoàn
giống Hoa lan Hoàng Thảo là công việc rất cần thiết nhằm tạo nên cơ sở dữ liệu cho
các phương pháp bảo tồn, phát triển sử dụng bền vững nguồn tài nguyên di truyền,
và đồng thời có ý nghĩa chiến lược trong chương trình cải thiện giống. Việc kết hợp
giữa phương pháp
. Tuy nhiên, việc
sử dụng chỉ thị RAPD trong việc phân loại loài/dưới loài còn nhiều hạn chế, chính vì
vậy để xác định giữa các loài, dưới loài cần phải kết hợp giải trình tự ADN lục lạp
như vùng ITS, hoặc giải trình tự gen matK, gen rbcL (Richardson và cs., 2001;
Sharma và cs, 2012, Liu và cs., 2014).
3.2. Kết quả nhận dạng các mẫu giống hoa lan Hoàng thảo dựa trên trình tự
vùng ITS
3.2.1. Kết quả khuếch đại vùng ITS bằng PCR
Với cặp mồi ITS1 và ITS4, chúng tôi đã khuếch đại thành công đoạn ITS bằng
PCR. Kết quả sản phẩm PCR thu được có chất lượng tốt với một băng rõ duy nhất
cho mỗi giống lan Hoàng Thảo trên gel agarose 1% sau khi điện di (Hình 3.17). Các

* Kết quả so sánh trình tự mẫu D2 (Hoàng Thảo Chuỗi Ngọc Điện Biên) và D18
(Hoàng Thảo Chuỗi Ngọc)
Qua kết quả phân tích sắp cột thẳng hàng (alignments) trình tự ITS của mẫu
D2, D18 của Việt Nam và hai mẫu D. findlayanum |KF143462.1|, |HQ114257.1| của
thế giới cho thấy ở bảng thống kê số nucleotid của 4 trình tự ITS của loài
D.findlayanum có sự giao động số nucleotid của các trình tự từ 688- 694 nucleotid
Với kết quả so sánh trình tự các mẫu D.findlayanum cho thấy trình hai mẫu D2 và
D18 có khoang 19 sự khác biệt. Khi so sánh hai mẫu D2 và D18 với hai mẫu tham
chiếu D.findlayanum thì mẫu D2 và D18 có khoảng 8 sự khác biệt trình tự so với hai
mẫu D. findlayanum của thế giới (Hình 3.19). Kết quả này cho thấy các mẫu lan
Hoàng Thảo D2 và D18 của Việt Nam không có sự khác biệt mấy so với các mẫu
D.findlayanum của thế giới.

16

Hình 3.19. Kết quả phân tích sắp cột thẳng hàng (alignments) trình tự vùng
ITS của mẫu giống D2, D18 và hai mẫu giống D.findlayanum |KF143462.1|,
|HQ114257.1|
Tương tự như vậy các mẫu lan Hoàng Thảo khác cũng được phân tích sắp cột
thẳng hàng (alignments) với các mẫu lan Hoàng Thảo của thế giới để xác định sự sai
khác về trình tự cũng như nhận dạng loài/dưới loài dựa trên trình tự vùng ITS. Tuy
nhiên việc so sánh với cơ sở dữ liệu trên GenBank nhằm mục đích cho một kết quả
so sánh với nhóm loài tương đồng nhất với trình tự tham chiếu. Kết quả BLAST
không thể kết luận chính xác về loài. Với những trường hợp BLAST có độ bao phủ
và tương đồng cao (99%) cũng không thể suy ngược lại tên loài. Bởi kết quả
BLAST chỉ hiển thị trình tự tương đồng nhất mà trên GenBank hiện có. Do vậy, để
có thể xác định đúng tên loài cần phải thực hiện thêm nhiều các phân tích khác như
so sánh với dữ liệu hình thái và xác định mối liên hệ qua cây phát sinh loài dựa trên
trình tự vùng ITS. Chính vì vậy, chúng tôi quyết định tiến hành xây dựng cây phát
sinh chủng loài Dendrobium để xác định chính xác tên của các mẫu vật trong nghiên

nằm cùng chung nhóm với 4 trình tự là HM590384.1, HQ114247.1, HQ114248.1 và
KF143430.1 trùng khớp với nhau đến 100%. Vậy kết luận rằng mẫu D23 thu thập
chính xác và là lan Hoàng Thảo Hạc vĩ (D. aphylum).
Nhóm thứ IV: bao gồm 2 giống D11 và D28 nằm chung một nhóm với 6
trình tự so sánh. Trong nhóm này, mẫu D11 (D.tortile) phân chia nằm chung với 4
trình tự khác là EU4775071(D.nobile), EU477507.1(D.fiedricksianum),
,KF143518.1(D.sp.Jin XHs.n.9) và EU477511.1 (D.tortile) với chỉ số bootstrap lên
tới 98%. Xét về hình thái, D11 khác hoàn toàn về hình thái như thân, lá, hoa so với
mẫu EU477507.1 (D. fiedricksianum), KF143518.1(D. sp.Jin XHs.n.9). Ngay từ kết
quả so sánh trên Balst, những mẫu này cũng nằm lộn xộn không tập trung. Chính vì
vậy mà không thể nhận dạng được mẫu giống D11 có đúng là D.tortile hay không.
Tuy nhiên, mẫu giống D28 nằm chung cùng với hai trình tự thuộc D.nobile là
KC205193.1 và JN38579.1 với chỉ số bootstrap là 85%. Do vậy mẫu giống D28
được nhận dạng chính xác là D. nobile.
Nhóm V: gồm các mẫu giống D27, D2 và D18 chia thành 2 nhóm phụ:
- Nhóm phụ thứ 1 bao gồm mẫu D27 (D.aduncum) chia thành một nhóm nằm
chung với 3 trình tự khác thuộc loài D.aduncum gồm các trình tự JF713083.1,
KF143428.1 và JN388580.1 với chỉ số bootstrap trong nhóm là 99%. Đặc điểm về
hình thái, mẫu D27 giống với 3 mẫu còn loại thuộc loài D.aduncum nên có thể
khẳng định chính xác đây là loài D.aduncum.
Nhóm phụ thứ 2 gồm 2 mẫu D2 và D18, đây là hai mẫu Long tu (D.
findlayamum) được thu thập từ hai miền khác nhau. Xét về hình thái chúng giống
nhau y hệt về thân, lá, hoa chỉ khác ở chỗ Long tu Bắc (D2) ở giữa môi hoa không
có đốm. Khi so sánh trình tự của chúng thì chúng có chỉ số bootstrap là 100% so với
trình tự của 3 mẫu KF143246.1, HQ114257.1 và JN388589.1 đều thuộc loài
D.findlayamum nên khẳng định hai mẫu D2 và D18 thuộc loài D. findlayamum.


0.02
D. parishii voucher NCHU-D89331201-1012|HM590378.1|
D. parishii|AB593630.1|
D. parishii voucher SBB-0528 |HM054736.1|
D. parishii voucher SBB-0527 HM054735.1|
D. anosmum |EU477499.1|
D. parishi - D6
D.parishi.var alba - D5
D. anosmum - D4
D. anosmum isolate D4 |JN388570.1|
D. primulinum voucher Jin X-H 10793 |KF143499.1|
D. primulinum |AB593641.1|
D. primulinum TBG 118293|AB593521.1|
D. primulinum -D9
D. primulinum - D29
D. aphyllum voucher NCHU-D89331201-1018 HM590384.1|
D. aphyllum voucher PS2523MT01 |HQ114247.1|
D. aphyllum voucher PS2523MT02 |HQ114248.1|

D. brymerianum |EU477500.1|
D. pulchellum voucher Jin X-H 11878 |KF143503.1|
D. moschatum -D3
D. moschatum voucher Jin X-H 11886 |KF143492.1|
D. daoense - D15
D. fimbriatum isolate D22 |JN388588.1|
D. fimbriatum - D1
D. fimbriatum voucher PS2507MT01 |HQ114229.1|
D. fimbriatum voucher Jin X-H s.n. 16 (KF143461.1)
D. chrysotoxum - D20
D. chrysotoxum - D21
D. chrysotoxum |EU477501.1|
D. capillipes voucher NCHU-D89331201 |HM590379.1|
D. chrysotoxum voucher PS2501MT03 |HQ114223.1|
D. chrysotoxum -D16
D. chrysotoxum voucher PS2501MT01 |HQ114221.1|
D. chrysotoxum isolate D19 |JN388585.1|
D. hancockii voucher Jin X-H 13492 |KF143467.1|
D. hancockii isolate D25 |JN388591.1|
D. hancockii voucher PS2533MT01 |HQ114259.1|
D. hancockii |AB593575.1|
D. hancockii - D10
D. capillipes - D17
D. capillipes |AF362035.1|
D. capillipes voucher Jin X-H 10757 |KF143433.1|
D. capillipes voucher PS2502MT01 |HQ114224.1|
D. capillipes |JN388582.1|
D. amabile - D12
D. thyrsiflorum - D13
D. farmeri -D14

100
86
100
95
74
99
97
75
100
100
99
75
62
96
98
59
85
77
100
99
100

88
100
100
77
76
73
74
99

nằm chung với 6 trình tự của loài D.chrysanthum đối chứng. Trong hai mẫu này, D8
trùng khớp 100% với 2 mẫu D.chrysanthum khác là JN388584.1 và FJ384738.1.
Còn mẫu D8 tuy nằm cùng nhóm nhưng khoảng cách di truyền khá xa so với D7 và
các mẫu còn lại. Tuy nhiên, trình ITS của chúng đều thuộc loài D.chrysanthum. Vì
vậy kết luận rằng hai mẫu D7 và D8 thuộc loài D.chrysanthum.
Nhóm thứ VII: gồm trình tự của mẫu D30 (Hoàng Thảo Môi tơ -
D.brymerianum) nằm chung với trình tự của các mẫu gồm 4 mẫu thuộc loài
D.brymerianum: KF143432.1, HQ114233.1, JN388581.1 và EU477500.1 với chỉ số
bootstrap là 80%. Mẫu D30 của Việt Nam tuy nằm chung một nhóm với 4 mẫu còn
lại nhưng khoảng cách di truyền khá lớn với các mẫu của thế giới.
Nhóm thứ VIII gồm trình tự mẫu D3 (Hoàng Thảo Thái Bình -
D.moschatum) được xác định chính xác thuộc loài D. moschatum (KF143492.1) với
chỉ số bootstrap là 100%. Tuy nhiên trong nhóm này còn có 1 mẫu là D.puchellum
(KF1435031.1) cùng với tỷ lệ giống D.moschatum (KF143492.1). Xét về hình thái
chúng giống hệt nhau về thân, lá, hoa. Tuy nhiên mẫu (KF1435031.1) lại được xác
định là D.puchellum. Điều này có thể giải thích rằng có sự sai xót khi xác định tên
latinh của mẫu (KF1435031.1). Xét về hình thái, mẫu D3 được nhận dạng là
D.moschatum, qua đó khẳng định rằng mẫu D3 đúng là D.moschatum sau khi giải
trình tự vùng ITS.
Nhóm IX gồm trình tự 2 mẫu D1 (HT Long nhãn Điện Biên) và D15 (Hoàng
Thảo Tam Đảo) và 3 trình tự mẫu của thế giới thuộc loài (D. fimbriatum). Trong
nhóm này, mẫu D1 (D. fimbriatum) và D15 (D.daoense) có chỉ số bootstrap từ 86-
100 % với 3 mẫu thuộc loài D. fimbriatum là các mẫu HQ114229.1, JN388588.1,
KF143461.1. Tuy nhiên mẫu D15 tuy có chỉ số bootstrap như vậy nhưng về nhận
dạng qua hình thái dịnh danh tên lại là D.daoense. Chính vì vậy mà có thể khẳng
định rằng mẫu D15 qua quá trình thu thập mẫu bị lẫn tạp, mẫu D15 phải là loài D.
fimbriatum chứ không phải D.daoense.
Nhóm X gồm trình tự 3 mẫu giống của Việt Nam là D16, D20, D21 và 5 mẫu
trình tự của thế giới trong đó 4 mẫu đều thuộc loài Dendrobum chynsotoxum là các
mẫu HQ114221.1, JN388585.1, HQ114223.1, EU477501.1 và 1 mẫu thuộc loài

khi đó D14, D19 và D26 nằm cùng chung một nhánh với mẫu KC205200.1 với chỉ
số bootstrap là 100%. Xét về hình thái, các mẫu lan Hoàng Thảo Kiều như D12,
D13, D14, D19 và Hoàng Thảo Thủy Tiên mỡ gà (D26) rất giống nhau về hình thái
như thân, lá, chúng chỉ khác nhau về màu sắc hoa và vùng phân bố. Tuy nhiên nhìn
vào cây phát sinh loài cho thấy, các mẫu thu thập có chỉ số bootstrap rất cao từ 96-
100% trong khi đó nhận dạng hình thái tên la tinh là khác nhau. Vậy có thể kết luận
rằng, các mẫu này khi thu thập chưa có độ chính xác về nhận dạng hình thái hoặc
chúng có quan hệ di truyền cực gần nên sử dụng ITS vẫn chưa đủ xác định được
chính xác loài của chúng. Chỉ duy nhất có thể xác định được D13 (Hoàng Thảo Kiều
vàng) là được nhận dạng là loài D.thyrsiflorum.
Nhóm thứ XIV bao gồm 2 trình tự 2 mẫu giống D24 và D25 (đều thuộc loài
D.lindleyi) và 4 mẫu trình tự thu thập là KF143479.1, JN388595.1, KF143478.1 và
HQ114251.1 với chỉ số bootstrap khá cao là từ 94-100% trong đó 2 mẫu của Trung
Quốc là KF143479.1, KF143478.1 và 2 mẫu của nước khác thuộc loài thuộc loài
D.jenkinsii. Mẫu D24 và D25 được nhận dạng tên là Hoàng Thảo vảy rồng lá nhỏ và
HT vảy rồng lá trung. Xét về hình thái, 2 mẫu này rất dễ nhận nhầm với Hoàng Thảo
Vảy cá hoặc Hoàng Thảo Vảy rắn (D.jenkinsii). Lan Hoàng Thảo Vảy rồng rất
thường bị nhầm lẫn với Vảy rắn hay Vảy cá, khi so sánh thân và cành hoa, thân
Hoàng Thảo vảy rồng lớn hơn Vảy Rắn, hoa của Vảy rồng thành cuống dài 5 - 15
bông và Vảy Rắn thì 1 cành ít bông hơn. Chính vì vậy, qua kết quả giải trình tự
vùng ITS và so sánh trên cây phát sinh loài cho thấy, hai mẫu giống Hoàng Thảo
Vảy rồng lá nhỏ (D24) và Hoàng Thảo Vảy rồng lá trung (D25) chính là loài HT
Vảy rắn hay còn gọi là Hoàng Thảo Vảy cá (D.jenkinsii) chứ không phải là Hoàng

21
Thảo Vảy rồng (D.lindleyi).
Nhóm thứ XV bao gồm trình tự của Hoàng Thảo Nhất điểm hồng (D.
draconis Rchb.f - D31) và trình tự của và 3 mẫu trình tự HM054628.1, EU477503.1,
và JF713101.1 với chỉ số boostrap là 100%. Chứng tỏ mẫu D31 thu thập là chính
xác và thuộc loài D.draconis.

hàng gen Bank chưa có đủ thông tin với các mẫu giống này do tên latinh và vùng
ITS không giống nhau.

22
Bảng 3.14. Các mẫu giống hoa lan Hoàng Thảo đƣợc nhận dạng bằng trình tự vùng ITS
Ký
hiệu
Tên tiếng Việt
Nhận dạng dựa
trên hình thái
Nhận dạng theo
trình tự ITS
Ký
hiệu
Tên tiếng Việt
Nhận dạng dựa trên
hình thái
Nhận dạng theo
trình tự ITS
D1
HT Long nhãn Lai
Châu
D. fimbriatum
D. fimbriatum
D17
HT Kim Điệp
D. capillipes
D. capillipes
D2
HT chuỗi ngọc Điện

HT Đại hoàng lạp
D. chrysotoxum
D. chrysotoxum
D6
HT trầm trắng
D.parishi .var
alba
D.anosmum.var alba
D22
HT bạch hạc
langbiang
D. wattii
D. wattii
D7
HT Ngọc Vạn Vàng
D. chrysanthum
D. chrysanthum
D23
HT Hạc vĩ
D. aphylum
D. aphylum
D8
HT Phi điệp vàng
D. chrysanthum
D. chrysanthum
D24
HT Vảy rồng lá
nhỏ
D. lindleyi
D. jenkinsii

D28
Hoàng Thảo Đùi
gà
D. nobile
D. nobile
D13
HT Kiều vàng
D. thyrsiflorum
D. thyrsiflorum
D29
Long tu đá
D. primulinum
D. primulinum
D14
HT Kiều trắng
D. farmeri
Chưa xác định được
D30
HT Môi tơ
D.brymerianum
D.brymerianum
D15
HT Tam Đảo
D. daoense
D. fimbriatum
D31
Nhất Điểm Hồng
D. draconis Rchb.f
D. draconis Rchb.f
D16

như các mẫu giống D5 (Hoàng Thảo Trầm tím) và D6 (Hoàng Thảo Trầm trắng); D2
(Hoàng Thảo chuỗi ngọc Điện Biên và D18 (Hoàng Thảo chuỗi ngọc).
2. Kết quả phân tích đa dạng di truyền của 32 mẫu giống hoa lan Hoàng Thảo bằng
chỉ thị phân tử RAPD cho thấy hệ số tương đồng di truyền của các giống lan Hoàng
Thảo nghiên cứu dao động trong khoảng từ 23 - 100%. Một số mẫu giống hoa như:
D5 (Hoàng Thảo Trầm tím) và D6 (Hoàng Thảo Trầm trắng); D24 (Hoàng Thảo
Vảy rồng lá nhỏ) và D25 (HT Vảy rồng lá trung) có hệ số tương đồng di truyền cao
nhất là 100%.
3. Qua so sánh kết quả đánh giá đa dạng di truyền bằng đặc điểm hình thái và chỉ thị
phân tử RAPD cho thấy 32 mẫu giống hoa lan Hoàng Thảo đều được chia làm 5
nhóm khác nhau. Các mẫu giống hoa lan Hoàng Thảo có quan hệ gần nhau về mặt di
truyền đều xếp chung vào một nhóm. Trong số các mẫu giống đó có các mẫu giống
có hệ số di truyền như nhau như các mẫu giống D5 (Hoàng Thảo Trầm tím) và D6
(Hoàng Thảo Trầm trắng); D24 (Hoàng Thảo Vảy rồng lá nhỏ) và D25 (Hoàng Thảo
vảy rồng lá trung).
4. Dựa trên chỉ thị phân tử RAPD, một số cặp mồi như OPN7, OPN20, OPN16,
OPN11 nhận dạng được một số mẫu giống hoa lan Hoàng Thảo như: mẫu giống D9
(Hoàng Thảo Long tu Bắc với mồi OPN16, OPN20; Hoàng Thảo Chuỗi ngọc Điện
Biên (D2) ở mồi OPN7, OPN20.
5. Dựa trên kết quả giải trình tự vùng ITS, qua so sánh trình tự các mẫu giống hoa
lan Hoàng Thảo của Việt Nam và thế giới, đã xác định chính xác được 23/32 mẫu
giống hoa lan Hoàng Thảo. Trong 9 mẫu giống còn lại thì 4 mẫu giống được hiệu